جيل من

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الأمعائية س. YSU تنمو في الجلوكوز الحد الأدنى من الأملاح المتوسطة. يتم إنشاء Auxotrophs عن طريق تحويل ذلك مع transposome الذي إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف. تم العثور على المسوخ بواسطة الطلاء المتماثلة من المتوسطة معقد إلى الحد الأدنى من المتوسط. يتم تحديد جينات الانقاذ توقفت بسبب الجينات وتسلسلها.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أنموذجية التغذي البكتيريا تنمو على M-9 الأملاح الحد الأدنى تستكمل المتوسطة مع الجلوكوز (M-9 المتوسطة)، والذي يستخدم كمصدر للكربون والطاقة. يمكن أن تتولد Auxotrophs باستخدام transposome. المتاحة تجاريا، TN 5 transposome -derived المستخدمة في هذا البروتوكول يتكون من شريحة خطي من الحمض النووي الذي يحتوي على R6K أصل النسخ γ، جين المقاومة الكانامايسين واثنين تسلسل الفسيفساء تنتهي، والتي تكون بمثابة ترانسبوزاز ملزمة المواقع. وtransposome، على النحو المنصوص عليه مجمع بروتين DNA / ترانسبوزاز، هو عرض بواسطة الصعق الكهربائي في سلالة بدئية الاغتذاء، الأمعائية س. YSU، ويشتمل على نفسها عشوائيا في جينوم هذا المضيف. Transformants هي نسخة مطلية على لوريا، Bertani أجار لوحات تحتوي على كانامايسين، (LB-اساسه) وعلى لوحات أجار M-9 متوسطة تحتوي على كانامايسين (M-9-اساسه). تعتبر transformants التي تنمو على لوحات LB-اساسه ولكن ليس على لوحات M-9-أن يكون اساسه auxotrophs. الجينومية النقىيتم هضم الحمض النووي من عوني التغذي جزئيا، و ligated وتحولت الى البير + الإشريكية القولونية (إي كولاي) سلالة. تكرار أصل R6Kγ يسمح البلازميد إلى تكرار في البير + E. سلالات القولونية، والمقاومة علامة كانامايسين تسمح لاختيار البلازميد. كل المحولة يمتلك البلازميد جديد يحتوي على ينقول يحيط بها المنطقة الكروموسومات انقطاع. سانجر تسلسل والأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) تشير إلى الهوية المفترضة من الجين توقف. هناك ثلاث مزايا لاستخدام هذه الاستراتيجية الطفرات transposome. أولا، أنها لا تعتمد على التعبير عن الجينات ترانسبوزاز من قبل المضيف. الثاني، هو عرض transposome إلى المضيف الهدف بواسطة الصعق الكهربائي، وليس عن طريق الاقتران أو عن طريق التنبيغ وبالتالي أكثر كفاءة. ثالثا: تكرار أصل R6Kγ يجعل من السهل تحديد تحور زالشم الذي تعافى جزئيا في البلازميد المؤتلف. هذه التقنية يمكن استخدامها للتحقيق في الجينات المسؤولة عن الخصائص الأخرى للالأمعائية س. YSU أو من مجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية.

Introduction

أنموذجية التغذي البكتيريا تنمو في M-9 الأملاح التي تحتوي على الحد الأدنى من متوسط ​​الجلوكوز (M-9 المتوسطة)، وتحويل الجلوكوز من خلال مسارات الأيض الكربون المركزية لتوليد السلائف، مثل الأحماض الأمينية، والأحماض النووية والفيتامينات، ل1 الحيوي. M-9 المتوسطة يحتوي على كلوريد الأمونيوم كمصدر النيتروجين والفوسفات والبوتاسيوم والصوديوم كمنطقة عازلة ومصدر الفوسفور، كبريتات المغنيسيوم كمصدر الكبريت والجلوكوز كمصدر للكربون والطاقة. لوريا، Bertani (LB) متوسطة غنية في الأحماض الأمينية من تريبتون والفيتامينات وعوامل النمو من خلاصة الخميرة. وهو يدعم نمو auxotrophs التي لا يمكن توليف الأحماض الأمينية والفيتامينات وعوامل النمو الأخرى المطلوبة للنمو على M-9 متوسطة. وبالتالي، سوف prototrophs تنمو في LB M-9 والمتوسطة، في حين auxotrophs سوف تنمو في LB المتوسطة ولكن ليس في M-9 متوسطة. من خلال تقديم الطفرات في عدد السكان بدئية الاغتذاء من البكتيريا وتحديد الجينات الطافرة التي تسبب الظواهر بعامل نمائي، هو بوssible للحصول على فهم أفضل لعملية الأيض في سلالة بكتيرية.

ويمكن استخدام ينقول الطفرات لتحديد العديد من الجينات المطلوبة للنمو على مستوى السكر في M-9 متوسطة. الترانسبوزونات إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف 2. قبل اكتشاف transformants ينقول على لوحات أجار LB نسخة والطلاء لهم على لوحات M-9 المتوسطة أجار، فمن الممكن للكشف عن auxotrophs. يتم تحديد جينات توقف من خلال إنقاذ الجينات. تستخدم هذه الدراسة متاحة تجاريا تينيسي 5 -derived transposome التي يتم شحنها كحل للشريحة الحمض النووي ينقول الخطي مختلطة مع البروتين ترانسبوزاز. قطاع DNA تفتقر إلى الجين ترانسبوزاز ولكن يحتوي على الجينات المقاومة الكانامايسين، وهو R6K تكرار γ المنشأ واثنين من الزخارف الفسيفسائية التي هي تسلسل الحمض النووي لترانسبوزاز ملزم في نهاية كل قطعة 3،4. منذ يتم إضافة بروتين ترانسبوزاز مباشر على الحمض النووي، والجزء الحمض النووي وحدهيعرف بأنه ينقول، ويعرف مجمع بروتين DNA / ترانسبوزاز باسم transposome. وحولت transposome بواسطة الصعق الكهربائي 5 إلى المضيف حساسة الكانامايسين (الشكل 1A). المستعمرات التي تنمو على لوحات أجار LB تحتوي على كانامايسين (LB-اساسه) لديها إدراج ينقول (الشكل 1B)، ونسخة مطلية transformants التي لا تنمو على M-9 لوحات المتوسطة أجار التي تحتوي على كانامايسين (M-9-اساسه) هي auxotrophs (Figire 1C). الحمض النووي الجيني من المسخ هو النقى ويهضم جزئيا مع 4-قاعدة تقييد القطع نوكلياز داخلية، الاتحاد البلغاري CI (الشكل 1D). يتم تحويل الحمض النووي و ligated الى سلالة من القولونية (إي كولاي) الذي يحتوي على الجينات البير (الشكل 1E). يسمح هذا الجين البلازميد جديد يحتوي على ينقول والمنطقة المحيطة الكروموسومات المضيفة لتكرار في E. القولونية 6. ويعمل هذا الجين المقاومة الكانامايسين مثلعلامة جدير بالانتخاب لالبلازميد الجديد. أخيرا، تسلسل باستخدام بادئات مكملة لبعضها نهاية ينقول والأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) 7،8 تحليل تسلسل الناتجة تستخدم لتحديد هوية الجينات توقف.

