अलगाव, पहचान, और murine Thymic उपकला कोशिकाओं के शोधन

Immunology and Infection

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Summary

यहाँ हम अलगाव, पहचान, और माउस Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) की शुद्धि के लिए एक कुशल विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल सामान्य टी सेल विकास, थाइमस रोग, और टी सेल पुनर्गठन के लिए थाइमस समारोह के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है.

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Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

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Abstract

थाइमस टी लिम्फोसाइट विकास के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है. टी सेल प्रतिबद्धता, सकारात्मक चयन और नकारात्मक चयन: Thymic stromal कोशिकाओं की, Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) टी सेल विकास के कई चरणों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, थाइमस में Tecs का कार्य अधूरे समझा रहता है. लेख में, हम यांत्रिक विघटन और enzymatic पाचन के संयोजन का उपयोग ताजा माउस थाइमस से टीईसी सबसेट अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. विधि Thymic stromal कोशिकाओं और thymocytes कुशलतापूर्वक सेल सेल और सेल बाह्य मैट्रिक्स कनेक्शन से जारी होने की और एक एकल कक्ष निलंबन के लिए फार्म की अनुमति देता है. अलग कक्षों का प्रयोग, Multiparameter फ्लो Tecs और वृक्ष के समान कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया जा सकता है. Tecs थाइमस में एक दुर्लभ सेल आबादी होते हैं, क्योंकि हम भी समृद्ध और thymocytes, थाइमस में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार घट द्वारा Tecs शुद्ध करने के लिए एक प्रभावी तरीका वर्णन. Folloसेल व्यवहार्यता की कि नुकसान Tecs की शुद्धि के दौरान कम से कम किया जा सकता है ताकि विंग संवर्धन, सेल छँटाई समय कम किया जा सकता है. शुद्ध कोशिकाओं रीयल टाइम पीसीआर, पश्चिमी धब्बा और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा की तरह विभिन्न बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. प्रोटोकॉल टीईसी समारोह के अनुसंधान और साथ ही साथ इन विट्रो टी सेल पुनर्गठन के विकास को बढ़ावा देंगे.

Introduction

प्रारंभिक टी सेल के विकास में, अस्थि मज्जा hematopoietic स्टेम सेल व्युत्पन्न multipotent progenitors थाइमस के प्रांतस्था के लिए भर्ती कर रहे हैं, टी वंश के प्रति प्रतिबद्धता से गुजरना और टी सेल व्यापारियों 1 बन जाते हैं. अत्यधिक चर टी सेल रिसेप्टर्स 1 के साथ progenitors के एक बड़े पूल बनाने, प्रांतस्था में, टी सेल अग्रदूत सीडी 4 और सीडी 8 डबल नकारात्मक (डी.एन.) thymocytes विस्तार और अपरिपक्व सीडी 4 और सीडी 8 डबल सकारात्मक (डीपी) thymocytes में अंतर. केवल डीपी कोशिकाओं की एक का चयन MHC-प्रतिबंधित सबसेट, सीडी 4 या सीडी 8 एकल सकारात्मक (सपा) thymocytes बन थाइमस के मज्जा की ओर पलायन, और, कार्यात्मक सक्षम परिपक्व टी कोशिकाओं में सकारात्मक रूप में चयन 2 में निर्दिष्ट है कि एक घटना अलग होगा 6. इसके विपरीत, ऑटो प्रतिक्रियाशील thymocytes के क्लोन नकारात्मक चयन से गुजरना और स्वयं सहिष्णुता के लिए विनियामक टी कोशिकाओं में परिवर्तित, या अभी तक स्पष्ट नहीं हैं कि प्रयोजनों के लिए अंतःउपकला लिम्फोसाइटों के लिए भेज दिया, apoptosis के माध्यम से हटा रहे हैं 3,7-10.

