串联高压冷冻和植物组织中快速冷冻替代透射电子显微镜

Biology

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Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51844, doi:10.3791/51844 (2014).

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Abstract

自从20世纪40年代的透射电子显微镜(TEM)一直提供生物学家与生物材料的超高分辨率图像。然而,因为费力和费时的协议也需要经验中制备无伪影的样品的,TEM不被认为是用户友好的技术。对于传统的TEM样品制备中使用的化学固定剂保存细胞结构。高压冷冻是生物样品在高压下的冷冻固定,以产生非常快的冷却速率,从而限制了冰的形成,这是不利于细胞的超微结构的完整性。高压冷冻和冷冻替代目前所选择的用于制造高质量的形态在用于TEM树脂部分中的方法。这些方法最大限度地减少通常与传统的加工相关的超薄切片透射电镜的文物。冷冻固定后的冷冻水的样品中被替换为液体在低温条件下的有机溶剂中,这个过程被称为冷冻替代。冷冻替代典型的是在上专用的,昂贵的设备数天。最近的创新允许而不是通常的两天过程在三小时内完成。这之后通常是样品制备,包括浸润和切片之前在环氧树脂包埋的几天。在这里,我们提出了一个协议,结合高压冷冻和速冻置换,使植物样品固定待小时内完成。该协议可以很容易地适于与其他组织或生物体的工作。植物组织是因为加气空间和装满水的空泡阻碍水无冰冷冻的存在,特别令人关注。此外,化学固定的方法是在由于细胞壁阻碍的化学品渗透至深处的组织内的植物特别长。植物组织,因此particularly具有挑战性的,但这个协议是可靠的,并产生最高质量的样品。

Introduction

我们的细胞超微结构的知识主要来源于电子显微镜,它可以在几纳米1的范围内解决的细节。尽管是如此强大,在透射电子显微镜的分辨率不考虑人性化,样品制备,需要费时费力的协议,并从医生需要一定的专业知识。样品的传统固定结合了使用的醛和四氧化锇在进一步处理之前,包括脱水,在树脂包埋,然后切片,以产生超薄切片被,然后用重金属染色。然而,已知的是化学固定可产生伪影,包括蛋白质聚集和脂质1的损失,并以膜,最终影响多种细胞区室2的变化。这些构件在很大程度上归因于固定和脱水的缓慢速率在 ​​室温下3,4,5。

6,7。HPF减小Ä样品的温度至该液态氮的,非常高的压力(210兆帕或2100巴)的以毫秒为单位下。如果处理得当HPF防止形成大的冰晶,能导致细胞超微结构的重大伤害。 HPF可用于固定的100-200微米厚的样品在生物溶质7的典型浓度。上有物理多次审查和原则基础HPF, 1,7,8。

HPF后,将样品在低温下(-78.5℃培养至-90液体含有机溶剂的化学固定剂如四氧化锇,一般几天的存在C),#176。在这样低的温度下,水的样品中的被替换的有机溶剂,通常是丙酮,甲醇1,9。因此,该过程被称为冷冻替代(FS)。然后将样品逐渐加热,并在这段时间内是固定的,通常用四氧化锇和乙酸双氧铀9。交联在低温下具有固定的被固定1分子的优点。 FS因此产生的优良品质相比,那些在室温下固定用常规的化学固定,特别是它导致改进的超微结构保存,保存较好的抗原的样品,并减少未结合的蜂窝部件10,11的损失。

最FS进行过长期的时间段,通常长达数天。这是特别TRUE对于植物样品12,13,14。麦当劳和韦伯开发的最新协议,大大降低了时间的FS从几天到几小时15。在他们的快速冻结取代(QFS)过程,FS进行超过3小时,而在超级快速的FS(SQFS)样品在90分钟内进行处理。通过这些方法产生的样品的质量比得上那些用传统的FS协议产生。我们已经通过了QFS协议植物样品的高通滤波器后的下游加工。这已被证明不仅节省时间,而且钱,QFS和SQFS使用,而不是昂贵的市售FS机常见的实验室设备。

