Imaging intracellulaire Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Astrocyten alomtegenwoordig en overvloedig gliale cellen van de hersenen. Het staat vast dat astrocyten dienen vitale ondersteuning en homeostatische functies, waaronder buffering van K + concentratie in de extracellulaire ruimte, de opname van neurotransmitters, evenals het verstrekken van voedingsstoffen. Echter, recente studies tonen aan dat ze ook [Ca 2+] i signalen, die spontaan ontstaan ​​en worden verhoogd met neuronale activiteit 1 weer te geven. Het bestaan ​​van astrocyten [Ca 2+] i signalering is steeds gedacht aan de communicatie met neuronen activeren en als zodanig is geïnterpreteerd als een vorm van "Ca 2 + prikkelbaarheid" in astrocyten. De beschikbare gegevens over de laatste twee decennia suggereren twee standen waarin astrocyten en neuronen mogen, misschien in een bidirectionele wijze. Eerst, astrocyten reageren vaak met een stijging van [Ca 2,] wanneer geactiveerd door neurotransmitters enneuromodulators vrijgelaten uit neuronen 2. Tweede, [Ca 2+] i verhogingen astrocyten veroorzaakt het vrijkomen van signaalmoleculen van astrocyten die op hun beurt invloed neuronen en bloedvaten. Er zijn aanwijzingen dat moleculen vrijkomen van astrocyten leiden tot veranderingen in de functie van synapsen, circuits en uiteindelijk gedrag 3-5 via astrocyten tot neuron signalering. Echter, dit blijft een snel groeiende onderzoeksgebied, en het is betoogd dat een beter en gedetailleerd inzicht in astrocyten [Ca 2+] i is nodig om een aantal van de huidige onzekerheden 6 lossen.

In vroeger werk, werd aangetoond dat het laden van bulk van organische Ca 2+ indicator kleurstoffen in astrocyten niet in slaagt om op betrouwbare wijze te detecteren [Ca 2+] i signalen binnen gehele astrocyten in de cultuur en in situ 7-10. Deze bevindingen zijn besproken door ons en anderen 6,11,12. De Emerging beeld is dat [Ca 2+] i signalen binnen astrocyten (bv, takken en twijgen), die de primaire sites voor interacties met neuronen en bloedvaten zijn, zijn zelden onderzocht in detail. Onlangs is het gebruik van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) zoals cytosolische GCaMP3, GCaMP5G en GCaMP6 en plasmamembraan gebonden versies (bijvoorbeeld Lck-GCaMP3) heeft de studie van [Ca 2+] i signalen toegestaan ​​in kleine compartimenten van astrocyten, zo dun processen, in de buurt van het plasmamembraan en binnen de gehele gebieden 7,8. Echter, GECIs één nadeel op organische Ca2 + indicator kleurstoffen en dat de vereiste genetische methoden om de coderende genen selectief leveren in astrocyten in vivo gedurende perioden van weken de GECIs adequaat zijn uitgedrukt. Expressie in vivo wordt meestal bereikt met behulp van transgene muizen, knock-in muizen of met virus gebaseerde levering appkakkerlakken. In de huidige Jupiter artikel rapporteren we methoden en procedures gebruikt om GECIs leveren aan het striatum astrocyten gebruik van adeno-geassocieerde virussen. Wij richten ons op cyto-GCaMP3 als voorbeeld, maar dezelfde basisprocedure werkt voor andere GECI of fluorescent eiwit gebaseerde reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke protocollen waren in overeenstemming met de Amerikaanse National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de UCLA.