थाइमस में, Thymic stromal कोशिकाओं इन विभिन्न टी सेल विकास भाग्य 5,11,12 के लिए संकेत उपलब्ध कराने के एक अद्वितीय microenvironment रूप में. कॉर्टिकल Tecs (cTECs) और दिमाग़ी Tecs (mTECs), वृक्ष के समान कोशिकाओं, मैक्रोफेज, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, तंत्रिका शिखा व्युत्पन्न pericytes और अन्य mesenchymal कोशिकाओं 13-15 सहित - Thymic stromal कोशिकाओं Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) से बना रहे हैं. इन के अलावा, Tecs टी सेल विकास 1,2,16,17 के विभिन्न चरणों में महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, Tecs अलग करने के लिए एक मजबूत तरीका की कमी के कारण उनके कार्यों 16 की एक व्यापक समझ बाधा उत्पन्न की है. विशेष रूप से, प्रांतस्था में progenitors आसपास के एक तीन आयामी नेटवर्क के रूप में जो cTECs,, अभी तक स्पष्ट नहीं हैं कि कारणों के लिए सकारात्मक चयन 13,18,19 के लिए आवश्यक हैं. इससे पहले के अध्ययनों से ज्यादातर रूपात्मक और ऊतकीय उपकरण 13 पर भरोसा, Tecs की विविधता और भूमिका के रूप में सुराग प्रदान की 12,20 में आनुवंशिक दृष्टिकोण से संबोधित कर रहे थे. Tecs अलग करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ता cTECs सकारात्मक चयन का समर्थन कैसे टीईसी कैंपेन्स, टीईसी कार्यों की मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन, और तंत्र के स्पष्टीकरण की निष्पक्ष लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए मौलिक है.

कारण वे बरकरार अंग में फार्म थाइमस में Tecs की दुर्लभता और तंग बातचीत करने के लिए, Tecs के अलगाव चुनौतीपूर्ण हो गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पिछले खोजों, वर्तमान में उपलब्ध अभिकर्मकों, तकनीक, और थाइमस संरचना और stromal रचना के ज्ञान पर आधारित है. लगभग दो दशक पहले, कई प्रक्रियाओं trypsin, Collagenase और Dispase सहित विभिन्न एंजाइमों पाचन के दौरान इस्तेमाल किया गया, जिसमें थाइमस ऊतकों 21-27, disaggregate को सूचित किया गया है. ग्रे एट अल. उनके precedure 28 में उन एंजाइमों की तुलना में, और एक बेहतर meth सूचना दीबन गया है कि एंजाइम कॉकटेल 29 की एक कई कदम पाचन के साथ आयुध डिपो व्यापक रूप से 20,30 इस्तेमाल किया. हालांकि, इस पद्धति एक लंबी तैयारी के समय और भी एक ही murine पलटन 29,30 में सेल नंबर और Tecs के अनुपात चर फाइनल में जटिल पाचन कदम और परिणाम शामिल है. कई साल पहले, Liberase अनुसंधान ग्रेड एंजाइम, अत्यधिक Collagenase शुद्ध और तटस्थ प्रोटीज थाइमस ऊतक हदबंदी 30 में इस्तेमाल किया जा करने के लिए शुरू कर दिया युक्त. यहाँ, हम माउस थाइमस ऊतकों से व्यवहार्य Tecs की एक उच्च संख्या कि पैदावार अनुकूलित यांत्रिक जुदाई प्रक्रियाओं के साथ एक Liberase पाचन आधारित प्रोटोकॉल, का वर्णन. .

अलग stromal कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए, पिछले अध्ययनों घनत्व ढ़ाल या चुंबकीय मनका जुदाई 21,29 या तो इस्तेमाल किया है. हालांकि, दोनों तरीकों Thymic stromal कोशिकाओं, cTECs 29 की विशेष रूप से जनसंख्या की कुछ आबादी के खो गंभीर कारण. साइटोटोक्सिक उन्मूलन और panning तकनीक 12,31 में कमी या लिम्फोसाइटों के विभाजन के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तकनीकों की तुलना करने के बाद, हम Tecs के संवर्धन के लिए वर्तमान पैनिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की. संवर्धन प्रक्रिया के दौरान कोमल हालत कम कोशिका मृत्यु और निष्पक्ष और बढ़ टीईसी वसूली की ओर जाता है.