植物组织往往是非常具有挑战性的透射电子显微镜做准备。平均来说,植物细胞是大于或者细菌或动物细胞。疏水性蜡质角质层厚的细胞壁,含有有机酸,水解酶和酚类ç大型充水空泡的存在ompounds可以占据多达90%的总细胞体积16,并且充气空间的存在严重降低了系统17的热传导性。另外,在植物的情况下,样品的厚度几乎总是超过20μm时,限制使用化学固定的。在这些厚度中,水的导热系数低的防止冻结速率大于约10,000℃/秒,在样品的中心。这个速度是必需的,以避免破坏性的六角形冰的形成(冰晶具有较低的密度大于10〜15纳米)8。总之,这些挑战存在于样品和随后的FS既适当冻结。尽管如此,冷冻固定是固定植物样品的最好方法。在这里,一个协议,用于HPF-QFS植物组织样本呈现。它集中于模型物种拟南芥 ,但也被用于与本氏烟草 。典型的结果表明,HPF-QFS产生SA同等质量的传统HPF-FS中的一小部分时间mples。用适当的调整,该协议也可以被用于其他相对较厚的生物样品。

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Protocol

注:QFS过程需要格外小心和谨慎的用户,我们强调这些安全注意事项这里的注意事项和注意事项(如适用)。

1.Preparation的HPF运行

  1. 在开始样品制备,打开高压冷冻以下制造商的说明。
    注:在本协议中所使用的高通滤波器单元是Wohlwend紧凑型02单位( 图1A),它大约需要一点差一分,和一个半小时的启动程序运行高通滤波器可以开始之前。
    1. 开关上的Wohlwend紧凑型02高压冷冻。
      1. 通过旋转从“0”主开关“1”打开仪器。
      2. 释放压缩空气的机器。
      3. 释放液氮到机器。
      4. 按“系统干起来”按钮。
      5. 30分钟后,按“SYSTEM枯竭“了按钮。
      6. 按下“ON / OFF”按钮,在仪器上进行切换。
      7. 按“氮”按钮。
      8. 让机器冷却20分钟,即使在“驱动器”按钮已经亮了起来。
      9. “驱动器”按钮会亮起。
      10. 按“驱动器”按钮。
      11. 按下“自动”按钮。
      12. “系统准备就绪”按钮会亮起。
      13. 将温度和压力探头放入压力室,并与针将其锁定。
      14. 按“JET AUTO”按钮。该步骤检查,该压力增加和温度的降低是所希望;本质上是一个试运行。急剧下降的温度和大幅增加的压力,预计( 图1B)。
      15. 进行两次以上的JET周期。

2,准备Receivi吴冷冻样本

  1. 填充含有用液氮冷冻管座的绝缘框(参见安全警告),以使支架完全覆盖( 图1C)。
    注意:使用个人防护装备,包括cryogloves和护目镜液氮操作时。
  2. 放置装有将FS介质插入在液氮中( 图1C)的铝管座的小瓶的适当数目。与此协议多达四个盘各自含有一个单一的样品可以被放置在一个单一的离心管。
    注:该瓶应标有锐器像钻石尖书记和非常柔软的铅笔。
    1. 对于QFS在固定液中丙酮9用1%OSO 4和0.1%醋酸铀。准备在大体积的溶液,取1.5毫升分装到冷冻管并储存在液氮中冷冻。
      注意:遵守安全警告处理OSO 4和醋酸铀。
      注:OSO 4 请注意:用于保持样品QFS的冷冻管应具有硬的O形环,以确保所述管中QFS保持密封,以避免OSO 4的泄漏。
  3. 通过混合面包酵母用10%的甲醇,用牙签或其他类似工具大致相等音量,直至糊状平滑准备酵母膏。酵母膏作为一种胞外冷冻保护剂和用于填充在试样载体样品周围的空间。糊的量取决于样品的数目; 10个样品或更少的膏(1ml)中,可以混合于微量离心管中。