1.1) Bereid Micropipet en AAV2 / 5 Virus Laden

  1. Gebruik fijne borosilicaatglas micropipetten voor de injectie van het virus. Trek de micropipet met een tweestaps trekken programma met een verticale trekker. Bevel de pipet onder een hoek van 40 ° met behulp van een pipet slijpmachine. De pipet die ideaal is voor gebruik een tip diameter van 20-40 urn en een schachtlengte van 6-7 mm. Autoclaaf de pipet en chirurgische instrumenten. De boor wordt gesteriliseerd door bestrijken met 70% ethanol.
  2. Bewaar het virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml) bij -80 ° C in 10 pi aliquots. Vlak voor de operatie, neem de fracties uit de vriezer en bewaar op ijs tot gebruik voor het vullen van the micropipet.
  3. Vul de micropipet met virus met een injectiepomp. Aansluitbare verbinding ene uiteinde van een stuk slang, via een geschikte grootte buis knelkoppeling met een glazen spuit met een versterkte plunjer. Bevestig de autoclaaf micropipet aan het andere uiteinde van het buisstuk met een geschikte grootte verwisselbare naald knelkoppeling.
  4. Voordat de virale vector, verwijdert luchtbellen uit het pompsysteem zoals slang, spuit en micropipet door het vullen van het systeem met minerale olie gekleurd met Sudan rode IV (~ 1 mg / 50 ml) in een 1 ml injectiespuit met een naald (27 G ).
  5. Leg een schoon stukje parafilm onder het glas micropipet, en afzien van 5-10 ul van de virale vector op de parafilm.
  6. Zuig de virale vector in door de zuiger van de spuit naar achteren 0.5 pl / min en markeer de grens tussen de vector en de olie op het glazen pipet.

1.2) Anesthesie, haar knippen, Head Fixatie en voorbereiding voor het Craniotomie

  1. Zet een muis (P49-63, C57BL / 6) in de kamer gevuld met N2 O en O 2 en 5% isofluraan. Beoordelen van de diepte van de anesthesie door het verlies van doelgerichte beweging en een vertraagde ademhaling (~ 60-90 / min). Snijd haar op het hoofd wanneer de muis wordt verdoofd.
  2. Plaats de muis in het stereotaxisch frame, met zijn hoofd beveiligd door botte oor bars en haar neus geplaatst in een verdoving en ventilatiesysteem. Handhaaf continue isofluraan bij 2 - 3%. Pas kunstmatige tranen zalf in beide ogen, omdat muizen verliezen hun knipperreflex onder narcose.
  3. Dien 0,05 ml van buprenorfine (0,1 mg / ml) subcutaan voor pijnbestrijding.
  4. Schoon operatiegebied met 10% povidonjood en 70% alcohol driemaal afwisselend de twee oplossingen en ab povidonjood. Start vanaf de voorzijde en veeg naar de achterkant aan een al gesneden haren te verwijderen.
  5. Maak een incisie in de huid op de top of de kop die begint tussen de ogen en eindigt tussen de oren.

1.3) craniotomie en micro-injecties

  1. Verwijder het periost door te vegen met een wattenstaafje en droog het oppervlak van de schedel met tandheelkundige katoenen ballen. Maak een markering rond de injectieplaats, en boren rond de rand van het merk met behulp van een klein stalen braam aangedreven door een high speed boor.
  2. Verwijder het bot en reinig het oppervlak met een zoutoplossing.
  3. Plaats de pipet in de linker dorsale laterale striatum met de volgende coördinaten (mm): anterior-posterior 0,8, mediaal-laterale: +2.0, rug-buik van de pial oppervlakte: -2.4 13. Merk op dat deze coördinaten dat het uiteinde van de micro-injectie naald ligt net boven de dorsolaterale striatum (Figuur 1A, B), waardoor het nauwelijks doordringt binnen deze kern. Schadelijke bloedvaten te voorkomen. Als de pipet gebeurt er recht op een bloedvat te zijn, iets aan te passen decoördinaten van ~ 0,1-0,2 mm.
  4. Begin injectie met injektiesnelheid ingesteld op 0,2 pl / min en meestal injecteer 1 tot 1,5 gl virus.
  5. Laat de pipet in de plaats na de injectie gedurende 10 min, en trekken vervolgens de pipet langzaam.
  6. Eindig door het sluiten van de operatiewond met doorlopende hechting externe nylon hechtdraad.