धारा 3 में वर्णित पृथक थाइमस सेल निलंबन सीधे टीईसी कैंपेन्स और वृक्ष के समान कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए cytometric विश्लेषण प्रवाह करने के लिए लागू किया जा सकता है. धारा 4 कोशिकामापी Multiparameter प्रवाह का उपयोग टीईसी सबसेट की पहचान करने के लिए एक सरल और उपयोगी तरीका वर्णन करता है. शुद्ध cTECs या mTECs, टीईसी संवर्धन और प्रक्रियाओं छँटाई सेल प्राप्त करने की तलाश है कि प्रयोगों के लिए धारा 5 और 6 में पाया जा सकता है.

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Protocol

इस अध्ययन में, वयस्क (6 - 8 सप्ताह) महिला C57BL / 6 चूहों का इस्तेमाल किया गया. चूहे राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से खरीदा और विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में बनाए रखा गया. मिनेसोटा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC) सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी.

उपकरण और बफ़र की 1. तैयारी

  1. एंजाइम समाधान तैयार, एल्बुमिन युक्त बफर (1X पीबीएस [सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + मुक्त] के साथ 0.5% गोजातीय सीरम (0.05% के साथ RPMI1640 मध्यम Liberase वें और DNase मैं के 100 यू / एमएल की [/ वी डब्ल्यू]) एल्बुमिन और 2 मिमी Ethylenediamine Tetraacetic एसिड [EDTA]), FACS बफर (1X पीबीएस [सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + मुक्त] युक्त 1% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS] और 0.02% NaN 3), बफर छँटाई FACS (1X पीबीएस [सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + मुक्त] 2% FBS), और RP10 मध्यम युक्त (RPMI 1640 मध्यम) 10% FBS के साथ आपूर्ति की.
  2. 10 panning प्लेटें तैयार करें. (0.01 मिलीग्राम / एमएल जी 40 मिलीलीटर कोटिंग समाधान तैयारजई 0.1 एम 3 NaHCO बफर में विरोधी चूहा आईजीजी), और प्रत्येक 100 x 15 मिमी प्लेट, भंवर में कोटिंग समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ने और 4 डिग्री कंपनी / एन पर सेते हैं. एंटीबॉडी समाधान डालो और 2 बार के लिए 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर का उपयोग थाली कुल्ला, rinses के बीच सख्ती ज़ुल्फ़. 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार प्लेटें स्टोर.

थाइमस ऊतक के 2 हार्वेस्ट

  1. एक सीओ 2 चैम्बर में माउस euthanize. एक विच्छेदन चटाई पर अपनी पीठ पर पशु रखो चटाई पर पैर पिन और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा फर गीला.
  2. सीधे कैंची से निचले जबड़े को मूत्रमार्ग ऊपर से शुरू, त्वचा के माध्यम से एक midline चीरा और दोनों पक्षों पर घुटनों के नीचे चीरा हूं. चीरा "वाई" नीचे एक ऊपर की तरह लग रहा है. पक्षों पर ढीली त्वचा वापस खींचो, और विच्छेदन चटाई को पिन.
  3. , असिरूप से डायाफ्राम पंचर हंसली के बारे में, तो पसलियों के साथ लिफ्ट करने के लिए ऊपर हर तरफ पसलियों में कटौतीसंदंश विच्छेदन चटाई में पिन और. थाइमस बस पसलियों के नीचे है, और दिल (चित्रा 1) overlying दो पतली सफेद पालियों की तरह लग रहा है. डिस्कनेक्ट संयोजी ऊतक धीरे खींच और घुमावदार दाँतेदार संदंश के साथ थाइमस पालियों की जोड़ी को हटाने, थाइमस आसपास के. 5 मिलीलीटर RPMI-1640 युक्त एक 6 अच्छी तरह से थाली में जगह थाइमस पालियों.

