通过全内反射荧光显微镜可视化G蛋白偶联受体的单事件分辨率网格蛋白介导的内吞作用

Biology

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Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51805, doi:10.3791/51805 (2014).

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Abstract

Introduction

网格蛋白介导的内吞作用(CME)的过程是依赖于网格蛋白介导的内吞机制的许多组分的良好的定时到来时,收集货物和操纵质膜进入囊泡1-3。 CME是由细胞膜变形,货物适配器蛋白走到了一起,在1内吞作用的新兴网站开始。这些蛋白质招募外壳蛋白网格蛋白,其组装成笼状结构,其形成的笼形蛋白包被的坑(CCP)4。一旦中共完全组装成球形的形状,膜的断裂,主要是通过大量的GTP酶,dynamin上的动作,产生游离网格蛋白包被小泡(校准检验)5,6。此内化触发网格蛋白涂层的快速拆卸,从而可以再次用于多个回合CME的组件。

参与CME蛋白的发现和鉴定已植根于传统biochemical,遗传和显微技术4-6,8。这些实验已经阐明这些元件内吞作用和交互点。虽然用于限定贩卖机的必要成分非常有用,这些测定法是高度限定在捕获CME部件或货物浓度的动态行为。这是一个重要的限制,因为CME是由套蛋白的模块中定义的步骤的编排组件驱动,并且由于在个体内吞事件的动态微小变化可对细胞内吞作用大累积的后果。另外,最近的数据表明,单独的CCP可能不同无论在组成和行为,这表明该过程的生理调节高度空间和时间上的限制9-14。可视个人的内吞的事件,因此,关键是要理解为什么有参与CME的多个冗余的蛋白质,以及这些蛋白可能被控制bŸ生理信号来调节货物的内在。

在这里,我们描述了使用全内反射荧光显微镜(TIRFM)的个体的CCP的活细胞中的动态水平观察CME。 TIRFM依赖于玻璃盖玻片和细胞15,16的流体环境之间折射率的差异。当激发光被导向所述细胞在超过临界角,它是在内部反射,创建维护薄照明的领域延伸的盖玻片上约100nm的渐逝波。这确保了只有在这个狭窄领域的荧光分子被激发。实际上,这允许上或附近的细胞膜荧光分子的激发,并从该单元的内部部件最小化荧光。这提供了一个显著更高的信号 - 噪声比,并沿z轴的分辨率来可视化在质膜,共同事件mpared更常用的模式,诸如传统的表面荧光或共聚焦荧光显微术。我们还描述,在一个介绍和实际操作层面,采用了常用的图像分析平台,分析和定量简单的形态特征和个别货物吞事件的动态。