1.4) Recuperatie

  1. Zet de muis in een schone kooi op een verwarmingselement voor 24 uur. Heeft een muis die een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot ze volledig hersteld niet meer terug. Laat de muis onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden.
  2. Voeg Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml per 500 ml water, dat 40 mg trimethoprim en 200 mg sulfamethoxiazole) in het water voor een week. Dien Buprenorfine twee keer per dag gedurende 3 dagen na de operatie.
  3. Handhaving van de muis op een 12 uur licht-donker cyclus, gevoed en dagelijks besproeid, eennd wordt eenmaal per dag tot gewogen tot 3 dagen na de operatie. In deze 3 dagen wordt elke muis met een verlies van meer dan 10% lichaamsgewicht beschouwd als aangetast en wordt gedood plaats worden onderworpen aan experimenten.
  4. Afzonderlijk, verandert de muis kooi twee keer per week, en monitor voor de algemene gezondheid ten minste eenmaal per dag. Gewoonlijk wordt de muis gebruikt binnen 2 - 3 weken na stereotactische micro-injecties.

2. Acute Brain Slice Voorbereiding voor confocale Ca 2+ Imaging

2.1) Voorbereiding van het snijden en recording oplossingen.

  1. Bereid snijden oplossing die (mM): 194 sucrose, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 D-glucose, 1 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 en 26 NaHCO3 verzadigd met 95% O2 en 5% CO2.
  2. Bereid opname oplossing die (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glucose, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 NaHCO3; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2. Vul de hersenen slice houden beker met opname-oplossing, en houd het bij 34 ° C.

2.2) Snijdende

  1. Twee tot drie weken na stereotaxische micro-injecties, diep en terminaal verdoven de muis, en vervolgens onthoofden.
  2. Pak de hersenen, en gebruik een mes om de niet-geïnjecteerde rechterhersenhelft te verwijderen en monteren van de linker naar de vibratome lade met behulp van superlijm. Vul het vibratome lade met ijskoude buffer snijden en houd verzadigen met 95% O2 en 5% CO2.
  3. Snijd coronale of sagittale striataal plakjes hersenen bij 300 micrometer dik. Meestal 4-5 coronale, of 6 - kunnen 7 sagittale striatum plakjes worden verzameld.
  4. Breng de plakjes aan de slice houden beker opgewarmd bij 34 ° C, en ze daar te houden gedurende 30 minuten voordat ze op te slaan bij kamertemperatuur gedurende de daaropvolgende recording.
  5. Incubeer de hersenen plakjes in geoxygeneerde opname buffer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten voor [Ca 2+] i beeldvorming.

3. immunohistochemie (IHC)

  1. Twee weken na injectie virus, perfuseren de muis transcardially met PBS, gevolgd door 10% formaline in PBS.
  2. Verwijderen, post-fix 's nachts, en cryoprotect de hersenen in gebufferde 30% sucrose gedurende minstens 2 dagen.
  3. Bereid 40 micrometer secties met behulp van een cryostaat microtoom.
  4. Spoel secties 3 keer met PBS bij 10 min interval.
  5. Incubeer secties voor 1 uur in PBS met 10% normaal geit serum en met 0,5% Triton X-100.
  6. Incubeer secties overnacht bij 4 ° C in primaire antilichaam bereid in PBS met 0,5% Triton X-100. De primaire antilichamen waren als volgt: kip anti-GFP 1: 1000, anti-muis S100β 1: 400, anti-muis NeuN 1: 600, muis anti-glutamine synthetase 1: 300.
  7. Spoel secties 3 keer met PBS bij 10 min intervallen.
  8. Incubeer secties met de secundaire antilichamen bereid in PBS met 10% normaal geit serum gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. De tweede antilichamen waren: geit anti-muis Alexa546 1: 500, geit anti-chicken Alexa488 1: 500.
  9. Monteer de onderdelen op glasplaatjes, droog en enkele druppels toepassen van antifade montage medium, dan langzaam bedekken de secties met een glazen dekglaasje. Bewaar de dia bij 4 ° C.
  10. Neem beelden op een confocale microscoop met een 40x olie-immersie objectief met een numerieke opening van 1.3.