Thymic stromal कोशिकाओं के 3 तैयारी

  1. किसी भी आसपास वसा और संयोजी ऊतक ट्रिम और 5 मिलीलीटर हौसले एंजाइम समाधान तैयार युक्त 6 अच्छी तरह से थाली का एक नया अच्छी तरह से करने के लिए थाइमस पालियों हस्तांतरण. ठीक कैंची के साथ थाइमस पालियों में छोटे चीरों बनाओ, और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  2. ऊतक हदबंदी के लिए 5 मिलीलीटर विंदुक का उपयोग 3 बार - धीरे थाइमस ऊतक ऊपर और नीचे 2 पचाने पिपेट. 10 मिलीलीटर एंजाइमों को बेअसर करने के लिए ठंड एल्बुमिन युक्त बफर युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला अंश लीजिए. बर्फ पर संग्रह ट्यूब रखें. 2.5 जोड़ेंमिलीलीटर एंजाइम शेष ऊतक का हल और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  3. समुच्चय को तोड़ने के लिए एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और 18 जी सुई के साथ कोमल यांत्रिक आंदोलन प्रदर्शन करते हैं. संग्रह ट्यूब में पूल सतह पर तैरनेवाला. शेष ऊतक को 2.5 मिलीलीटर एंजाइम समाधान जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  4. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और एक 25 जी सुई के साथ कोमल यांत्रिक आंदोलन को दोहराएँ, और थाली अतिरिक्त 5 सेते - 10 मिनट.
  5. पूरा पाचन के बाद, संग्रह ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पूल. अपकेंद्रित्र 400 XG, 8 मिनट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह ट्यूब. महाप्राण तरल और 10 मिलीलीटर एल्बुमिन युक्त बफर में pelleted कोशिकाओं को निलंबित और 100 मिमी जाल के माध्यम से नमूना फिल्टर. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना. फिर प्रवाह cytometic विश्लेषण (धारा 4) या Tecs संवर्धन (धारा 5) प्रदर्शन करते हैं.

फ्लो द्वारा Tecs के 4 पहचान

  • एक साथ 96 दौर नीचे परीक्षण थाली में धुंधला के लिए FACS बफर में 100 μl प्रति 4 x 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को तैयार है और बर्फ पर थाली रखने के लिए. कोशिकाओं के लिए (10 माइक्रोग्राम FACS बफर में / एमएल विरोधी CD16 / CD32 एंटीबॉडी) 20 μl एफसी ब्लॉक समाधान जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. 400 XG, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्पिन. एक सिंक में नीचे प्लेट अंकित flicking द्वारा कुओं से तरल त्यागें.
  • Pelleted कोशिकाओं 100 μl एंटीबॉडी कॉकटेल में (विरोधी CD45, -EpCAM, -MHC वर्ग द्वितीय, और -Ly51 एंटीबॉडी, और निर्माता पर अलग fluorochromes के साथ लेबल UEA -1 लेक्टिन सिफारिश या FACS बफर में प्रत्येक एंटीबॉडी के इष्टतम सांद्रता का परीक्षण स्थगित ), और अंधेरे में 20 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं सेते हैं. मुआवजे के लिए, प्रत्येक व्यक्ति fluorochrome साथ 1 x 10 6 कोशिकाओं दाग.
  • अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए FACS बफर के 100 μl जोड़ें और 400 XG, 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्पिन. धोने कदम एक दोहराएँसमय, और फिर 100 μl FACS बफर में कोशिकाओं resuspend. 300 μl FACS बफर से भरा एक 12 x 15 मिमी दौर नीचे FACS ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. प्रवाह पर नमूने मोल और FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. टीईसी gating रणनीति चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  • Panning द्वारा Tecs की 5 संवर्धन