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Protocol

在培养细胞中,使用荧光灯的1表达的标记CME组件

HEK293细胞是已被广泛用于研究G蛋白偶联受体的生物学和细胞内吞作用,并因此被用作本协议模型是有用的模型细胞。使用任何转协议提供无过度和低毒性统一的表达。

  1. 处理所有的细胞培养在无菌层流罩。填充4个孔的12孔板的1毫升Dulbecco改良的必需培养基(DMEM)中,用10%胎牛血清(FBS)中。从HEK293细胞的融合T25瓶中稀释1:50,1:25,1:16,1:10分别到每个4口井的。
    1. 或者,种子细胞的多孔板所需尺寸的,按照生产商的说明进行操作。种子0.4 - 2×10 4个细胞到12孔板。在无菌的37℃,5%CO 2和95%湿度下过夜生长的细胞。
      注:考虑到增长Ř茨取决于条件和细胞系中,它可能是优选的种子多口井,以确保理想的汇合对于转染次日或一式两份进行转染的可能性。
  2. 第二天早上,选择一个好就是〜70%融合的转染( 见图1B)。如果没有也已经达到这种状态,再等一天。
    注:70%汇合是理想的HEK293细胞。转染细胞,更稀疏导致细胞死亡和毒性。转染过的细胞融合产生不善表达。
  3. 加入60微升缓冲液EC(从转染试剂盒),400纳克质粒编码的标记的G蛋白偶联受体和/或网格蛋白机械的部件,和2.4微升增强的入1.5 ml离心管,如制造商的方案进行说明。涡流,持续2秒,以确保充分混合,并旋转在微量在2000×g离心2秒,以收集液体在底部。
  4. 添加6微升的Effectene如制造商的方案进行说明。涡流,持续2秒,和自旋在2000×g离心2秒的离心以收集液体在底部。等待20分钟,以允许形成转染复合物的胶束。
  5. 要转染从井抽吸介质。轻轻地用10%胎牛血清补充0.8毫升DMEM中的转染试剂混合物中,并通过吹吸混合和向下慢慢减少破胶束。从侧面媒体和转染混合物加入到孔中非常缓慢。从微量离心管中,加入剩余的转染混合物用微量的好。
    注意:任选地,有10%FBS添加一个额外的0.5毫升DMEM中,以转染井得到的细胞产生平缓的转染和低瞬时表达额外的营养。
  6. 返回信元到37℃培养箱中培养5小时。
  7. 吸出介质含有转染混合物。替换用1ml的DMEM含10%FBS。允许细胞生长过夜。
  8. 第二天,通过将细胞以未涂覆的盖玻片上,预先通过高压灭菌消毒。
    1. 用1mM EDTA的加入0.5毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的每个孔中。另外,使用加入0.5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA。留在培养箱中培养1分钟。
    2. 将3轮,无菌25毫米盖玻片到6孔板的不同孔。各用2毫升的媒体以及填补。轻轻盖玻片向下推到井的底部,以防止细胞在盖玻片的底部生长。
    3. 手动搅拌该井抬离细胞从井的底部。加入1 ml的DMEM含10%FBS重悬。从1井的12孔板的均匀分布之间的3盖玻片的解禁细胞。另外,板上3玻璃底菜细胞。
  9. 使细胞生长在盖玻片上的成像之前至少48小时。确保细胞被分散,持平。