4. Confocal [Ca 2+] i Imaging

OPMERKING: [Ca 2+] i beeldvorming werd uitgevoerd met een confocale microscoop met een 40X water immersie objectief met een numerieke apertuur van 0,8.

  1. Tussen 1 en 5 uur na het snijden, plaats slice in de opname kamer en superfuse met zuurstofrijk opname buffer bij kamertemperatuur met debiet van 1-2 ml permin. Plaats dan een platina harp met nylon koorden bovenop de slice om beweging te minimaliseren tijdens het experiment.
  2. Visualiseren en zoek het dorsale striatum met heldere veld luminescentie onder een 10X water immersie objectief.
  3. Schakel over naar de 40X water immersie objectief, en zet de 488 nm lijn van de Argon laser. Door het veranderen van de focal plane, vind cellen zich ongeveer 20 urn onder het stukje oppervlak, het weergeven van basale fluorescentie in soma, takken en twijgen. Van de nota, gecompromitteerd cellen meestal weer fluorescentie niveau boven het gemiddelde, dat dient te worden vermeden.
  4. Gebruik 'omlijsting scan' modus om het scannen te starten. Meestal is de laser intensiteit ingesteld op 0,5-5% van het maximale vermogen is voldoende om het [Ca2 +] i met cyto-GCaMP3. Voor het monitoren van [Ca 2+] i dynamiek in het hele grondgebied van astrocyten, de 'omlijsting scan' met een scansnelheid van 1 seconde per frame of sneller is recommended, maar dit moet worden beslist afhankelijk van het experiment betrokken.
  5. Indien nodig, op de foto [Ca 2+] i in processen, gebruik digitale vergroting van 2 - 2 astrocyten in het hele gezichtsveld - 3-voudige tot 1 monitoren.
  6. Aan verzadigde pixels tijdens de opname te voorkomen, gebruikt 'HiLo' lookup-modus om de cellen pseudocolor. Begin altijd met een "pilot-opname" voor ongeveer 5 min, om te testen of rode kleur verschijnt als indicatie van verzadiging. Als dat zo is, hoe lager de laser uitgangsvermogen, of verlaag de PMT / Gain / offset waarden en een andere piloot opnemen om te testen de pixel waarden zijn in de niet verzadigd assortiment voeren. Typisch, de gecombineerde parameters voor beeldvorming astrocyten [Ca 2+] i in het striatum zijn: laseruitgangsvermogen 0,5-5% (van 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gain 2,0 - 3,5 maal, en offset 0 - 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor astrocyt specifieke expressie van cyto-GCaMP3 in het striatum, gebruikten we adeno-geassocieerd virus (AAV) van het serotype 5, en de GFAP GfaABC 1 D-promotor (figuur 1A), waarvan eerder aangetoond robuuste GCaMP3 en reportergen expressie in de hippocampus en corticale astrocyten 8,14. Twee weken na virus micro-injectie in de muis striatum, de muis (~ 10 weken oud) werd geperfundeerd en IHC werd uitgevoerd op dunne hersenen secties cyto-GCaMP3 expressie in het striatum (Figuur 1B) evalueren. We hebben geconstateerd cyto-GCaMP3 behulp van GFP antilichamen en ook gekleurd de plakjes met een bekende astrocyte marker, S100β. Cyto-GCaMP3 expressie werd alleen gevonden in S100β positieve cellen. Geen expressie werd gevonden in neuronen gevisualiseerd NeuN (figuur 2A en 2B), wat suggereert astrocyt specifieke expressie. Belangrijk is cyto-GCaMP3 expressie gedetecteerd in ~ 60% van S100β positieve cellen (Figuur 2C).