    1. 400 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर (धारा 3 में तैयार) थाइमस कोशिकाओं स्पिन. महाप्राण तरल और एक 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मिलीलीटर प्रति 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में FACS छँटाई बफर में pelleted कोशिकाओं को निलंबित. सेल निलंबन की 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में विरोधी CD90.2 एंटीबॉडी (क्लोन 30-H12) (या विरोधी CD45) जोड़ें और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन मिक्सर पर धीरे कोशिकाओं सेते हैं. ऊष्मायन के बाद, एक 5 से धो - RP10 माध्यम के 10x मात्रा और 400 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
    2. महाप्राण तरल और में pelleted कोशिकाओं resuspendमिलीलीटर प्रति 1 10 x 7 के एक एकाग्रता में RP10 मध्यम. प्रत्येक लेपित पैनिंग (1.3 चरण में तैयार) थाली, चक्कर आने के लिए 5 मिलीलीटर सेल निलंबन जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. सख्ती भंवर; एक शंक्वाकार ट्यूब में supernatants हस्तांतरण. थाली RP10 माध्यम का उपयोग कर दो बार कुल्ला और संग्रह ट्यूब में supernatants पूल.
    3. 400 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह ट्यूब अपकेंद्रित्र. महाप्राण तरल और 5 मिलीलीटर RP10 माध्यम में pelleted कोशिकाओं resuspend. एक नए पैनिंग प्लेट सेल निलंबन जोड़ें चक्कर आने और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. कोशिकाओं थाली कुल्ला और एक शंक्वाकार ट्यूब में उन्हें पूल लीजिए. Tecs समृद्ध कर रहे हैं एक बार, बफर छँटाई 5 मिलीलीटर FACS में कोशिकाओं 400 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और निलंबित.

    सेल छँटाई द्वारा Tecs की 6 शोधन

    1. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और FACS छँटाई बफर में 4 एक्स 10 7 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में सेल निलंबन तैयार करते हैं. एंटीबॉडी डेस जोड़ेंसेल समाधान में धारा 4.4 में cribed और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन मिक्सर पर धीरे कोशिकाओं सेते हैं. धुंधला के बाद, धोने और FACS छँटाई बफर के मिलीलीटर प्रति 10 x 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को निलंबित.
    2. क्रमबद्ध एक 100 माइक्रोन नोजल के माध्यम से टीईसी कैंपेन्स प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग. छाँटे सेल RPMI 1640 में (v / v) FBS) के 30% में एकत्र कर रहे हैं. सेल छँटाई 400 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं किया और नीचे की ओर विश्लेषण के लिए तैयार हो जाने के बाद.

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    Representative Results

    प्राप्त सेल निलंबन thymocytes, hematopoietic व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं और गैर hematopoietic stromal कोशिकाओं के शामिल धारा 3 में उल्लिखित के रूप में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक थाइमस अंग एक वयस्क माउस (खंड 2) और एक Thymic सेल निलंबन से हटा दिया गया था तैयार किया गया था. CD45 एक hematopoietic अखिल मार्कर thymocytes और ऐसे मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं के रूप में hematopoietic stromal कोशिकाओं दोनों पर व्यक्त की है. इसके विपरीत, Tecs hematopoietic मूल के नहीं हैं और CD45 15 व्यक्त नहीं करते. धारा 4 में उल्लिखित के रूप में सेल धुंधला और प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन किया गया.

    टीईसी कैंपेन्स, cTECs और mTECs के दो प्रकार, एक आम द्वि शक्तिशाली टीईसी अग्रदूत 15 से उत्पन्न. दोनों cTECs और mTECs उनकी सतह पर 28 EpCAM अणु व्यक्त करते हैं. इस प्रकार Tecs EpCAM पॉजिटिव और CD45 नकारात्मक फ्लो द्वारा (2A चित्रा) के अनुसार gated जा सकता है. cTECs और mTECs दो अभिकर्मकों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है: Ly51CTEC द्वारा व्यक्त glutamyl Aminopeptidase पहचानता है कि एंटीबॉडी, और mTEC (चित्रा 2 बी) को बांधता है कि लेक्टिन Ulex Europaeus agglutinin -1 (UEA -1) 28. दोनों mTECs और cTECs MHC वर्ग उनकी सतह (चित्रा -2 और 2 डी) पर द्वितीय अणुओं व्यक्त करते हैं. mTECs आगे MHC द्वितीय अणुओं (चित्रा 2 डी) के स्तर पर निर्भर करता है mTEC कम और mTEC उच्च करने में वर्गीकृत किया जा सकता है. थाइमस प्रति टीईसी की औसत संख्या के बारे में 9 एक्स 10 5 है. प्रत्यक्ष तुलना में, हम collagenase साथ एक बहु कदम प्रोटोकॉल की तुलना में इस Liberase एंजाइम आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग लगभग 8 गुना अधिक Tecs बरामद / 29 (चित्रा 3) dispase.