2。中共影像及货物动态使用TIRFM

  1. 共轭M1抗FLAG抗体与根据生产商的方案使用的Alexa Fluor蛋白标记试剂盒Alexa染料。可选地,预共轭抗体可以买到。
  2. 在1ml预热的Leibovitz培养基含10%FBS,或的Opti-MEM用50mM HEPES pH 7.4和10%FBS的10分钟,在37℃下千稀释(摄像:预孵育的细胞与抗体在1培养基)中,以标记细胞表面上的FLAG标记的G蛋白偶联受体。跳过这些步骤,如果基因编码的荧光蛋白,如GFP,作为标记(详见讨论)。
  3. 盖玻片转移到活细胞成像室。另外,对于玻璃底菜,吸出抗体 - 标签介质和加入700μl预热的成像介质。
    1. 使用一对镊子和弯曲25号针头的尖端插入一个钩子。
    2. 持钳子的惯用手。握住弯针,在OTH呃。转动针,直到钩子曲线向下朝玻璃。针,钩端轻轻的拖累,横跨6孔板的底部,直到它钩到盖玻片。小心不要划伤盖玻片的表面上,因为这将分离的细胞。轻轻提起,从井的底部的盖玻片起来。平衡靠墙井的支持盖玻片。
    3. 使用镊子抓住盖玻片的边缘附近,并移动盖玻片细胞面朝上的成像室,和装配该室。添加预热的成像介质的700微升(或适量)。小心处理盖玻片没有压力,以防止开裂或断裂。
  4. 传送腔室到显微镜和使用阶段加热器或一个封闭的培养箱中保持电池的温度在37℃。
  5. 使细胞成为焦点采用100X或60X全内反射荧光油浸物镜(NA 1.45或以上)。图像的细胞常规萤光或反对照明( 不TIRFM)的焦模式,以确定细胞中表达的合适的结构。失焦细胞是几乎看不见的薄深度TIRF照明使得难以找到焦平面和细胞。
    注意:一些系统使用相同的激光器TIRFM图像在常规落射荧光,通过使上述临界角的激光的入射角度。作为一个重要的安全起见,总是知道激光束的角度,并总是指示它远离观察者。
  6. 聚焦下降到一个表达细胞的底表面至质膜的细胞周围的轮廓消失且细胞的中心出现。这是一个具有细胞膜局部货物蛋白最明显的,例如μ-阿片受体(参见图2A)。
  7. 切换到全内反射荧光成像。
    1. 如果使用相同的激光器进行成像在常规落射荧光,增加的入射角激光直到离焦的荧光在细胞中的内消失,并且在细胞周围质膜没有轮廓被看见。 (比较图2C图2A2B)
      请注意:在TIRFM,移动焦平面使得图像去完全失焦及/或暗淡的,并且整体荧光水平由于照明的小深度而减小。因此,另一种方法切换到TIRFM照明是第一焦点上的共焦/常规落射荧光的小区的中心,然后,直到失去大部分的荧光的增加入射角,然后集中向下到质膜。
    2. 一旦在TIRFM,确保激励用激光反射回来通过物镜而不是上面的目标可见。通过检查,如果激光点是可见的确认。
      注:在传统的萤光或共聚焦方式,激光照排高于目标可见,如在天花板上。
    3. 完善重点以获得清晰的图像。内吞机器的主要部件,如网格蛋白,将会在泪点可见。调整精细的焦点,所以泪点的圆形越好。
      注:对于膜局部货,调整精细对焦,直到丝状伪足出现截然不同。
    4. 使用采集程序来保存所有的成像参数,如反射镜和全内反射荧光的角度。做到这一点的所有必要的波长。
  8. 扫描周围盖玻片发现细胞中表达的所有期望的内吞标记:μ-阿片类受体和适配器β-arrestin的在图3A中所示的例子。选择那些表达,但不能过度表达细胞。详情请参阅讨论。
  9. 一旦细胞被识别,采集图像,每3秒进行10分钟。这足以捕获中共的寿命,因为中共在HEK293细胞在这些条件下成像的平均寿命是AROUND 40秒10-11。这使得约12-14帧,观察中国共产党。例如看电影1。重复所有步骤的图像更多的细胞。

吞动力学的人工验证3。分析

虽然中共寿命的人工验证大大由可检测的CCP的数目的限制,它仍然检测他不顾在图像和检测工件全球变化的精确装置。详情请参阅讨论。

  1. 打开ImageJ的文件。影像储存为TIFF文件交错渠道单一堆栈。图像转换为hyperstacks。去图像> Hyperstacks>栈Hyperstack。输入获取的信道数目( ,如果摄像β-休止和μ-阿片受体,输入2),输入1用于Z堆栈(TIRFM是一个单一的平面),和电影的帧的数量( 10分钟电影的一帧,每3秒í前200),在弹出的窗口中。
  2. 该hyperstack格式产生两个滚动条的窗口。使用顶栏移动通过渠道和底部的移动时间。滚动到其寿命将被检测的蛋白的通道。
  3. 移动到第10帧或15中的电影的降低夹杂物预先存在的CCP的整个持续时间是不可见的。画一个ROI框周围随机选择一个点。
  4. 计数帧的数目的点是可见的。
    注:请参阅图3B3C的三个形态类别内吞事件10,11,16-19的例子。

吞动力学的客观认识四分析

目标识别可以检测几乎所有的细胞被成像的CCP的,但也可以是容易出错由于杂散检测错误的结构。有关详细信息,权衡的优点和电子商务的利弊讨论,请参阅ACH法。几个方案,包括定制的算法,可以用来客观地检测的CCP。本协议描述的目标识别使用了Imaris,图像分析软件(见材料 )的关键控制点。