Astrocytes reageren hersenen beledigingen zoals letsel, ischemie en infectie door het weergeven veranderingen die genoemd astrocyten reactiviteit, die een spectrum van mogelijke wijzigingen van mild tot ernstig 15 is geworden. We zochten om te evalueren of virus micro-injectie veroorzaakt openlijke astrocyten reactiviteit. Eerder werd aangetoond dat een verminderde expressie van glutamine synthetase (GS) geassocieerd met de reactieve astrocyten 16,17. Daarom GS expressie in het striatum van WT en virus geïnjecteerde muizen vergeleken. We vonden geen significante veranderingen in de GS-expressie in het striatum astrocyten volgende virus injectie (figuur 3A - C), aangeeft dat er geen openlijke astrocyte reactiviteit behulp GS levels als een metrische. Deze algemene aanpak zou kunnen worden uitgebreid in de toekomst werk te astrocyten reactiviteit te evalueren met behulp van andere markers van reactiviteit. Merk echter op dat GFAP niveaus een geschikte manier om de reactiviteit in striat meten niet kunnen wordenal astrocyten, omdat GFAP niet is uitgedrukt op detecteerbare niveaus in het striatum meeste astrocyten onder basale omstandigheden 18. Samenvattend, door IHC geconcludeerd cyto-GCaMP3 expressie robuust en specifiek voor astrocyten in het striatum, en dat virus injectie niet veroorzaakt astrocyten reactiviteit zoals bepaald met GS expressieniveau verandert.

We volgende voorbereid acute hersenen plakjes van virus ingespoten muizen te afbeelding [Ca 2+] i in het striatum astrocyten. Acute 300 urn sagittale of coronale plakjes werden bereid en na een periode van herstel van de segmenten in een opname kamer op een confocale microscoop voor [Ca 2,] beeldvorming met de 488 nm lijn van een Argon laser geplaatst. Striatale astrocyten expressie cyto-GCaMP3 gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd in de meeste (gewoonlijk alle) van de striatale plakjes (~ 6-7 plakken per muis), zoals deze zichtbaar groene fluorescentie vertoonden in cellen met duidelijk bushy morfologie (figuur 4 figuur 4A; tenminste 10 astrocyten tonen cyto-GCaMP3 kan worden afgebeeld en in figuur 4A worden uitgezet als Regions of Interest (ROI). Hogere vergroting beeldvorming met een extra digitale zoom van 2,0-3,0 was nodig om enkele astrocyten (Figuur 4B) te identificeren. Onder deze omstandigheden werden hele astrocyten gebieden geopenbaard door cyto-GCaMP3 expressie, zoals getoond in figuur 4B. Spontane Ca2 + signalen waren gemakkelijk gemeten in de somata en in de takken en twijgen van astrocyten 6.

Figuur 1
Figuur 1: Virale levering van GECIs (bijv cyto-GCaMP3) door AAV2 / 5 in de volwassen muis striatum. A. Schematische illustreert het protocol voor AAV2 / 5 micro-injecties in de dorsolaterale striatum.B. Toont de globale positie van de micro-injectie naald ten opzichte van het striatum en de coördinaten voor stereotaxische injecties. Het beeld van een Nissl-gekleurd schijfje in panel B is gedownload van ALLEN BRAIN ATLAS.

Figuur 2
Figuur 2: Cyto-GCaMP3 expressie specifiek striatale astrocyten. A - B. Vertegenwoordiger beelden waaruit blijkt dat cyto-GCaMP3 expressie colocalizes met een marker voor astrocyten (S100β) (B), maar niet met een marker voor neuronen (NeuN) (A) C. Samenvatting staafdiagram voor colocalization experimenten zoals die getoond. in A en B.

Figuur 3
Figuur 3: Cyto-GCaMP3 expressie in striatale astrocyten geen veranderingen in de expressie van GS veroorzaken.A - B. Vertegenwoordiger beelden van GCaMP3 en GS IHC uit muizen die AAV2 / 5 had ontvangen voor GCaMP3. Beelden voor controle niet-geïnjecteerde muizen ook getoond. C. Staafdiagram vat de resultaten van experimenten zoals in A en B (ns geeft niet significant met een ongepaarde Student's t-test, p <0.05).