    छँटाई समय कम होती है और बरामद stromal कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ाने के क्रम में, हम थाइमस सेल निलंबन 95% से अधिक thymocytes के होते हैं क्योंकि thymocytes ख़ाली एक panning विधि विकसित की है. कोशिकाओं को एक साथ incubated रहे थेतिवारी CD90 एंटीबॉडी और प्रीकोटेड प्लेटों से कब्जा कर लिया. पूरी तैयार थाइमस कोशिकाओं में कि (पूर्व समृद्ध) की तुलना में, Tecs के अनुपात के बाद समृद्ध कोशिकाओं में 15% से अधिक करने के लिए कम से कम 0.5% से बढ़कर (चित्रा -4 ए और 4 बी) था. विरोधी CD45 के साथ panning भी उदाहरण के लिए, एक के रूप में अच्छी तरह से वृक्ष के समान कोशिकाओं को ठीक करने की जरूरत नहीं है, अगर इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, के बारे में 80% करने के लिए टीईसी संवर्धन बढ़ जाती है (नहीं दिखाया डेटा). Panning द्वारा stromal सेल संवर्धन के बाद, टीईसी कैंपेन्स का अनुपात एक सबसेट या अन्य चुनिंदा panning के दौरान खो नहीं है, सुझाव है कि (चित्रा 4C और 4D) बदला नहीं गया. पूर्व संवर्धन नमूना की तुलना में, Tecs की वसूली दर के बारे में 85% (चित्रा 4E) था.

    चित्रा 1
    चित्रा 1 माउस थाइमस durinजी विच्छेदन. थाइमस पूर्वकाल बेहतर छाती में दिल के ऊपर स्थित है. काटने और पसलियों उठाने के बाद, थाइमस के दो सफेद पालियों सामने आ रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 2
    प्रवाह cytometric डेटा विश्लेषण के साथ चित्रा 2 पहचान CTEC और mTEC की. सना हुआ थाइमस सेल के नमूने प्रवाह cytometry का उपयोग विश्लेषण किया गया. प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल को दिखाया जाता है. संख्या प्रत्येक जनसंख्या का प्रतिशत संकेत मिलता है. (ए) जीवित कोशिकाओं के, CD45 नकारात्मक और EpCAM सकारात्मक घटनाओं की एक गेट टीईसी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है. टीईसी फाटक के भीतर (बी), दो आबादी Ly51 और UEA- के स्तर से अलग हो रहे हैं 1. cTECs उच्च हैLy51 के एर अभिव्यक्ति; mTECs UEA -1 के उच्च स्तर है. (सी) MHC द्वितीय अणुओं अत्यधिक cTECs पर व्यक्त कर रहे हैं. (डी) mTECs अलग से कम mTEC उच्च और mTEC के रूप में भेजा जाता है जो MHC द्वितीय उच्च और MHC द्वितीय कम उप आबादी के होते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 3
    चित्रा 3 एक liberase आधारित प्रोटोकॉल एक बहु कदम collagenase / dispase प्रोटोकॉल का उपयोग करने से थाइमस से उच्च सेल पैदावार की अनुमति दी. थाइमस कोशिकाओं को पहले प्रकाशित बहु कदम collagenase / dispase प्रोटोकॉल या इस liberase आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार कर रहे थे. नमूने के दो समूहों प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया. (ए) </ Strong> प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल को दिखाया जाता है. संख्या (बी) माउस थाइमस प्रति टीईसी की कुल सेल नंबर. प्रत्येक समूह में टीईसी कोशिकाओं के प्रतिशत का संकेत बार ग्राफ में दिखाए जाते हैं. त्रुटि सलाखों (एन> 3) मानक विचलन का संकेत मिलता है. एक दो पूंछ, unpaired टी परीक्षण सॉफ्टवेयर चश्मे का उपयोग किया गया था. पी <0.0001. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 4
    Panning विधि द्वारा Tecs की चित्रा 4 संवर्धन. पूर्व और बाद समृद्ध Thymic stromal कोशिकाओं की FACS प्रोफाइल को दिखाया जाता है. तैयार थाइमस कोशिकाओं विरोधी CD90 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. CD90 पॉजिटिव thymocytes थाइमस कोशिकाओं के 95% से अधिक रचना. टीईसी संवर्धन प्रक्रिया के दौरान, thymocytes captur हैंएड और पूर्व लेपित पैनिंग प्लेट पर समाप्त हो, इस प्रकार Tecs सतह पर तैरनेवाला में समृद्ध कर रहे हैं. (ए) और (बी), टीईसी द्वार दिखाए जाते हैं. संख्या की शुरुआत के आबादी (पूर्व संवर्धन) में या संवर्धन (पोस्ट संवर्धन) के बाद कुल जीवित कोशिकाओं के बीच Tecs के अनुपात दिखा. (सी) और (डी), CTEC और mTEC फाटक के भीतर कोशिकाओं दिखाए जाते हैं. संख्या प्रत्येक समूह से टीईसी आबादी में CTEC और mTEC के प्रतिशत को प्रदर्शित. (ई) सेल cTECs की संख्या और माउस थाइमस प्रति mTECs ग्राफ में दिखाए जाते हैं. डाटा 5 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. "पूर्व" पूर्व संवर्धन नमूना के लिए खड़ा है; "पोस्ट" के बाद संवर्धन नमूना के लिए खड़ा है; छोटे क्षैतिज लाइनों मतलब संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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    Discussion

    प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम थाइमस stromal कोशिकाओं (धारा 3) की तैयारी और Tecs के संवर्धन (धारा 4) हैं. यह जोरदार ताजा एंजाइम समाधान हर समय तैयार है और ऊतकों के रूप में जल्द से जल्द इलाज किया जाता है की सिफारिश की है. जमा thymi के लिए, एंजाइम समाधान की मात्रा का अनुकूलन thymi की संख्या पर निर्भर करता है की आवश्यकता है. किसी भी ऊतक अवशेषों प्रसंस्करण के बाद छोड़ दिया गया है, तो अधिक एंजाइम समाधान और ऊष्मायन समय का विस्तार जोड़ने सेल उपज में वृद्धि कर सकता है. Tecs के संवर्धन, सतह पर तैरनेवाला के संग्रह को पूरा करने और सेल नुकसान कम होगा धारा 5.3 में उल्लिखित थाली कुल्ला दोहरा दौरान.