  1. 首先,打开图象分析软件的原始图像文件。默认情况下,会出现一个合并的彩色图像。使用“显示调整”窗口调整通道的亮度。点击一个频道的名称更改显示的颜色。取消选中旁边的通道,以防止其显示的框( 见图4A)。
  2. 点击橙色斑点的图标,创建“景点”。 如图4B所示 。选择感兴趣区域(ROI)的单元格周围的区域。参见图4C。使用投资回报率,以排除会不正确地检测明亮前缘和斑块区域。分析多个细胞与分别不同的表达水平。
  3. 测量点的直径PROVI德初步估计算法。切换到“切片”模式,然后点击一个点的极两端测量其直径。参见图4E。做到这一点的4或5圆斑,看起来指示中共在其稳定的高度,形成后断裂之前。使用这些测量结果来计算平均直径降低到微米的最近的十分之一。
  4. 检测到的景点。返回到“超越”模式。选择适当的渠道进行检测。输入测得的平均直径通常为0.3或0.4微米。点击蓝色箭头向前量化的景点。参见图4E。如果斑点的直径被低估,荧光假点将被认定为斑点。如果直径过大,真正斑点将被忽略。如果不能确定,估计低一点,后来筛选出不正确的检测。
  5. 通过质量过滤景点。调整过滤器捕捉到尽可能多的景点尽可能不回来地面上。质量过滤器默认选择20。参见图4F。
    1. 使用“质量”的曲线为指导,以设置合适的阈值。将过滤器与鼠标左键的底部门槛的曲线这首畅游。这是一个很好的起点,过滤器,因为这个位置通常是提炼检测到唯一可见的斑点。参见图4F。
    2. 检测点出现在电影的领域或中心像素。使用“颜色”选项卡中,调整斑点的颜色为对比色,使之更容易看到它们。滚动的电影审查每一帧的景点。我们的目标是检测尽可能多的斑点尽可能为他们的一生的全部。
    3. 消除暗斑或手动将它们连接成连续的磁道以后,因为它们不被检测以及通过他们的一生的过程。
    4. 与“强度”FIL删除明亮斑块之三,如果需要的话。点击绿色加号添加一个新的过滤器。参见图4F。创建一个过滤器强度或退出一个给定的荧光信号景点进行筛选。使用生成的强度曲线,(类似于质量曲线在4.5中讨论)来设置门槛。用鼠标左键删除,代表最亮的景点曲线的极端左端。
      注:大斑块结构通常是在细胞中最亮的元素中,并且它们容易排除与该过滤器。
    5. 通过电影滚动,以确保关键控制点被检测为斑点,并且不再检测出最明亮的斑块。 图3D示出了细胞,其中检测的CCP(由白球表示)进行了优化,以质量过滤器和斑块被排除与质量过滤器。
    6. 减少与品质的过滤器明亮小区边缘。明亮的物体可能仍然需要手动删除,在下一步骤。继续与蓝箭头。
    7. 删除在编辑斑点屏幕异常斑点。切换到“选择”模式。点击当场。它会变黄。单击“删除”。点击蓝色箭头继续建设的算法。参见图4G。
  6. 测量轨道。设置轨道“布朗运动”。中共应该不表现出任何定向运动,穿过质膜只有最小的漂移。这个算法是最适合该运动。参见图4H。
    1. 设定的最大距离为较小的值,如0.7微米。参见图4H。
      注:设置一个小的距离最小化邻近景点的连接,仍然允许在小区现场,通过中共或细胞运动的持续跟踪。
    2. 设定最大间隙大小为1。这样的轨道继续,如果只有一帧相继失踪。点击蓝色箭头来计算轨道。参见图4H。
      备注:G型超过3的原因不同轨道AP尺寸被错误地连接在一起。
    3. 通过电影观测质量检测开关轨迹看,以“神龙摆尾”。滚动。如果邻近的景点都被连接,降低了最大距离低于0.7微米。如果景点都被打破了太容易,增加最大间隙尺寸。点击蓝色箭头创建音轨。这导致滤波器的轨道平面。参见图4H。
  7. 滤波道和导出数据。请使用“强度”过滤除去额外的明亮斑块。使用“位移”滤镜移除了进入全内反射荧光领域内体。请小心,因为较长的景点都会有较长的位移为好。点击绿色的双箭头,完成协议。参见图4I。
    1. 使用编辑曲目选项卡,用铅笔图标,以消除无法通过过滤器除去轨道误报检测。检查discontinuities或虚假连接。要连接两条轨道,选择它们使用Ctrl-左键单击,然后在编辑曲目中单击“连接”。要断开曲目到不同的地点,选择曲目,然后点击“断开连接”。选择多点用Ctrl +左键单击,然后单击“连接”来创建一个新的轨道。该方法是相同的编辑斑点,在4.5.7中描述。参见图4J。
    2. 要导出的数据,到数据卡。点击单个软盘图标导出选定的统计信息。单击看上去像一系列软盘导出所有数据的图标。 “轨迹播放时间”统计量包含内吞轨迹的长度。参见图4K。

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Representative Results

使用活细胞全内​​反射荧光显微镜,我们已经记录了μ-阿片受体(MOR)的内吞动态,G蛋白偶联受体(GPCR)和它的内吞接头蛋白β-arrestin的。的β-抑制蛋白的构建体瞬时转染使用图1中所概述的协议的稳定表达MOR细胞系,并成像的96小时以后。铁道部在稳定细胞系是N端标有pH敏感的绿色荧光蛋白。该荧光蛋白只发荧光的中性细胞外液。另外,MOR仅endocytoses一次通过的激动剂活性,并保持另有均匀地分布在质膜。着眼于贴壁细胞质膜是坐在盖玻璃在激光共聚焦模式导致了填充有暗淡荧光的细胞。这是由一个聚焦于细胞,其中所述质膜仅看作是细胞周围荧光的环的中心不同。比较左面板和右面板中的图2A中 。切换到常规落射荧光或TIRF用不正确的角度将导致失焦荧光在同一细胞中变得显而易见, 如图2B所示 。当全内反射荧光的角度是正确的质膜非常鲜明,清晰,明亮,失焦荧光不再破坏了形象。比较图2C图2A2B。

图像清晰和尖锐,因为MOR是在粘合质膜,这在很大程度上是内TIRF字段。相反,β-抑制蛋白保留在细胞质池时尚未募集到内吞泪点,并且,因为它不是在TIRF字段出现混浊和失焦。一旦MOR由激动剂活性,β-抑制蛋白被募集到质膜,和两个β-抑制蛋白与受体重新分配到的CCP( 图3A电影1 β-arrestin的绿色,铁道部为红色,叠加为黄色)。

这些簇的寿命可以手动进行定量使用三个参数完成的内吞作用, 如图3B中所描绘。这些点表示关键控制点可以完全消失(也见图3C),开启和关闭“眨眼”或“夹断”更大的结构。后两种情况代表了在空间上太接近被解析为单独的事件的事件。在了Imaris斑点检测算法也是有用的量化关键控制点,如在图4中概述。 图3D表示使用了Imaris,过滤以除去非动态斑块结构之后的CCP检测。覆盖白色的球体代表检测点。不能被他们的整个生命周期检测调光点也被排除在“质量”过滤器。

“> 图1
图1:转染过程的流程图。 (首先,播种各种稀释液(1:50 1:25 1:16,1:10),到12孔板。让细胞生长过夜。第二天,寻找一个很好的为约70%汇合,并均匀地分布,如图所示。这是将被转染的井(B)加入60微升的EC缓冲液和400纳克DNA导入微量离心管中。涡旋10秒,该液体旋到管的底部。加入2.4微升增强的。涡流,持续2秒和液体旋到管的底部。在室温下孵育3分钟。加入6微升的Effectene的。涡流,持续2秒和液体旋到管的底部。在室温下孵育20分钟,(C)慢慢混合0.8毫升DMEM中含有10%FBS的转染。加入细胞之前选择的好。孵育细胞5小时,在37℃。更换新鲜DMEM含10%FBS。