Figuur 4
Figuur 4: Representatieve voorbeelden van [Ca 2+] i signalen die van striatale astrocyten met cyto-GCaMP3. Image z-stack zien 10 astrocyten (genummerd van 1 - 10) A. Een afgeplat .De sporen hieronder laten [Ca 2+] i signalen geregistreerd gedurende 5 min van de 10 cellen getoond in A B. Een afgeplat en ingezoomde z. image -stack voor een enkele astrocyte.The traceert hieronder laten [Ca 2+] isignalen geconstateerd gedurende 5 min voor het gemeenschappelijke getoond in B cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hierin beschreven werkwijzen hebben ons cyto-GCaMP3 in striatale astrocyten expressie in vivo voor daaropvolgende [Ca 2+] i beeldvorming in situ. Deze werkwijze heeft voordelen boven transgene of knock-in muizen, inclusief robuuste expressie van het doeleiwit, snelheid en flexibiliteit van de experimentele uitvoering en anatomische specificiteit. De expressie van GCaMP3 behulp AAV2 / 5 werd gevonden specifiek en robuust te zijn. De combinatie van GFAP GfaABC 1 D promoter van AAV serotype 5 is kritisch voor de specificiteit te bereiken. Een beperking van de hier beschreven techniek is dat virusinfectie en chirurgieprocedure astrocyt reactiviteit kan veroorzaken, vooral bij hoge titer virus 19. Belangrijk in de huidige studie, AAV2 / 5 micro-injecties met relatief lage titer niet afname GS die zijn geassocieerd met astrocyten reactiviteit 19 veroorzaken. Soortgelijke controles zijn gemeld voor hippocampal astrocyten 8. Het is echter belangrijk om de noodzaak van deze controles voor elk hersengebied nadruk te bestuderen, mede omdat astrocyten heterogeen 20, en omdat ze waarschijnlijk verschillende functies in verschillende hersengebieden.

Een van de belangrijke factoren die de robuustheid van de gerichte genexpressie middels virus microinjectie invloed kan de coördinaten in gebruik die varieert tussen verschillende muizenstammen en veranderingen in de ontwikkeling van de dieren. Alleen C57BL / 6 muizen ~ 8 weken oud werden gebruikt in deze studie. Het is ook aangetoond dat virale expressie van GFP in striatale neuronen en astrocyten in ratten worden gedetecteerd 4 dagen na injectie bereikt een plateau van 2 - 4 weken na injectie, en vervolgens stabiel gedurende 9 maanden 21 na injectie. Het tijdsverloop van de cyto-GCaMP3 meningsuiting is niet precies hier bepaald, maar ten minste twee weken voor het virus expressie zijnaanbevolen.

De aanpak van het gebruik van AAV2 / 5 gemedieerde expressie van GECIs in striatale astrocyten kan nu gebruikt worden om een beter inzicht astrocyten [Ca 2+] i signalering in het striatum. Specifiek, cyto-GCaMP3 expressieniveau voldoende hoog beeldvorming van [Ca 2+] i signalen in kleine populaties van astrocyten (~ 10 cellen) en in het totale grondgebied van één astrocyten mogelijk. De gedetailleerde analyse van [Ca2 +] i signalen is nog gaande, maar tot op heden [Ca 2,] signalen zijn gedetecteerd van distale processen zoveel ~ 50 urn van het soma (figuur 4). Gedetailleerde experimenten astrocyten [Ca 2+] i signalen en hun correlatieve en oorzakelijke functies binnen het striatum haalbaar. In de toekomst, verfijnde benaderingen (bijvoorbeeld promotors) nodig om GECIs leveren genetische gedefinieerde populaties van astrocyten zodat men kanverkennen calcium signalering binnen diverse populaties van astrocyten 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Het merendeel van het werk en het betrokken personeel werden ondersteund door NIH-subsidie ​​NS060677 en deels door NIH verleent MH099559 en MH104069 (naar BSK). Deel van het werk werd ook ondersteund door de CHDI Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  2. Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
  3. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  4. Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
  5. Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
  6. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  7. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
  8. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
  9. Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
  10. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
  11. Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
  12. Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. Waltham, MA. (2012).
  14. Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
  15. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
  16. Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
  17. Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
  18. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
  19. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  20. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  21. Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).

Comments

1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics