जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के साथ मुरीन छोटी आंत उपकला ऑर्गेनोइड्स की सह-संस्कृति

यह प्रोटोकॉल आंतों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उपकला के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है और विच्छेदन करता है कि ये इंटरैक्शन आंतों के होमियोस्टैसिस और सूजन में कैसे विनियमित हो सकते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ विट्रो मॉडल में कमी से सुविधाजनक प्रयोगात्मक नियंत्रण की उत्कृष्ट मात्रा है, जिसका उपयोग उपकला और प्रतिरक्षा जीव विज्ञान में प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग पहले से ही सीडी 44-पॉजिटिव एपिथेलियल क्रिप्ट्स के विस्तार में आईएलसी 1 की भूमिका को निर्धारित करने के लिए किया गया है और इसमें सूजन-मध्यस्थता वाले जठरांत्र संबंधी रोगों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने की क्षमता है।

शुरू करने के लिए, बर्फ पर थर्मल क्रॉस-लिंकिंग बेसल एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स को पिघलाने के लिए रखें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखकर एक मानक ऊतक संस्कृति-उपचारित 24-अच्छी तरह से प्लेट को पूर्व-गर्म करें। इसके बाद, इनक्यूबेटर से ऑर्गेनोइड्स युक्त प्लेट को हटा दें और मीडिया को पारित होने के लिए अच्छी तरह से छोड़ दें। फिर, कुओं में बर्फ-ठंडे उन्नत डीएमईएम एफ 12 के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पी -1000 टिप का उपयोग करके, सभी कुओं से ऑर्गेनोइड्स को 15-मिलीलीटर ट्यूब में काटें।

बर्फ-ठंडे उन्नत DMEM F12 के 250 से 300 माइक्रोलीटर के साथ कुओं के तल को कुल्ला करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई ऑर्गेनोइड्स कुएं में न रहें और काटे गए ऑर्गेनोइड्स युक्त 15-मिलीलीटर ट्यूब में पूल करें। बर्फ ठंड उन्नत DMEM F12 के एक मिलीलीटर में एक से दो दिन पुराने काटा organoid गोली resuspend. पीबीएस 2 प्रति जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के साथ प्री-कोट एक 1.5-मिलीलीटर ट्यूब नमूना दोहराती है, और फिर एक पूर्व-लेपित पीबीएस 2 टिप का उपयोग करके, ट्यूब में लगभग 100 से 200 ऑर्गेनोइड्स वितरित करती है।

PBS2-लेपित P-1000 टिप का उपयोग करते हुए, 500 ILC1s से कम की मात्रा जोड़ें जैसा कि सॉर्टिंग चरण से पीबीएस 2-लेपित 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में गणना की गई है जिसमें ऑर्गेनोइड्स होते हैं। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 300 जी पर आईएलसी 1 और ऑर्गेनोइड्स को नीचे स्पिन करें और छोटे व्यास के टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज से बचने के लिए सुनिश्चित करें, क्योंकि वे ट्यूब की नोक पर एक गोली बनाने के बजाय ट्यूब इंटीरियर के किनारे के साथ कोशिकाओं को खींचेंगे। फिर, गोली को परेशान किए बिना धीरे-धीरे और धीरे-धीरे supernatant को हटा दें और नमूने को बर्फ पर रखें।

एक ठंडी सतह पर ट्यूब को पकड़ते समय, थर्मल-क्रॉसलिंकिंग बेसल एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के 30 माइक्रोलीटर में ऑर्गेनोइड्स और आईएलसी को कम से कम 10 से 15 बार भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए फिर से निलंबित करें। एक गुंबद बनाने के लिए एक पूर्व-गर्म 24-या 48-अच्छी तरह से प्लेट के लिए थर्मल-क्रॉसलिंकिंग बेसल एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स में आईएलसी ऑर्गेनोइड्स के प्रति 30 माइक्रोलीटर लागू करें। इसके बाद, प्लेट को सीधे इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 10 से 20 मिनट के लिए रखें।

फिर, किसी भी वांछित प्रयोगात्मक साइटोकिन्स या अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ प्रति अच्छी तरह से पूर्ण आईएलसी 1 माध्यम के 550 माइक्रोलीटर जोड़ें और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। 24 घंटे के बाद, धीरे से इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें और प्लेट को एक मिनट के लिए ऊतक संस्कृति हुड में बैठने की अनुमति दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लिम्फोसाइट्स बस गए हैं। मीडिया के 200 से 250 माइक्रोलीटर को हटा दें और इसे 24-अच्छी तरह से प्लेट के खाली कुएं में रखें।

एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए supernatant की जांच करें कि कोई लिम्फोसाइट्स नहीं हटाया गया था। यदि supernatant स्पष्ट है, तो मूल अच्छी तरह से सह-संस्कृति में ताजा ILC1 माध्यम के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। यदि लिम्फोसाइट्स supernatant में मौजूद हैं, तो चार डिग्री सेल्सियस पर तीन से पांच मिनट के लिए 300 से 400 जी पर सेंट्रीफ्यूज और ताजा आईएलसी 1 माध्यम के 300 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित कर दिया।

फिर, मूल अच्छी तरह से मीडिया के शेष 200 से 250 माइक्रोलीटर में सेल निलंबन जोड़ें। एक एकल सेल या थोक आरएनए की तलाश या आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लाइसिस बफर में लक्ष्य आबादी के इम्युनोफ्लोरेसेंस, फ्लो साइटोमेट्री, या एफएसीएस शुद्धिकरण का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करें जैसा कि पाठ में वर्णित है। पारित होने के सफल समापन के बाद, स्वस्थ और मजबूत ऑर्गेनोइड संस्कृतियों से पता चला कि ताजा अलग-थलग क्रिप्ट्स को दो से चार दिनों के भीतर नवोदित क्रिप्ट संरचनाओं का निर्माण करना चाहिए।

प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण आरओआर गामा-टी मुरीन ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन से छोटे आंतों के आईएलसी 1 को अलग करने के लिए किया गया था, और अपेक्षित आईएलसी गिनती सीमा 350 से 3, 500 अलग कोशिकाओं के लिए पाई गई थी। ऑर्गेनोइड्स के साथ बीज होने के बाद, सह-संस्कृतियों को इम्यूनोकेमिस्ट्री साइटोकैमिस्ट्री द्वारा कल्पना की जा सकती है। Confocal माइक्रोस्कोपी छोटे आंतों organoids है कि अकेले और ILC1s की उपस्थिति में सुसंस्कृत कर रहे हैं की छवियों का पता चला.

इम्यूनो-साइटोकेमिकल स्टेनिंग से पता चलता है कि ऑर्गेनोइड आईएलसी 1 सह-संस्कृतियों में ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स प्रोटीन -1-पॉजिटिव एपिथेलियल कोशिकाओं के करीब निकटता में सीडी 45-पॉजिटिव आईएलसी 1 की उपस्थिति का पता चलता है। फ्लो साइटोमेट्री ने प्रदर्शित किया कि उपकला सेलुलर आसंजन अणु ऑर्गेनोइड्स में आंतों की उपकला कोशिकाओं को चिह्नित करता है, जबकि सीडी 45 आईएलसी 1 एस को चिह्नित करता है। प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लॉट और इम्यूनोकेमिस्ट्री ने आईएलसी 1 के साथ सह-संवर्धित होने पर आंतों के उपकला कोशिकाओं में सीडी 44 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का खुलासा किया।

आरटी-क्यूपीसीआर अध्ययनों से पता चलता है कि आईएलसी 1 सह-संस्कृति विशेष रूप से सीडी 44 वेरिएंट 6 को अपरेगुलेटेड करती है, जिसे टीजीएफ-बीटा 1, 2, 3 न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी द्वारा बाधित किया गया था, और छोटे आंतों-ऑर्गेनोइड्स-केवल संस्कृतियों में पुनः संयोजक टीजीएफ-बीटा 1 द्वारा अपरेगुलेटेड किया गया था। ऑर्गेनोइड्स के हेरफेर के दौरान कोमल होना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पूरी संरचनाओं को बनाए रखा जाए और यह जांचने के लिए कि संरचनाओं ने सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पर्याप्त रूप से गोली मार दी है। अन्य प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा घटकों को जोड़कर सिस्टम की जटिलता को बढ़ाकर, इस इन विट्रो सिस्टम का उपयोग आंतों के जीव विज्ञान में आगे के प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है।