وتنص هذه الاستراتيجية transposome الطفرات ثلاث مزايا 3. أولا، لأن البروتين ترانسبوزاز لا بد مباشرة إلى ينقول، الإدراج لا يعتمد على التعبير عن الجينات ترانسبوزاز داخل المضيف. مرة واحدة يدمج ينقول نفسه في جينوم المضيف، مع تدهور ترانسبوزاز، ومنع حركة إضافية لينقول. ومع ذلك، حركة إضافية لا يمكن منعها إذا كان المضيف يمتلك الذاتية عنصرا transpositional تينيسي 5. ثانيا، إدخال transposome بواسطة الصعق الكهربائي يجعل من الممكن استخدامها في مجموعة واسعة من المضيفين. كما أنه يزيل الحاجة إلى إدخال ينقول طريق الاقتران البكتيري أو السادسإصابة راؤول. تتطلب كلتا العمليتين قابلية المضيف. ثالثا، إدراج الجينات المقاومة الكانامايسين وR6K تكرار γ الأصل في transposome يجعل من الاسهل لتحديد الجين توقف. المناطق ينقول انقطاع ويمكن تخزين والتسلسل كما البلازميدات، مما يلغي الحاجة إلى استخدام سلسلة رد فعل البلمرة العكسية (PCR) تقنية لتحديد الجينات.

بروتوكول المعروضة في هذا الفيديو يصف كل خطوة لينقول الطفرات من الأمعائية س. YSU 9 باستخدام transposome من عرضه في الخلايا البكتيرية إلى تحديد الجين المفترض أنها توقفت. بالإضافة إلى البروتوكولات نشرت سابقا 3،4،10، يتم عرض طرق مفصلة لاستخدام الطلاء طبق الأصل للكشف عن auxotrophs. ويمكن استخدام هذه التقنية الطفرات عن التحقيق في الظواهر الأخرى، مثل المضادات الحيوية والمعادن المقاومة، في أنواع مختلفة من البكتيريا، لIDENTifying عدد ضئيل من الجينات المطلوبة للنمو في ظل ظروف ثقافة المحددة في دراسات علم الأحياء الاصطناعية، أو لتعليم عنصرا مختبر لعلم الوراثة أو علم وظائف الأعضاء بالطبع الميكروبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Electroporation للخلايا المختصة 5،11

  1. تمييع لO / N ثقافة LB من الأمعائية س. YSU 1/20 إلى 50 مل من الطازجة المتوسطة LB وتنمو مع اهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية إلى التطوير التنظيمي (600 نانومتر) بين 0.4 و 0.6. اختياريا، وتنمو سلالات بكتيرية أخرى في درجة حرارة النمو الأمثل لها.
  2. هدئ الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 7،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل طاف، resuspend الخلايا في 50 مل من الماء المعقم البارد الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 7000 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة.
  4. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في حجم جليد الماء البارد مساويا لحجم بيليه الخلية. للتخزين على المدى الطويل، وغسل الخلايا مع 10 مل من الجليد الباردة بنسبة 10٪ (V / V) الجلسرين، resuspend في أي حجم بيليه مساو من الجليد الباردة بنسبة 10٪ (V / V) الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية، وذوبان الجليد على الجليد قبل Electroporation لل.
  5. إضافة 0.5 ميكرولتر من transposome إلى 40 ميكرولتر منالخلايا. يتم توفير حل transposome متاحة تجاريا في تركيز الحمض النووي من 0.33 ميكروغرام / ميكرولتر. على الرغم من 0.33 ميكروغرام يوصى، 0.165 ميكروغرام DNA كافية.
  6. ضع الخليط خلية / transposome في البرد الجليدي، 0.2 ملم، كفيت electroporation والاستفادة من هذا المزيج على الجزء السفلي من كفيت. صدمة الخلايا عند 25 μF، 200 Ω، و 2.5 كيلو فولت. للتأكد من أن الخلايا تبقى المبردة، تخزين cuvettes Electroporation للفي -20 درجة مئوية الثلاجة قبل الاستخدام.
  7. على الفور، إضافة 960 ميكرولتر من فلتر تعقيم مرق السوبر الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) متوسطة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا ونقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب.
    ملاحظة: هذه الخلايا تبدأ في الموت بعد الصدمة، ولكن الملح في المتوسط ​​SOC يسمح لهم باسترداد. للاقتصاد، فإنه ليس من الضروري إضافة transposome أو لصدمة الخلايا السيطرة السلبية. فقط إضافة 960 ميكرولتر من العقيمة المتوسطة SOC إليها.
  8. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية وأو 45-60 دقيقة مع اهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة. وهذا يوفر الوقت للtransposome لتتحد مع جينوم المضيف وللخلايا للتعبير عن المقاومة الكانامايسين.
  9. نشر 100 ميكرولتر من الخلايا على لوحة أجار LB-كان واحتضان لوحة O / N عند 30 درجة مئوية. تخزين مزيج التحول المتبقية في الثلاجة على 4 درجات مئوية. تنتشر كميات إضافية في وقت لاحق تصل إلى 2 أسابيع بعد Electroporation للالأولي إذا لزم الأمر.