样品3的高压冷冻

  1. 从植物中取出的利息叶(或其他组织),并轻轻将它放在一块登塔的升蜡或其它切割表面。使用2.0毫米或所需的大小冲床切割样品出来的叶子。用钳子轻轻地处理样品,并尽快制定越好。
  2. 在解剖显微镜下工作,将叶盘在A型标本载体的0.2mm的侧面和酵母膏完全覆盖。确保在盘被完全填充并且膏是用保持器的通过提供平滑的糊状物 ​​用细画笔( 图2)的边缘的水平。
  3. 放置在试样保持器的载流子。支付与B型试样载体,表面平坦下来的样本。
    注:该试样夹持器应是干燥的,并在室温下进行。
  4. 取样品中试样夹持器,将其插入到机器,并按下“JET AUTO”按钮,它应该完成一两秒钟启动冷冻循环。
  5. 尽可能快地工作,从机器中取出支架,然后将尖端拿着SAMP勒入液氮中的HPF机顶部的绝缘箱。浸泡两对钳子的前端,在液氮来冷却它们。
    注:冻结后,运营商只能用液氮冷却的镊子处理。暖(室温)下钳通常是失败的cryotechniques的原因。
  6. 打开包含在FS介质离心管,然后将盖在盒子的侧面。有一对液氮冷却的镊子的辅助下,轻轻地从试样保持器中取出光盘,确保光盘总是在液氮或蒸气。工作在液氮蒸气,保持在FS管与一个预冷却的钳子,使用其他的支架放置在FS小瓶。拧FS小瓶的盖子重新打开。不要捕获任何液氮瓶中。
    注意:当样品转移到离心管的QFS,确保没有液氮被困在小瓶。液氮变暖和任何霉期间扩大700倍ð液氮可以在这段时间内会引起爆炸。
  7. 重复步骤3.1至3.7,直到所有需要的样本被冻结。包含相同类型的样品的多个叶盘可放置在相同的小瓶中。另外,试样夹持器需要被干燥并升至室温冷冻运行之间。要快速执行此操作,用吹风机加热,并监控其温度通过触摸。

4,准备冻结换人

  1. 完全浸没在液氮中的铝加热块为10分钟或直至核沸腾停止。而这会上,放置一个层干冰(1-2厘米)用作FS腔( 图3),该容器的底部。甲泡沫聚苯乙烯容器或冰桶可用于FS,随着碎干冰或粒料。
  2. 快速插入含有样品随温度探头插入中间行加热块的离心管。确保在盖子小瓶紧紧拧上,使得FS介质FS的过程中不会漏出。开始记录温度。
    1. 通过用离心管的顶部放置一个热电偶,使其到达管底使温度探测器。密封该管的盖用树脂使得没有液体泄漏出去。填用1.5ml丙酮的管在每个QFS运行的开始。
  3. 使用绝缘cryogloves或大钳,倒出来从加热器块中的所有液态氮。请注意不要倒出来的冷冻管。
    注意:使用个人防护装备,包括cryogloves和护目镜液氮操作时。
  4. 放置装有将小瓶上的干冰中QFS室内的层块。确保该块被放置以使管子躺在水平,但有轻微的向上翘起。不应有渗漏,如果正确的离心管中使用。
  5. 打包QFS室用干冰使FS管覆盖,虽然它是没有必要覆盖块的顶部。放置于所述腔室的盖子。

5,快速的FS

注意:在OSO 4的任何泄漏发生在不经意间,尽管其他的注意事项时通风柜执行QFS运行。

  1. 将QFS室在一个平台上的旋转振动筛在通风橱中,并旋转125转120分钟。在此期间,该块的温度应逐渐增加至约-80℃。搅拌,确保各组分混合为更好的FS。
    注:在摇床中通风柜和通风柜门的位置的位置应在整个QFS程序和运行,以确保样品的一致变暖每QFS相同。
  2. 除去从腔室中的干冰,并继续振荡培养1小时。
    注意:温度应提高到约-15℃至-20℃。
  3. 从QFS室中取出样品,温度探头和放置在摇床上于室温下再10-15分钟,直至它们达到室温。停止记录时的温度。
  4. 在财政司司长,关闭HPF机。
    1. 关闭液氮罐的抽头而将HPF机被充入氮气。
    2. 按“氮”按钮。
    3. 等到红色的“活塞下行”光熄灭。
    4. 按“开/关”按钮。
    5. 按“系统干起来”按钮。
    6. 切断压缩空气到本机的供应。
    7. 至少12小时后(以确保任何湿气的干燥),通过接通主开关从“1”到“0”关掉机器。

6财政司司长后处理

  1. 小心在适当的容器有毒废物移除媒体的FS​​用塑料移液管和地点。
    注:OSO 4和醋酸铀的危险化学品并应在通风橱中,而穿着适当的个人防护装备(PPE),包括封闭趾鞋,白大褂和手套进行处理。
  2. 洗涤样品四次用100%丙酮。收藏前两个洗涤,并放置在有毒废物容器。
  3. 用细镊子,从人取出的组织样本。保持湿润​​的样品用丙酮为做到这一点,而且工作非常轻柔,以免破坏样品。
    注意:这是不寻常,它实际上可能是有酵母膏落入远离样品在这一点上是有用的。酵母膏通常是非常深褐色,而叶组织仍然是绿色的。
  4. 收集的样品中含有丙酮离心管。按照通常的协议与样品制备(渗透和嵌入)的透射电子显微镜进行。

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Representative Results

结果下面介绍使用Wohlwend紧凑型02 HPF( 图1A)已经获得。这种仪器的一个主要优点是简单易用的标本运营商和持有人的。当使用其他乐器,麦当劳建议两个用户应进行样品制备和HPF,人们准备的样品,而其他则冻结并转移到FS的冷冻管9。然而,Wohlwend标本运营商和持有人是很容易为单个用户独立操作( 图2A,B,E,F和G)。然而,应当指出,应该进行一些试运行了宝贵的样品之前,请先来熟悉高通滤波器的仪器。一个有经验的用户应该能够固定在一个小时数(10个或更多)的样品。然而,在该协议提出的原理可以用于任何可商购的高通滤波器的机器。

也许将HPF-QFS过程中最关键的部分是加载到样品载体( 图2C)的样品制备方法。虽然这可能不是直观的,它是在在其上研究者有最大的控制的协议的步骤。高通滤波器的机器是强大的,并与正确使用和维护应产生的压力和温度的预期变化与样品之间的差异不大。如果样品制备过程中处理不当的话没有其他的步骤将赎回因此造成的损失。植物组织中是相当容易的操纵过程中这一阶段的过程中,这些都没有在培养基中培养,并在其细胞壁得到的细胞良好的强度。但却是非常重要的样品快速处理,以避免造成移离母体植物超微结构的变化,并限制压力和伤人的反应。最小的样品载体,可容纳的样品,应使用以确保有效和一致的HPF( 尤尔2C)。最后,将样品载体应该充满但不溢出( 图2D)。填充的样品载体被容易地插入HPF机冻结( 图2 H和I)。

在QFS协议的第一个步骤,可以为初学者挑战性,因此,建议两个人应该一起工作,直到用户习惯使用的程序( 图3A-E)。护理应液氮操作和固定剂的四氧化锇和乙酸双氧铀时,应考虑在所有时间。一个典型的曲线为QFS期间的温度变化示于图2J中 。的温度迅速上升,从-196℃,液态氮的温度下,以约-80℃。它是在温度左右-78℃至-90℃的该冷冻替代被认为是发生9。在QFS协议之一有挑战性的步骤为2小时的FS后除去干冰。在这一步,​​样本处理不当,可产生温度激增。对于这一点,加热器块应迅速提升出使用cryoglove和干冰的QFS室的迅速倒入一个辅助容器。

HPF已被用来解决各种植物组织包括本塞姆氏烟草叶和拟南芥叶片和胚胎。这是具有挑战性的修复,从成熟叶片的样品,由于大多数细胞的中央大液泡。年轻的叶中含有小空泡,但皮毛通常是相当密集。毛状体的存在可以使难以收拾用酵母膏的样品,但必须小心,以确保这是正确完成,以尽量减少空气的叶片表面和膏之间的残留量。被困的空气会阻碍高通滤波器中的热传递,降低固定的质量。这适用于任何样品。

经过高通滤波器和QFS的样品可以在VI准备透射电镜下,尤文通过渗透和树脂包埋。的65-100 nm的薄的部分然后可以通过分段来制备。典型的结果示于图4中所示的图像是所有从拟南芥叶样品。质膜是典型的光滑和对细胞壁按压,良好的固定标志( 图4A,C和E)。其它细胞器包括叶绿体( 图4A,D,F和H)和类囊体( 图4B),线粒体( 图4D和F),高尔基( 图4 G),微管( 图4E)和核糖体(特别是图4C)也清晰可见的大的中央液泡保持完整( 图4A)。在HPF-QFS结果中的工件,包括冰晶体诱导的损伤( 图4D)和质壁分离( 图4H)差的处理。铅沉淀也可能部分染色过程中形成S( 图4F)。

图1
图1:Wohlwend紧凑型02高压冷冻(一)用于冷冻固定与连接的计算机终端的Wohlwend紧凑型02 HPF机样本被插入到前面的机器(小圆圈)的冻结。温度曲线可以在电脑屏幕上每一个运行中产生的,因为用户期望的(B)为高通滤波器运行一个典型的温度-压力曲线。黄色和紫色线表示的温度和压力分别。注意两条曲线的陡峭山坡上。高压力保持为约400毫秒。在x轴上的每个间隔代表50毫秒。数据收集与EasyScopeII的DSIM12软件(C)的绝缘盖盒用于存放Ø˚F冷冻样品冷冻后可方便地放置在顶部的高通滤波器的机器。它充满了液氮。圆形铝制容器保持冷冻管。

图2
图2:为HPF制备组织样品。 (一)为紧凑型02 HPF机在其闭合结构的样品座(B)试样夹持器是开放的(C)在A型标本载体的0.2 mm孔叶样品。此载体的另一侧为0.1mm深(D)包括在酵母膏的叶样品。需要注意的是,载体是充满但不溢出的(E)中的试样保持器的试样载体(F)将样品覆盖有B型载体。此载体具有一个平坦表面和在另一侧的清楚为0.3毫米深。这里的平坦表面,用于夹持试样(G)的样品保持器被关闭并准备用于插入到HPF机。(H)上的HPF仪器的前部的孔进入其中的试样夹持器将被插入的冷冻(I)的温度和压力传感器/支架插入HPF机。(J)为QFS运行一个典型的温度曲线(与EasyLog软件收集的数据)。温度记录每个第二。在运行开始时的尖峰是由于该探针的电子设备中使用,并不能反映真实的温度测量。

图3
图3:在QFS使用设备 QFS可以进行任何隔热容器,如聚苯乙烯泡沫塑料箱或冰桶(A)的<。/ STRONG>干冰1-2厘米深的层覆盖QFS室的底部,在这里保丽龙箱(B)为13毫米的孔加热器块中的QFS用家样本。与数字数据记录器的温度探针(C)放置在加热器块。冷却用液氮将样品放置在该块中的加热器块后,将液态氮倒出,并且将整个组件放置在QFS室,与干冰(D)的QFS室充满干冰以使样品被覆盖;有以覆盖与干冰整个加热器块没有缺点(E)的框被覆盖,然后转移到旋转摇动器在通风橱中,其中样品在整个QFS过程搅拌。

图4
4:拟南芥叶由HPF-QFS准备在蔡司天秤座200 HT FE管委会编制的HPF-QFS和成像利用TEM样品获得的结果(A)中高倍率影像呈现出叶绿体(CH)与细胞壁细胞质相邻小区。液泡(五)含有电子致密物。比例尺= 0.5微米(B)高倍率叶绿体的形象。比例尺= 100纳米(C)相邻的单元之间的细胞壁的高放大率图像。支链胞间连丝是可见的(箭头)。注意,由液泡压向细胞壁的光滑质膜。细胞质密集挤满了核糖体。 V是液泡。液泡膜光滑,连续的。比例尺= 200nm的(D)低放大倍数图像表示在叶绿体(CH)良好定影的冰损坏(星号)的区域附近的区域。比例尺= 0.5微米(E)细胞沃尔玛的高倍镜视野L和微管。比例尺= 100纳米(F)图片显示出良好的保存叶绿体(CH)和线粒体(M)的。大量黑色沉淀物是染色切片用柠檬酸铅。比例尺= 1微米。高尔基(GA)(g)条高倍镜视野。比例尺= 200纳米。(H)不良保存的样品显示缺乏叶绿体和质壁分离(黑色箭头)的详细信息。比例尺= 1微米。

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Discussion

这里介绍的协议的成功在很大程度上依赖于该用户。首先,需要提前准备,以确保所有必要的材料都是现成的,并以足够的量来完成整个HPF-QFS运行。第二,用户必须迅速,从步骤到步骤移动以最小化的样品处理以有效的方式,从而减少改变的组织的天然状态。一旦样品被冻结,他们是脱水之前就必须让它们保持低温,所以必须小心,以避免任何处理,可以在不经意间升温的样品,例如,处理一个戴着手套的手,而不是预先冷却的镊子。速度和效率提高与熟悉的协议,所以实际上运行在尝试解决一个感兴趣的样品之前建议。第三,用户必须仍然知道的化学制品在FS培养基中,以及用液氮和干冰作业的危险中使用的危险。通风橱是必要的FS介质的制备和为QFS程序。对于所有其他步骤,必要的个人防护装备,包括手套,实验室外套,封闭趾鞋和护目镜建议。

用化学固定剂的冷冻固定,而不是在室温下制备的样品的透射电子显微镜,包括植物的优点,人们早就知道10。对比烟草拟南芥的固定HPF或化 ​​学固定剂根尖超微结构的研究发现,将HPF-FS方法给远优于结果5。在编写HPF-FS组织质膜和其他细胞膜是平滑的,质膜是对细胞壁冲洗,一般的细胞器,包括微管保存较好时相比,样品固定用常规方法。大豆根瘤的另一项研究由缓冲戊二醛的结论是,“化学固定不保留大豆根瘤超微结构的状态允许的结构和功能。的相关性“并继续说,唯一可用的选择是HPF-FS 2。胞间连丝的膜结合的通道,植物细胞连接到他们的邻居,但其下部是难以解决的,即使在透射电子显微镜。冷冻固定由HPF或与丙烷喷冷冻后的FS被选择了化学固定的研究旨在阐明plasmodesmal结 ​​构18的细节。尽管这些早期的研究结果,对传统固定组织的TEM研究仍处于植物科学规范。这可能是由于一个简单的遵守传统方法或对HPF-FS设备联接到所述长的制备时间为当前使用的FS协议看似高昂成本。

为QFS的过程中加快了15透射电镜样品制备最近的创新。 QFS已用于制备全C.线虫N.冷冻固定15 本生后离开。这些都是比较厚的样品被固定由HPF,以及制备烟草样品通过HPF-FS的历来使用非常长的FS的12,13,14。对于此协议中,我们已经从模型植物拟南芥中使用叶。对于长的FS次烟草和其它植物样品的基本原理是,溶剂与水的交换很可能是由细胞的大液泡减缓。然而,可以预期,一个良好的冷冻样品的失透应导致对细胞损害最小(15和参。在其中)。如果发生冰损坏它是由冷冻本身,而不是QFS最有可能引起的。对于财政司司长在更短的协议已经报15。这种超快速的FS(SQFS)只使用90 FS分钟。在这个协议中,在加热块将样品以100rpm在没有干i旋转行政长官没有覆盖SQFS室。这允许样品达到-80℃迅速。然后将样品从加热块中取出并且使其达到在摇臂室温。 SQFS已被成功地用于脱水中培养和大肠杆菌生长的细胞大肠杆菌细胞。我们还没有尝试使用SQFS与植物样品由于植物组织的厚度。

该协议cryofixing,然后脱水植物样品的串联高通滤波器和QFS表示显著改进当前的协议。时间为树脂渗透之前的样品制备,现在减少到几个小时,而不是数天。除了 ​​开发QFS方法15,麦当劳也于日前公布了植物组织与树脂下列SQFS的快速渗透的协议没有干冰19。植物组织通常缓慢地由几个长的孵化,包括隔夜浸润树脂。这些新的原COLS导致更短的样品处理时间:6小时从冷冻到切片。因此,在未来,HPF-QFS,快速渗透的组合应该替换为TEM植物样品制备目前的协议。此外,QFS过程使用共同的实验室设备是便宜的,并且可以用于多种用途,但商业QFS套件目前可通过电子显微镜科学(http://www.emsdiasum.com)。任一选项是一个巨大的节省了购买一个专用的冷冻替代单位,可以花费超过50000美元的成本。

但是应当注意的是,制备由HPF样品的应用和FS延伸超出常规TEM分析。以这种方式制备的样品保持其抗原性,并且可以在基于抗体的方法,因此可以使用,包括免疫标记17,19。也可用于先进的三维结构分析这些样品通过电子断层扫描20。 HPF-FS样品甚至可以用来与相关光及EM 21,22。因此,持续的改善的程序cryofixing然后脱水样品将是各种各样的调查员在不同的系统中的工作是有益的。

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Acknowledgments

加州大学伯克利分校的肯特麦当劳博士的善良和慷慨是极大的赞赏。我们感谢匿名审稿人非常有帮助的建议。伯奇 - 史密斯的实验室正在启动从田​​纳西大学的​​资金支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine Technotrade International, Inc HPF02 With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers Technotrade International, Inc 290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A Technotrade International, Inc 241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B Technotrade International, Inc 242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 Chart
Baker's yeast The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC OMEGA Engineering Inc. OM-EL-USB-TC  Replacement battery purchased separately
Temperature probe Electron Microscopy Sciences 34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker Fisher Scientific 11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 Ted-Pella Inc. 15076
Pink dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Cryogenic vials 2 ml Electron Microscopy Sciences 61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps Several pairs

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References

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