图2
图2:寻找TIRFM领域。 (一)细胞膜成像在焦。左侧面板描绘重点放在了小区的中心细胞的共焦。质膜只看作是一个“环”的单元格周围。聚焦下到基质膜,毗邻盖玻片导致细胞填充在昏暗的荧光。质膜“环”不应该在较薄的TIRF字段可见(B)该基质膜以较浅的TIRF角度穿过样品制备常规落射荧光照明。这个照射从该单元的顶部的整个细胞和多聚焦荧光的存在(C)中的TIRF质膜。重点丝状伪足,有助于找到这架飞机。请注意,它是光滑平面上。比例尺是10微米。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3
图3:可视化和量化的全内反射荧光吞事件。 (一)前,除了诱导细胞内吞作用的兴奋剂后表示μ-阿片受体(MOR)和β-休止的细胞。激动剂导致两个蛋白的内吞泪点的重新分配。比例尺为10μm(B)三种类型的内吞事件,可见通过可视休止动力学,与先前所描述的形态一致的。 “稳”,一是稳定的信号,即迅速消失。这是主要的类型,这表明中共出芽和离开TIRF字段。 “闪烁”,即闪烁的信号以较低的信号,并重新出现在同一地点由于中共第二组装在同一地点。 “掐断”,管状突起脱落的斑点,当两个关键控制点太接近对方被解析为不同的点,一个是内吞。该框是2×2微米(C)可视MOR的网格蛋白介导的内吞作用在单事件分辨率。给出的值是表示对MOR内吞事件的主要部分的两个例子。框架是每3秒。该框是2×2微米(D)检测使用了Imaris个体内吞的事件。白球表示检测到景点的CCP。使用的是“质量”过滤器检测点进行了优化。而无法对他们的一生的全部检测到的调光斑点也被排除在外的质量过滤器。这被示为未检测到大斑块结构分别用“强”过滤器被删去。ig3large.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

图4
图4:采用了Imaris内吞活动的动态目标识别。 (一)调整显示窗口,用于在步骤4.1中所述来调整图像的显示。(二)开放的“点”算法建设者。构建器将显示在下面的窗口(C)的斑点算法构建的第一步。检查“跟踪景点(一段时间)。”检查“利益分部只是一个区域,”如果需要的话。(四)投资回报率选择画面。请参阅步骤4.2的 ​​详细信息(E)来定义一个测量点的直径需要在多个窗口。小组表示:切换使用的导航超越切片模式gation栏上方,点击一个点,在这里显示的测量直径,通常在最右边,在那里输入被测直径的极性端。见步骤4.3-4.4。(f)4.5-4.5.3描述的现场质量过滤器。在4.5.7中所述(G)编辑点窗口。(H)测量跟踪和观察轨道窗口,在4.6中描述。(一) 4.7滤波道窗口描述。(J)编辑跟踪4.7.1中描述的窗口。在4.7.2中所述(K)保存数据画面。 请点击这里查看该图的放大版本。

电影1

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Discussion

在这里,我们描述了使用TIRFM的可视化网格蛋白介导的内吞作用(CME)以各自的CCP的电平在实时活细胞。 CME是由许多在空间和时间上分开的单个事件的累积效应介导的快速和高度动态的事件。使用表面生物素化或配体结合,流式细胞术或固定的细胞测定法测定内化的蛋白质,或蛋白质的电子显微镜定位的量目前使用最测定法,如内在的生物化学测量,监视在固定的时间点集合的变化在蛋白质定位。这些现有的方法已经在鉴定蛋白质所必需的CME,但缺乏空间和时间分辨率相匹配CME或其他动态膜运输过程的生理尺度是非常有用的。这是很重要的,因为最近的证据表明,关键控制点是在异质性的蛋白质组成和动力学9-12,随着CME很可能迅速在空间上离散的方式调节。活细胞TIRFM提供给分析CME在空间上分离的单CCP的电平,在真实时间,在活细胞中的能力。

成功应用这一强大的分析都依赖于两个关键因素:细胞的健康和CME的参数的深入分析。对于标记的蛋白质和显微技术最大限度地减少光毒性前,适当的表达是至关重要的。细胞系中稳定表达的目的蛋白质是理想的,因为表达水平能够可靠地估计。我们标记的受体有两种N末端 ​​标记抗原决定簇或SPH标签21-25。虽然不是严格必要的,这两个标签系统促进CME的TIRFM因为受体可以选择性地在质膜上,在实验的开始进行检测。所需的额外的内吞组分也可以瞬时转染入这些稳定细胞株。在TRansfection协议这里应当指出使用TIRFM成像CME被最优化。第一,它是专为偶数和中等程度的表达。差表达式就必须较高的激光功率进行检测,并增加了风险为光毒性和光漂白。另外,由于该试验中记录了泪点为内化的CCP的消失,低信号和光漂白不利也分析。我们认为,在这种情况下,总的持续时间和/或成像的频率被降低。第二,对细胞的转染试剂的短潜伏期,转染和实验,并转染细胞的新鲜通路到成像之前盖玻片之间的间隔,都保证了成像的细胞处于最佳健康状态。第三,这确保了绝大多数网格蛋白结构是关键控制点,和网格蛋白或网格蛋白斑块不平坦的薄片。第四,本协议最小化的过表达转染CME组件,这一直显示Ñ ​​改变CME动态20,26。

用于成像具有低光毒性,它以优化成像系统获得最佳的分辨率和最大灵敏度是重要的。物镜和相机检测器尺寸的放大倍数应匹配以最小化不足或过采样和空的放大率。高数值孔径(1.45以上)的TIRF物镜应该用于收集光的最大可能的。我们获得的图像用电子倍增电荷耦合器件相机对高量子效率,低的曝光时间,以及快速读出速度。此外,为了确保该细胞的健康,他们被成像在Leibovitz的媒体,它是缓冲独立的CO 2,并补充了10%FBS,在一个完全封闭的腔室设置为37℃。因为TIRFM是高度敏感的,并使用能够检测甚至最小的环境光的高数值孔径物镜,关键是要创造一个封闭的成像环境自由从外部光和振动对可能扰乱细焦平面。

需要注意的是绝对的寿命和CME的大多数部件的动力学而变化很大程度上依赖于细胞类型,蛋白质的表达水平镀覆后,温度,天是很重要的,并在培养条件7,10,14,17,20其他变化, 25,27。这反映在使用这种技术,该测定法的一个明确的限制,在时间尺度和不同的组之间观察到的分布的巨大变化。另外,可能的是在细胞内,在成像的TIRFM的底表面的CCP,从顶表面23,25有不同的行为。虽然这是值得商榷的哪个面准确地代表了“典型”的细胞通过细胞外基质成分在组织包围,看到这种技术共产党动态的解释需要考虑这个电位差。该法的真正实力,因此,在于比较的变化在D关键控制点在相同的培养条件ynamics,在相同的细胞,急性操作,包括货物分子的聚集,例如响应于激活的GPCR之后。该比较允许对变化到相同的细胞正常化,从而控制了所有上面提到的可能诱发变异中共行为的参数。

我们通常采用手动和自动分析,如上所述,分析内吞事件的持续时间:人工验证,并使用了Imaris图像分析软件的目标识别。手工验证是劳力和时间密集的,因为它是由CCP的数目,用户可以计数的限制,但它被认为是最准确的技术资料。一个训练有素的人眼可以很容易地继续通过细胞的运动跟踪中国共产党,并改变形状或重点,准确地排除斑和缺陷像素。它也可以检测出中共形态变化的指示完成前夕NTS,如图所示为图3B3C。这是必要的,然而,该分析仍然客观地这些限制范围内。这需要被一致地使用在所有的数据集的特定准则的定义。此外,我们通常分析以双盲的方式,其中所述图像的名称被加扰,以使条件仍然未知的分析图像的人的图像。自动检测, 例如使用“点”和“音轨播放时间”在了Imaris算法,可以用来检测大多数的内吞斑点在一个给定的电影,产生高的样本号。虽然许多选项,包括高度复杂的定制算法3,14,23,26,27,正在产生,这些方法的可靠性,检测正确的内吞事件,同时避免虚假检测仍然是最大的担忧。例如,在了I​​maris,细胞运动产生明亮的前缘,斑块,并出对焦框可以轻松甩开点检测算法,因为它有一种倾向,发现明亮的结构所组成完全的斑点。为了防止这些斑点从被连接到一个轨道,它们都必须被移除。单异常景点不在大结构,如斑可以使用编辑除去景点标签,而连接景点以后可能会使用编辑音轨选项卡中删除。对异常点也可以用自定义过滤器除去。例如, 图3D示出了用于限制避免包括在中共检测斑块的亮度滤波器。质量过滤器是用于删除错误的斑点另一个非常有用的过滤器。 “质量”是亮度的累积测量和形状,通过取点和高斯滤波的荧光强度的光点半径20的长度的¾找到。的质量曲线中发现的选定的过滤器的下方。它描述了斑点的检测数(y)的当质量一定值(x)。质量越低,越斑点检测。如果质量过滤太低,斑点将被检测到在没有可见荧光,反之,如果质量过滤器太高,只有最亮的斑点被检测到。沿走向更大的值(x)的曲线跟随;检测点的数量(Y)通常会大幅度下降。移动底部阈这一点。这是最低点以放置底部阈值。其他主要贡献者在TIRF场假点是移动到的小区的周边,并输入TIRF领域内体。一个强大的标准消除这些是点的移动, 点随时间的位移。 CCP的移动速度非常小,除非作为整个单元的运动的一部分,而胞内体显示出快速的布朗或定向运动。较新的算法,而显著好转,仍在细化和优化3,14,23,26,27。由于这些会晤部门首长的日益成熟和可靠的,我们可以分析数百点或上千,而不必在每个点手工验证。然而,目前,我们认为这两项分析一起使用,以相互配合的精度。

我们所描述的协议,可以很容易地适应回答有关货物的内吞作用的许多问题。它可以被用来执行简单的共定位货物与CME部件,以及用于显示对细胞内吞机器由于特定激励特定组分的变化。该法还可以很容易地适应任何内吞过程中,如小窝28,即表明货物和上装部件的离散浓度,并在专门的细胞类型这些基本过程的研究。在未来,随着基因组编辑变得更加主流的20,29,30,我们预计这将成为标记组件的首选方法,以及动态和行为Ø˚F各种部件将被进一步细化。考虑到我们的细胞过程的认识已基本由基因,蛋白质修饰和interactomes的识别驱动的,我们在这里所描述的实验代表了查询,即下一个前沿领域之一。这些过程和机制的时​​空动力学的定义。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate Fisher Scientific  SH3024301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco, by Life Technologies 21600-010
EDTA Free Acid Amresco 0322-500G
Fetal Bovine Serum Gibco, by Life Technologies 10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco, by Life Technologies 21083-027
Opti-MEM Gibco, by Life Technologies
HEPES CellPURE by Fisher Scientific BP2937-100
Effectene Qiagen 301425 Transfection reagent
25 mm coverglass Fisher Scientific 12-545-86
Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 Fisher Scientific 10-126-28
Cell culture 6-well plate Greiner Bio-One, by VWR 82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1 Sigma Aldrich F3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) Sigma Aldrich E7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Life Technologies A20173
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Image analysis software BitPLane http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters Nikon
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti Nikon For adjusting angle of incidence
iXon+ EMCCD camera and adapters Andor

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