2. Gridding من Transformants

  1. الشريط على الشبكة لغطاء علبة فارغة 100 × 15 مم طبق بتري. نسخ من شبكة "دورة قصيرة في علم الوراثة البكتيرية" (12).
  2. رسم خط على الجزء السفلي من لوحة أجار LB-اساسه. استخدام قطعة صغيرة من الشريط لتثبيته على غطاء الشبكية بحيث يكون مرئيا من خلال شبكة آغار. تأكد من أن الخط على الجزء السفلي من لوحة تتماشى مع أعلى، وسط الشبكة. ترسيخ وحة مع الشريط يحفظه من الانزلاق، والسماح لحتى gridding. خط يسهل التعرف مستعمرة بعد الطلاء طبق الأصل.
  3. اختيار المحولة واحد مع المسواك العقيمة وبقعة في وسط ساحة في الشبكة. مجرد لمس مستعمرة والبقعة. لا حفر مسواك في أجار. لتجنب تلويث لوحة، والتعامل مع مسواك فقط في نهاية واحدة.
  4. بقعة المحولة آخر في ساحة مجاورة كما في الخطوة 2.3. عندما لوحة ممتلئة، احتضان عليه O / N عند 30 درجة مئوية. هذه هي اللوحة الرئيسية.

3. طبق الطلاء لتحديد النمط الظاهري عوني التغذي 12

  1. لكل لوحة التي تم الشبكية، وجعل كومة من ثلاث لوحات جديدة أجار مرقمة واحد من خلال ثلاثة: واحد للLB-كان، اثنان لM-9-اساسه وثلاثة لLB-اساسه. تجف لوحات رأسا على عقب، O / N، عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. رسم خط على رأس كل لوحة كما في الخطوة 2.2.
  3. مسح أداة الطلاء المتماثلة مع 70٪ من الإيثانول، ضع مربع القطيفة معقمة على الجزء العلوي من الطلاء طبق الأصل لرأ والمشبك مربع القطيفة أسفل. يد تعج الميكروبات حتى بعد غسلها. منع دخول الميكروبات الملوثة عن طريق التعامل مع الساحة القطيفة من قبل حافته.
  4. محاذاة خط على لوحة رئيسية مع خط مرسوم على المشبك ووضع لوحة على الجزء العلوي من مربع القطيفة. تطبيق ضغط لطيف على نقل البكتيريا من لوحة إلى ساحة القطيفة. يجب الحرص على عدم تشويه البكتيريا. إزالة لوحة رئيسية من الساحة القطيفة.
  5. محاذاة الخط الذي رسمته على لوحة رقم واحد مع خط على المشبك ووضعه على قمة الساحة القطيفة. تطبيق ضغط لطيف على نقل البكتيريا من الساحة القطيفة لوحة. إزالة لوحة رقم واحد.
  6. تجاهل مربع القطيفة في كوب من الماء ومكان نظيف ومعقم مربع القطيفة على أداة الطلاء طبق الأصل كما في الخطوة 3.3. هذه الخطوة يمنع الإفراط في التلقيح الذي يسبب نمو اختراق ونتائج إيجابية كاذبة.
  7. محاذاةخط على لوحة رقم واحد مع خط على المشبك ووضعه على قمة الساحة القطيفة جديد. تطبيق ضغط لطيف لنقل البكتيريا من لوحة رقم واحد على الساحة القطيفة. إزالة لوحة رقم واحد.
  8. محاذاة الخط الذي رسمته على لوحة رقم اثنين مع خط على المشبك ووضعه على قمة الساحة القطيفة. تطبيق ضغط لطيف على نقل البكتيريا من الساحة القطيفة لوحة رقم اثنين. إزالة لوحة رقم اثنين.
  9. كرر الخطوة 3.8 لوحة رقم ثلاثة. اللوحة الثالثة هي السيطرة على نقل كامل من لوحة رئيسية لالأخريين لوحات. تجاهل مربع القطيفة في كوب من الماء. إعادة استخدام الساحات القطيفة، الأوتوكلاف الكأس التي تحتوي على الساحات القطيفة الملوثة، وغسلها، وتجفيفها، والانتهاء منها في رقائق الألومنيوم وإعادة الأوتوكلاف-لهم.
  10. احتضان لوحات عند 30 درجة CO / N. وتعتبر المستعمرات التي تنمو على حد سواء لوحات أجار LB-اساسه لكنه يفشل في النمو على لوحات M-9-أن يكون اساسه auxotrophs (
  11. خط خارج auxotrophs من لوحة رقم واحد على لوحة جديدة أجار LB-كان، واحتضان لوحة عند 30 درجة CO / N.
  12. خط خارج لعزل 3 مستعمرات من لوحة خط في خطوة 3.11 على لوحة LB-اساسه جديدة. احتضان لوحة عند 30 درجة CO / N. هذا يضمن أن متحولة معزولة جيدا. تقسيم اللوحة إلى الثلثين ومسحة من كل مستعمرة في مقطع واحد.
  13. المستعمرات بقعة من المستعمرات يشوبه من المستمدة من الخطوة 3.12 على لوحة LB-اساسه جديدة لتشكيل الشبكة كما في الخطوات 2،1-2،4. يتم إعادة اختبار كل متحولة في ثلاث نسخ.
  14. تكرار لوحة مرة أخرى كما هو الحال في الخطوات 3،1-3،10 لتأكيد النمط الظاهري عوني التغذي.

4. جين الإنقاذ

  1. تنمو 3 مل O / N ثقافة مستعمرة معزولة متحولة من الخطوة 3.13 في السائل المتوسطة LB اساسه عند 30 درجة مئوية. تنقية الحمض النووي الجيني من 1 مل من ثقافة استخدام الجينومية طقم تنقية الحمض النووي المتاحة تجاريا.
  2. انشاء خليط من 0.025 Uالاتحاد البلغاري CI تقييد نوكلياز داخلية و 14 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / الحمض النووي الجيني ميكرولتر في رد فعل 20 ميكرولتر على الجليد. منذ BFU CI يقطع ينقول في اثني عشر موقعا مختلفا، قد يكون أكثر كفاءة في استخدام نوكلياز داخلية التقييد، منتدى بواو الاسيوى الأول أو الثالث هاي، الذي يقطع ينقول في اثنين وثلاثة مواقع مختلفة، على التوالي.
  3. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ثم في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإبطال نشاط الإنزيم. تحليل 3 ميكرولتر من الحمض النووي يهضم جزئيا على هلام الاغاروز 0.8٪ (الشكل 3). والنتائج الناجحة الهضم جزئية في مسحة من فوق 10 كيلو بايت وصولا الى الجزء السفلي من هلام.
  4. Ligate 15 ميكرولتر من المهضوم جزئيا الحمض النووي الجيني باستخدام 800 وحدة من T4 DNA يغاز في رد فعل ميكرولتر 500. احتضان رد الفعل O / N عند 4 درجات مئوية. حجم رد فعل كبير يزيد من ربط شظايا واحدة لنفسها ويقلل من التفاعل بين اثنين أو أكثر من شظايا الحمض النووي.
  5. Precipitaالشركة المصرية للاتصالات الحمض النووي و ligated من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 5.5 و 1 مل من الايثانول 95٪ وذلك في احتضان -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  6. Microfuge الحمض النووي في 4 درجات مئوية و 13500 x ج لمدة 10 دقيقة، ويغسل بيليه مع الايثانول 70٪، جففه في فراغ المكثف الطرد المركزي، و resuspend في 10 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز. بدلا من ذلك، فإن الحمض النووي يمكن تجفيفها في الهواء RT لمدة 15 دقيقة.
  7. استخدام 4 ميكرولتر من الحمض النووي معلق لتحويل E. كولاي سلالة ECD100D البير أو ECD100D pir116 بواسطة الصعق الكهربائي كما في القسم 1. R6k تكرار γ أصل يتطلب سلالة بكتيرية مع جين بير لتكرار 6. نتائج سلالة البير في البلازميدات نسخة منخفضة، وسلالة pir116 تحتوي على الجين الطافر بير الذي ينتج في البلازميدات نسخة عالية. يحتوي كل المحولة البلازميد الجديد مع ينقول ومنطقة من الصبغي انقطاع (الشكل 1E).
  8. Inoculأكل 5 مل من المتوسط ​​LB اساسه مع مستعمرة واحدة، تنمو O / N مع اهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، وتنقية DNA البلازميد من يا كامل / N ثقافة استخدام عدة التجارية.
  9. استيعاب 14 ميكرولتر من البلازميد باستخدام تقييد نوكلياز داخلية Xho أولا تأكد من أن الحجم النهائي للتفاعل هو 20 ميكرولتر. يعترف هذا الانزيم موقع في منتصف ينقول في نهاية 5 'من الجينات المقاومة الكانامايسين. تحليل 10 ميكرولتر من عسر الهضم ويهضم البلازميد على agarose هلام 0.8٪ (الشكل 3). يتكون البلازميد من 2 كيلوبايت ينقول بالإضافة المرافقة DNA المضيف.

5. تسلسل الحمض النووي

  1. تسلسل البلازميد باستخدام طقم المتاحة تجاريا التسلسل، الاشعال التي هي مثلي أن كل نهاية ينقول، ونظام تحليل التسلسل الشعري. بدلا من ذلك، قد يتم شحنها البلازميد إلى مؤسسة خارجية للتسلسل.
  2. استخدام معيار الوزن الجزيئي (1 كيلوبايت سلم) فيهلام لتقدير حجم البلازميد. ثم، تقدير عدد نانوجرام (نغ) البلازميد ما هو مطلوب لمدة 50 fmol.
  3. قياس تركيز الحمض النووي البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي في موجات من 260 نانومتر (A 260) و 280 نانومتر (A 280). ضمان طول مسار الضوء من خلال كفيت هو 1 سم. تحديد تركيز بضرب الامتصاصية في 260 نانومتر بنسبة 50 نانوغرام / ميكرولتر. سوف DNA البلازميد جودة عالية لديهم 260 / A 280 النسبة بين 1.8 و 2.0.
  4. حجم الحمض النووي المطلوبة لكل رد فعل التسلسل هو عدد نانوغرام اللازمة ل50 fmol مقسوما على تركيز البلازميد. مزيج حجم البلازميد المطلوبة مع الماء لجلب إجمالي حجم ما يصل الى 10 ميكرولتر.
  5. تسخين الخليط DNA البلازميد / الماء عند 96 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ثم تبريده لRT.
  6. إضافة 8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي من عدة التسلسل و 2 ميكرولتر من 1.6 ميكرومتر واحد من الاشعال التسلسل.
  7. فلانخفاض البروتوكول من عدة التسلسل لبرنامج cycler الحرارية وتنظيف التفاعل.
  8. تحليل كل عينة باستخدام نظام تحليل الحمض النووي الشعرية.
  9. استخدام مجموعة من البرامج المتاحة تجاريا لعرض تسلسل الحمض النووي. البحث عن تسلسل "5'-GAGACAG-3"، "وهو BP 7 الأخير من ينقول (الشكل 4). تسلسل قبل نهاية 5 'من هذا القطاع 7 BP ينتمي إلى ينقول. تسلسل بعد 3 'نهاية هذه الشريحة 7 BP ينتمي إلى جينات توقف.
  10. تحديد وظيفة الجينات المحتملة للتوقف باستخدام الأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) 7،8. استخدم التالي link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . لصق سلسلة من المقاطعةإد جين في خانة البحث، حدد "الآخرين" في إطار قاعدة البيانات وانقر على "انفجار" في أسفل الصفحة. عندما تظهر النتيجة، انتقل لأسفل الصفحة لعرض نتائج المحاذاة (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحويل الأمعائية س. YSU بواسطة الصعق الكهربائي مع transposome بدأت عشوائي الجينوم الإدراج في جينوم المضيف (الشكل 1A، B). وElectroporation للنجاح أثمرت عدة آلاف من transformants التي نمت على لوحات LB-اساسه. للحصول 300-400، المستعمرات في لوحة متباعدة بشكل جيد، تم تحسين كمية انتشار خليط التحول على كل لوحة أجار LB-اساسه. يتضمن كل المحولة واحد على الأقل إدراج ينقول، ولكن لم يتضح ما اذا انقطع جين مهم للنمو على M-9 وسيط وبدون فحص بواسطة الطلاء طبق الأصل. تم نقل Transformants لوحات LB-اساسه جديدة في شبكات 88 و نسخة مطلية على M-9 متوسطة. ملاحظة، للتأكد من أن يتم الحفاظ ينقول في transformants، قسم البروتوكولات توصي مضيفا كانامايسين لوحات متوسطة M-9. لم تستكمل المتوسط ​​M-9 مع الكاناميسين في هذه الحالة، ولكن كان لا يزال من الممكن الحصول على auxotrophs دون ذلك. في (الشكل 1C). إلا أن 86 مستعمرات أخرى لا يكون لها انقطاع في الجين الذي هو مطلوب للنمو على M-9 الحد الأدنى من المتوسط.

قد تكون ملوثة بعض المستعمرات مع المستعمرات المجاورة خلال تصفيح نسخة. لعزل متحولة بوصفها ثقافة نقية، كان يشوبه من لوحة رقم LB اساسه واحد في الخطوة 3.1 على لوحة أجار LB-اساسه الطازجة ونمت O / N عند 30 درجة مئوية. كان يشوبه ثلاث مستعمرات التي انبثقت في الصعود إلى الثانية الطازج لوحة LB-كان ونمت O / N عند 30 درجة مئوية. ثم، شوهد مستعمرة واحدة التي نشأت من كل من المستعمرات الثلاثة على ثلث جديدة لوحة LB-اساسه. طبق الطلاء ليعيدوه إلى M-9 الحد الأدنى ميديأم لوحة التحقق منها ثلاث نسخ في النمط الظاهري العوز الغذائي الذي لوحظ في الشكل 2. ومن بين transformants ينقول 1760 فحص في 2013 الميكروبية الفسيولوجيا بالطبع، كانت 23 auxotrophs.

ثم تم التعرف على الجين توقف من عوني التغذي الانقاذ باستخدام الجينات. كانت تزرع مستعمرة بعامل نمائي من لوحة خط الثانية فوق (الخطوة 3.13) O / N في المتوسط ​​LB-كان، وتنقية الحمض النووي الجيني من الثقافة باستخدام الجينومية طقم تنقية الحمض النووي. أظهر الاغاروز الكهربائي للهلام أن الحمض النووي النقي كان أكبر من 10 كيلو بايت في حجم (الشكل 3، 2 لين). لكسر الحمض النووي الجيني إلى أجزاء أصغر التي تحتوي على ينقول والمناطق المحيطة توقف المضيف (الشكل 1D)، تم هضمها جزئيا مع 0.025 وحدة من الاتحاد البلغاري لCI 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه التخفيضات نوكلياز داخلية التقييد في 5'-GATC-3 مواقع "والتي تحدث تقريبا كل 200-500 أزواج القواعد. حتى وإن كان هناكهي اثنا عشر 5'-GATC-3 مواقع "داخل ينقول، فإن عددا كبيرا من الشظايا التي تحتوي على ينقول سليمة والمرافقة جينوم المضيف يكون ما زال موجودا في الحمض النووي يهضم جزئيا. حارة 3 من الشكل 3 يبين هضمها جزئيا الحمض النووي الجيني مع مسحة من الحمض النووي ابتداء فوق 10 كيلو بايت، وصولا إلى الجزء السفلي من هلام إلى أقل من 0.5 كيلو بايت. إذا بدأت مسحة DNA أقل من 2 كيلو بايت، حجم ينقول، ثم تم استيعاب الدنا كثيرا. سيكون من الضروري أن تقلل من كمية الإنزيم المضافة، على 37 درجة C الوقت الحضانة، أو كليهما. إذا لم يكن هناك تشويه وحارة مع الحمض النووي يهضم هو نفس حجم الحمض النووي DNA مع عسر الهضم، ثم حدث لم الهضم. سيكون من الضروري زيادة كمية الإنزيم المضافة، وفترة حضانة 37 درجة مئوية أو كليهما. بدلا من استخدام الاتحاد البلغاري CI، قد يكون من الممكن استخدام تقييد endonucleases منتدى بواو الاسيوى أنا أو هاي الثالث، الذي قطع ينقول في اثنين وثلاثة مواقع مختلفةعلى التوالي. استخدام واحدة من هذه الإنزيمات قد يزيد من E. القولونية البير + التحول العائد خلال إنقاذ الجينات.

كان ligated الحمض النووي المهضوم جزئيا في رد فعل 500 ميكرولتر. هذه الزيادة في حجم التقليل من التفاعلات بين شظايا الحمض النووي الأخرى وتعظيم احتمال أن كل جزء و ligated مع نفسها لتشكيل جزيء دائري. وقد عجلت الحمض النووي و ligated وتحولت بواسطة الصعق الكهربائي في E. كولاي سلالة pir116 ECD100D. انتشر هذا الخليط التحول على لوحات LB-اساسه. المستعمرات التي نمت الواردة البلازميد الجديد يتألف من ينقول ومنطقة من الجينات المضيف توقف (الشكل 1E). تراوح عدد الوحدات تشكيل مستعمرة من 0 إلى 2000 لكل مل من مزيج التحول. إذا المشفرة المنطقة المحيطة الكروموسومات البروتين الذي كانت سامة للE. المضيف القولونية، كانت كفاءة التحويل منخفضة أو فقط جزء صغير من الصبغيبعض ارتبط البلازميد الجديد. تم تنقيته بلازميد الحمض النووي من الثقافة التي تم تلقيح مع المحولة واحد وهضمها مع نوكلياز داخلية التقييد، Xho الأول، الذي اعترف موقع واحد في وسط ينقول قرب نهاية 5 'من الجينات المقاومة الكانامايسين. حارة 4 في الشكل (3) يتضمن البلازميد عسر الهضم وحارة 5 احتواء البلازميد هضمها. وذلك لأن الحمض النووي البلازميد المنقى يميل إلى أن يكون supercoiled، فإنه هاجر بمعدل أسرع من نفس حبلا من الحمض النووي الخطية هضمها. كان حجم الصحيح من هذا البلازميد 3 كيلوبايت. أنها تحتوي على 2 كيلو بايت من ينقول، بالإضافة إلى حوالي 1 كيلو بايت من الجين المضيف توقف. إذا كان الحمض النووي المضيفة المرافقة يحتوي على مواقع اعتراف واحد أو أكثر Xho الأول، وسيراعى في اثنين أو أكثر من الفرق بلازميد في الممر مع Xho أنا هضم الحمض النووي.

ويبين الشكل 4 نتيجة التسلسل لالبلازميد الذي تم عزله من عوني التغذي. بعد إزالة شوRT تسلسل ينقول في جريئة، قدم تسلسل الحمض النووي المضيفة للتعليم الأساسي المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) تحليل 7،8. واقترح أحد نتائج الانفجار الذي انقطع تسلسل يشبه إلى subsp الأمعائية المذرقية. المذرقية NCTC 9394 (EMB | FP929040.1 |) الجيني للموتاز chorismate، التي تشارك في التركيب الحيوي من L-التيروزين والفنيل الأنين-L (الشكل 5) (13). أحيانا خلال ربط الحمض النووي الجينومي هضمها جزئيا، وينقول الخطي ligates إلى واحد أو أكثر من غيرها من أجزاء الاتحاد البلغاري CI. هذا يمكن أن يؤدي الانفجار مربكة لأن هوية الجينات تتغير فجأة. على سبيل المثال، أول 41 أزواج قاعدة عوني التغذي آخر الملائمة لجين الغلوتامات-5-ألدهيد نصفي نازعة التي تشارك في البرولين الحيوي 1. ثم، والقادمة 219 أزواج قاعدة الملائمة لجين حدة فرعية ريبونوكليوزيد-اختزال ثنائي فسفات، تليها شريحة الزوج 62 قاعدة للدهن-A-disacc كيناز haride. من 295 قطعة زوج قاعدة الماضي مطابقة لالغلوتامات-5-نازعة ألدهيد نصفي مرة أخرى. اقترح وجود 5'-GATC-3 مواقع "الاتحاد البلغاري لCI أن اثنين من شظايا الحمض النووي الصغيرة و ligated في البلازميد إنقاذهم. وبالتالي، التخفيف من الحمض النووي يهضم جزئيا للتفاعلات الربط لا يلغي تماما الخلفية الناجمة عن ربط شظايا أصغر. من هذه النتائج، خلص إلى أن transposome إدراج نفسها في الجين لالغلوتامات-5-نازعة ألدهيد نصفي لأن تسلسل لهذا الجين كان متاخم لينقول. وتضمنت auxotrophs أخرى انقطاعات في الجين لياز cystathione بيتا المشاركة في التخليق الحيوي ميثيونين. لنازعة histidinol المشاركة في الحامض الاميني الحيوي. لالفوسفاتيز phosphoserine المشاركة في سيرين، الجلايسين والسيستين الحيوي. ومقابل كيتول حمض reductoisomerase المشاركة في ليسين، آيسولوسين وحمض أميني أساسي الحيوي 1.

الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 1
الشكل 1. ينقول الطفرات. (أ) الخلايا البكتيرية التي تحتوي على الجين الذي هو مطلوب للنمو على M-9 الأملاح التي تحتوي على الحد الأدنى من المتوسط ​​الجلوكوز. ومحاصر M-9 يمثل الجين العوز الغذائي. وقدم (ب) transposome في السلالة البكتيرية بواسطة الصعق الكهربائي، والبروتين ترانسبوزاز بد أن نهاية كل الفسيفساء (السهام) إدراج عشوائيا ينقول في كروموسوم المضيف 3،4. سوف تحتوي فقط ينقول transformants تنمو على لوحات متوسطة LB-اساسه. (C) وtransformants هي نسخة مطلية على M-9 المتوسط ​​تحتوي على الجلوكوز والمتوسطة LB اساسه. وtransformants التي لا تنمو (عبرت التدريجي) على M-9 المتوسطة التي تحتوي على السكر وauxotrophs. (D) يتم تنقية الحمض النووي الجينوم من auxotrophs وهضمها جزئيا مع cutt 4-قاعدة إيه، الاتحاد البلغاري CI، الذي يعترف الموقع DNA، 5'-GATC-3 ". (E) يتم التعامل مع الحمض النووي يهضم جزئيا مع T4 DNA يغاز وتحويلها بواسطة الصعق الكهربائي في E. القولونية سلالة ECD100D البير لتشكيل البلازميد الجديد الذي يحتوي على ينقول والجينات الصبغية توقف وهو مطلوب لتحقيق النمو على M-9 متوسطة. يسمح الجين البير لشظايا الحمض النووي دائرية تحتوي على R6K تكرار γ الأصل في ينقول لتكون بمثابة تكرار الأصل في البلازميد الجديد 6. ويعمل هذا الجين المقاومة الكانامايسين كعلامة لاختيار البلازميد الجديد. يتم تنقية البلازميد، و~ 500 تسلسل الجين بي بي انقطاع يتم تحديد باستخدام بادئات (الأسهم) التي هي مثلي أن كل نهاية ينقول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

EP-together.within صفحة = "دائما"> الرقم 2
الشكل 2. طبق الاصل التصفيحات. (A) من transformants الشبكة التي نقلت إلى لوحة أجار LB-اساسه. (ب) من نفس الشبكة transformants التي نقلت إلى M-9 لوحة متوسطة. نمت Auxotrophs على لوحات LB-اساسه ولكن ليس على لوحات متوسطة M-9. ويتم تحديد هذه من خلال المربعات السوداء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الشكل 3. 0.8٪ الاغاروز جل لين 1: 1 كيلوبايت سلم. حارة 2: الحمض النووي الجيني غير المهضوم. حارة 3: الاتحاد البلغاري C I هضمها جزئيا الحمض النووي الجيني. حارة 4: غير المهضوم والذى بلازما انقاذمعرف. حارة 5: بلازميد Xho أنا هضمها إنقاذهم.

الرقم 4
4. معرفة تسلسل الحمض النووي الجزئي للالبلازميد. تسلسل بالخط العريض هو جزء من ينقول ولم يقدم لتحليل الانفجار. بقية تسلسل هو جزء من الجينات إنقاذهم من المضيف.