    1980 में, Wekerle एट अल. पूरी तरह से intracellular पुटिका के भीतर कई व्यवहार्य lymphoid कोशिकाओं आवृत कि बड़े कॉर्टिकल उपकला कोशिकाएं हैं जो "Thymic नर्स कोशिकाओं" (TNCs) 33, - पहले Tecs की एक प्रकार की सूचना दी. 1982 में, Kyewski और कापलान विभिन्न अलगाव cond वर्णितTNCs 34 की उपज को प्रभावित करने वाले itions. हाल ही में, Takahama और सहयोगियों अलगाव और TNCs की विशेषताओं पर दोबारा गौर. वे केवल झिल्ली permeabilization 35 के बाद CD45 के लिए तरजीही धुंधला के आधार पर ऐसी कोशिकाओं की पहचान की. उन्होंने यह भी एक CTEC और कई बाध्य thymocytes के शामिल है, जो उनकी तैयारी में "टूटा" टीएनसी का वर्णन किया. इस तरह टूटा टीएनसी कोशिकी CD45 के लिए और CTEC मार्कर β5t के लिए सकारात्मक थे और उनकी तैयारी में कुल cTECs का 70% शामिल थे. हमारे अलगाव की प्रक्रिया के साथ कुल cTECs के कम से कम 40% शामिल है, हालांकि वास्तव में, हम भी, हमारे तैयार थाइमस सेल निलंबन में CD45 उच्च EpCAM + और ​​Ly51 + था जो एक समान सेल आबादी, मनाया. इन टूटी टीएनसी CD90 या CD45 के साथ या तो कमी उपयोग है कि हमारे जैसे टीईसी संवर्धन प्रोटोकॉल, से हटा रहे हैं. इस प्रकार, एक भविष्य चुनौती इस आबादी के नुकसान को कम करने के लिए किया जाएगा.

    मुकाबलेमौजूदा बहु कदम पाचन प्रक्रिया 29, Liberase पाचन प्रोटोकॉल Tecs की एक महत्वपूर्ण उच्च सेल उपज (चित्रा 3) की अनुमति देता है. सेल उपज में काफी वृद्धि हुई नहीं किया गया था, हालांकि अन्य समूहों को भी, ग्रे की विधि 30,36 संशोधित करके Thymic stromal सेल अलगाव के लिए अपने नए तरीकों की सूचना दी है. हाल ही में, Chidgey और उनके सहयोगियों ने स्वतंत्र रूप से Liberase पाचन का उपयोग कर एक टीईसी प्रोटोकॉल सूचना दी और वे भी Tecs 37 की प्रभावी रिहाई प्राप्त की. हालांकि, उनके प्रोटोकॉल के पहले thymocyte रिहाई कदम cTECs हैं, जिनमें से अधिकांश प्रत्येक थाइमस 29, से लगभग 1.6 x 10 4 Tecs त्यागने की क्षमता है. कारण छोटे stromal कोशिकाओं का नुकसान हो घनत्व ढाल संवर्धन करने के लिए, एक autoMACS आधारित CD45-microbead कमी लोकप्रिय पूर्व FACS शुद्धि 29,36,37 को Tecs के संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है. CD45-microbead कमी प्रोटोकॉल 29, का उपयोग autoMACS आधारित संवर्धन की तुलनाTecs के उच्च वसूली दर संवर्धन प्राप्त panning. कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले की रिपोर्ट लाभ के एक नंबर समुच्चय. इस प्रोटोकॉल (धारा 6) के साथ शुद्ध टीईसी कैंपेन्स सफलतापूर्वक रीयल टाइम पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के रूप में 12, आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है.

    इस प्रोटोकॉल भी अलगाव और इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं के रूप में अन्य Thymic stromal कोशिकाओं के अध्ययन के लिए उपयुक्त है. हम Thymic stromal कोशिकाओं, विशेष रूप से Tecs, की मजबूत अलगाव टी सेल के विकास के लिए कैसे थाइमस कार्यों की समझ और इन विट्रो टी सेल संविधान में प्राप्त करने में तेजी लाने जाएगा. (जैसे प्रत्यारोपण और कैंसर के इलाज में इस्तेमाल उन लोगों के रूप में) चिकित्सा से वसूली के साथ एक आम समस्या इम्यूनो के लिए अग्रणी थाइमस में उपकला कोशिकाओं के गरीब पुनर्गठन के बाद से इसके अलावा, इन कोशिकाओं के लक्षण, चिकित्सा समुदाय के लिए महान व्यावहारिक महत्व है.

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    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

    Acknowledgments

    यह काम (काह को) स्वास्थ्य अनुदान R01 AI088209 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. हम भी मिनेसोटा फ्लो संसाधन विश्वविद्यालय धन्यवाद.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

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    References

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    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

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