الرقم 5
الرقم 5. انفجار تحليل 7،8. وانطلاقا من قاعدة الأولى (سؤال)، يظهر الجين توقف على تشفير chorismate موتاز الأمعائية المذرقية، التي تشارك في الفينيل ألانين والتيروزين الحيوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطفرات ينقول باستخدام transposome هي أداة فعالة لتوليد auxotrophs في الأمعائية س. YSU وأنواع أخرى من غرام سلبي وغرام البكتيريا إيجابية 3،4. وقد بدأت هذه العملية عن طريق إدخال transposome -derived تينيسي 5 إلى المضيف بواسطة الصعق الكهربائي. لتحديد المستعمرات مع تدرج، وكان الهدف سلالة untransformed أن تكون حساسة لكانامايسين من أجل تحديد للعلامة المقاومة التي يحملها ينقول. بعض المضيفين تنتج نوكليازات الاقتطاع الداخلية التي تحط من الحمض النووي ينقول قبل أن تتحد مع جينوم المضيف. إضافة مثبط تقييد نوكلياز داخلية إلى هذا المزيج قد Electroporation للتقليل التدهور وزيادة الغلة التحول 3. في حين تستعد Electroporation للبكتيريا المختصة، كان من المهم لإزالة الكثير من الملح قدر الإمكان لمنع حدوث القوس الكهربائي أو الشرارة التي تقتل البكتيريا التي يسببها وجود الملح. حتى في غيابقوس كهربائي، بدأت الخلايا ليموت بسرعة بعد صدمة لهم. إضافة الملح تحتوي النمو SOC المتوسطة استعادتها فورا على التوازن الاسموزي، التقليل من موت الخلايا وزيادة كفاءة تحويل 5. وبعد ذلك رصدت كانامايسين transformants المقاومة على لوحة LB-اساسه الطازجة وطبق الأصل مطلي إلى M-9 الحد الأدنى المتوسطة أجار. لمنع الإفراط في التلقيح التي يمكن ان تسبب النتائج الإيجابية الكاذبة التي يغيب auxotrophs الممكنة، وقد تحولت الساحات القطيفة في الخطوة 3.6 قبل تم تلقيح ما تبقى من لوحات. ثم، خلال الطلاء طبق الأصل، تم تطبيق ضغط يكفي لنقل المستعمرات دون رتوش أو التسبب في التلوث بين المستعمرات المجاورة.

وقد تم تحديد الجينات الطافرة في auxotrophs من خلال إنقاذ الجينات. تم المنفصمة الحمض النووي الجيني من كل عوني التغذي باستخدام الهضم الجزئي مع قاعدة متكررة القاطع الاتحاد البلغاري C أولا الهضم الجزئي باستخدام لمنتدى بواو الاسيوى أنا أو هاي الثالث، الذي قطع TRansposon أقل في كثير من الأحيان، قد يحسن كفاءة ينقول التحول. ومن الممكن أيضا استخدام الهضم الكامل مع نوكليازات الاقتطاع الداخلية الأخرى، و 6 قاعدة وقاعدة 8 قواطع، التي تفتقر إلى مواقع داخل ينقول. تم الحمض النووي يهضم ثم و ligated وتحولت إلى E. كولاي سلالة ECD100D البير أو ECD100D pir116 6. على الرغم من أن E. تحولت كولاي سلالة pir116 بواسطة الصعق الكهربائي في الخطوة 4.8، فمن الممكن أيضا استخدام الخلايا المختصة كيميائيا. في هذه الحالة، يجب أن تنتشر تحول كله إلى الحصول على مجموعة كبيرة من البلازميدات انقاذ. يسمح الجين البير لينقول circularized لتكرار مثل عدد نسخة منخفضة البلازميد، ويسمح الجين الطافر pir116 ذلك لتكرار كنسخة بلازميد عالية. عوائد التحول منخفضة باستخدام سلالة pir116 قد يكون بسبب التعبير عن الجينات المنتجات السامة من المضيف الأصلي. ربما يتم تخفيض سمية باستخدام نسخة منخفضة البير يمكن أن تجعل تسلسل أكثر تحديا.

التسلسل الجينومي 10 و PCR التسلسل 14 طرق بديلة لإنقاذ الجينات. طريقة التسلسل الجيني تسلسلات المناطق المحيطة مباشرة الكروموسومات من الحمض النووي الجيني النقي. هذه الاستراتيجية مفيدة عندما تم بالفعل تسلسل جينوم الكائن الحي المستهدف. مرة واحدة وقد تم تحديد المنطقة التي كتبها التسلسل الجيني تحور والانفجار المنطقة بأسرها يمكن تضخيمها من قبل PCR والمستنسخة لمزيد من التحليل. يستخدم الأسلوب PCR اثنين وأربعة تفاعلات PCR الاشعال المختلفة. في أول رد فعل أزواج التمهيدي مثلي ينقول (التمهيدي 1) مع التمهيدي المنحطة التي تحتوي على الحمض النووي قصيرة، تسلسل رابط (التمهيدي 2). رد الفعل الثاني هو PCR PCR رد فعل متداخلة، الاقتران ينقول التمهيدي مثلي آخر (التمهيدي 3) مع مثلي التمهيدي تسلسل رابط (التمهيدي 4). الموقع فتيلة للالتمهيدي هو 3تقع على الجانب 3 "من الموقع فتيلة لالتمهيدي 1. ثم يتم تنظيف amplicand من رد فعل PCR الثاني صعودا والتسلسل. هذه الطريقة التسلسل الآلي تضخيم الحمض النووي مباشرة من خلايا متحولة، مما يلغي الحاجة لكلا الجيني تنقية DNA البلازميد والإنقاذ.

بدلا من تحديد الجينات المسؤولة عن auxotrophy، ينقول الطفرات يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة الظواهر الأخرى يعاير بسهولة. الأمعائية س. YSU هو سلالة بكتيرية مقاومة متعددة المعادن التي هي أيضا مقاومة 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (بيانات غير منشورة). لها الحد الأدنى من تركيز مثبط (MIC) عن HgCl 2 70 ميكرومتر، ZnCl 2 هو 800 ميكرومتر، آنيو 3 من 80 ميكرومتر وNaAsO 2 هو 14 ملم 9. بعد إدخال transposome في هذه السلالة وgridding transformants على لوحات LB-كان، المستعمرات الشبكية يمكن طبق الأصل مطلي على المعادن المتوسط ​​تحتوي على تركيزات أقل من MIC هذا bacteسلالة ريال. إنقاذ وتسلسل الجينات انقطاع من المسخ مع MIC خفضت قد تكشف عن وجود الجين الذي يمنح مقاومة واحدة من هذه المعادن.

بالإضافة إلى توليد المسوخ، وtransposome يمكن استخدامها كناقل في المختبر أو في الجسم الحي لتحديد المكسب من الجينات المهمة، مثل مقاومة المضادات الحيوية أو المعدن. للاستراتيجية في المختبر، الحمض النووي الجيني من الأمعائية س. يتم هضم YSU مع نوكلياز داخلية تقييد يعترف مواقع خارج ينقول. هو ligated الحمض النووي ومختلطة مع transposome في العازلة التي تحتوي على المغنيسيوم 2+. بعد إعادة التركيب بين ينقول وشظايا الجينومية عشوائية، E. يتم تحويل كولاي سلالة ECD100D البير مع الحمض النووي وتنتشر على لوحات تحتوي على الأمبيسلين أو الملح المعدني. والمستعمرات التي تنمو تمتلك البلازميد الجديد الذي يحتوي على ينقول تقع بجوار الجينات المقاومة للمضيف. لفي الجسم الحي الحادي وrategy، الأمعائية س. تتحول YSU مع transposome. ثم، ويزرع رد الفعل كله تحول في LB-اساسه المتوسطة السائل لتحديد لعدد كبير من السكان مع تدرج ينقول عشوائية. يتم هضم الحمض النووي الجيني مع نوكلياز داخلية تقييد يعترف مواقع خارج transposome، و ligated وتحولت إلى E. القولونية البير سلالة ECD100D. كما هو الحال في الطريقة في المختبر، وتنتشر على transformants الأمبيسلين أو لوحات معدنية. مرة أخرى، سيتألف البلازميد الناتجة من ينقول إدراجها بجانب الجينات المقاومة. سوف هاتين الاستراتيجيتين أن تكون ناجحة إلا إذا يمكن التعبير عن الجينات المقاومة المستهدفة، ونشط في E. سلالة القولونية.

يمكن استخدام ينقول الطفرات التعرف على عدد ضئيل من الجينات يتطلب سلالة بكتيرية لل15،16 النمو. يرجى ملء اثنين transposomes تحتوي على مواقع loxP وعلامات مقاومة المضادات الحيوية المختلفة لهذه الاستراتيجية طغ سلالة بكتيرية مع تسلسل الجينوم المعروفة. بعد دمج اثنين من الترانسبوزونات، أعربت لجنة المساواة العرقية recombinase يحفز رد فعل إعادة التركيب بين المواقع loxP اثنين، والقضاء على المناطق الكروموسومية بين ينقول الإدراج. معرفة تسلسل الجينوم يجعل من الممكن تحديد الجينات التي يتم استبعاد. القدرة على النمو وتبين أن الجينات القضاء ليست لازمة للنمو. هذه التقنية هي عمالة كثيفة، ولم يتم حتى الآن الانتهاء من الجينوم الحد الأدنى للنمو باستخدام هذه الاستراتيجية. ومع ذلك، قدرت دراسة الطفرات ينقول الآلي الزائفة الزنجارية باستخدام PCR التسلسل التي كانت مطلوبة 300-400 الجينات لنمو هذه البكتيريا في المتوسط ​​الغني 14. لم هذه الدراسة عدم استخدام نظام recombinase loxP / لجنة المساواة العرقية.

الميكروبات مع الحد الأدنى من الجينوم هي مفيدة لعلم الأحياء الاصطناعية 17. سلالة بكتيرية مع الحد الأدنى من الجينوم هو especiallذ مفيدة للقضاء على إنتاج المنتجات الثانوية غير المرغوب فيها. على سبيل المثال، يتم استخدام كلوستريديوم الأسيتوبوتيلية (C. الأسيتوبوتيلية) لإنتاج الوقود الحيوي، بيوتانول 18. أثناء نموها، هذه السلالة تنتج بيوتانول في نهاية مرحلة النمو الأسي فقط قبل أن يدخل مرحلة ثابتة. عند هذه النقطة، يصبح من حساسية للبيوتانول ومنتجات التخمر الأخرى وتشكل الأبواغ نائمة الذي وقف لتجميع المنتجات. منذ استخدمت transposomes لدراسة المطثية الحاطمة قد يكون من الممكن استخدام نظام transposome / loxP / لجنة المساواة العرقية recombinase مماثل لبناء سلالة من C. الأسيتوبوتيلية التي تفتقر إلى جينات غير مرغوب فيها بالنسبة للمنتجات التخمير وتبوغ، ولكن يحتوي على جينات أكبر بيوتانول التسامح. ان هذه السلالة زيادة الغلة المنتج مع الحد الأدنى من الملوثات.

في الخلاصة، توفر هذه المقالة مجلة الفيديو والظريف الكاملص بخطوة وصف الإجراءات المستخدمة لخلق auxotrophs بواسطة ينقول الطفرات. ويغطي إدخال transposome بواسطة الصعق الكهربائي، وفحص للطفرات بواسطة الطلاء طبق الاصل، وإنقاذ الجينات الطافرة التي كتبها تقنيات الاستنساخ وتحديد الجينات توقفت بسبب تسلسل الحمض النووي. هذه التقنية يمكن أن تستخدم لتحديد وظيفة الجينات المجهولة أو ربما بناء السلالة البكتيرية التي يمكن أن تستخدم في العمليات الصناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكاتب ليس لديه ما يكشف.

Acknowledgments

يود الكاتب أن أشكر كل من بلدي الجامعية المستقلة طلاب البحوث وكل من بلدي الميكروبية الفسيولوجيا طلاب الدراسات العليا الذي اختبر أفكاري ينقول الطفرات خلال فصول الربيع 2010-2014. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل قسم العلوم البيولوجية في جامعة ولاية يانجز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18, (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16, (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138, (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24, (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7, (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59, (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108, (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90, (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79, (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30, (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36, (9), 1127-1138 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics