Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

We ontwikkelden een nieuwe methode met behulp van een seahorse XF-analyzer om het zuurstofverbruik direct te meten. Maar gemeenschappelijke proxy voor mitochondriale functie in acute slide slice van volwassen muizen. Deze methode meet een cel door energetica in puncties van anatomisch gedefinieerde hersenstructuren.

Het gebruik van acute plakjes bootst de fysiologische cellulaire omgeving na die niet kan worden bereikt op de manieren waarop geïsoleerde mitochondriale of kweekcellen worden geïsoleerd. Deze methode zal van breed belang zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington. Open om te beginnen de extracellulaire fluxtestkit en verwijder zowel de sensorcartridge als de gebruiksplaat.

Plaats vervolgens de sensorcartridge opzij en raak de sensoren niet aan. Voeg vervolgens 600 microliter kalibreeroplossing toe aan elke wand van de nutsplaat. Plaats de sensorcartridge bovenop de nutsplaat en dompel de sensoren onder in de kalibreeroplossing, zodat de driehoekige inkeping van het hulpprogramma en de sensorcartridgeplaat correct zijn uitgelijnd.

Sluit daarna de extracellulaire fluxtestkit af met afdichtingsfilm om verdamping van de kalibreerde oplossing te voorkomen en plaats deze vervolgens ‘s nachts in een incubator van 37 graden Celsius die niet is aangevuld met koolstofdioxide of zuurstof. Open de microplaat van eyelet capture en verwijder de oogjesplaat voor weefselzitting. Verwarm vervolgens een geschikt volume voorgeoxygeneerde gemodificeerde kunstmatige cerebrale spinale vloeistofbuffer tot 37 graden Celsius in een buis van 50 milliliter.

Voeg vervolgens BSA toe aan een eindconcentratie van vier milligram per milliliter om de ademhalingsbuffer voor te bereiden. Voeg voorzichtig 625 microliter ademhalingsbuffer toe aan elk putje van de oogplaat terwijl u de plaat niet schudt, zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de buffer van elke put. Ontleed onmiddellijk de hersenen in 10 milliliter ijskoude voorgeoxygeneerde snijoplossing.

Vervolgens, met behulp van een vibratome sectie coronale striatale plakjes, volgens de instructies van de fabrikant bij een dikte van 150 micrometer in ijskoude voorgeoxygeneerde snijoplossing. Herstel vervolgens de plakjes in 50 milliliter zuurstofrijk kunstmatig hersenvocht. En bewaar ze tot 30 minuten in oplossing bij kamertemperatuur.

Breng na herstel de plakjes over naar een petrischaaltje van 35 bij 10 millimeter met vijf millimeter ademhalingsbuffer. Met behulp van een roestvrijstalen biopsiepons creëer je een cirkelvormig stuk weefsel in het gewenste gebied van de gesneden hersenen door de pons zachtjes naar beneden te drukken terwijl het plakje in de buffer blijft. Verwijder vervolgens de rest van het weefsel, til de pons weg en verwijder het cirkelvormige stukje weefsel in de buffer.

Snijd vervolgens het uiteinde van een pipetpunt van één milliliter om een gat te maken met een diameter van één punt vijf tot twee punten nul millimeter en gebruik het om het geperforeerde segment vast te houden en over te brengen naar de bovenkant van het opnamescherm. Zuig een stuk geponst hersenweefsel af en plaats het weefsel voorzichtig op de gaaszijde van het opnamescherm, een cirkelvormig stuk plastic met het gaas aan één kant bevestigd. Droog met behulp van een papieren zakdoekje het vangscherm voorzichtig af en verwijder het vocht, waardoor het weefsel plakkerig wordt en aan het midden van het gaas wordt bevestigd.

Houd vervolgens de plakzijde van het opnamescherm naar beneden met een pincet en plaats deze in een van de putjes van de broedende oogjesplaat. Incubeer vervolgens de oogplaat bij 37 graden Celsius in een incubator gedurende ten minste 30 minuten om temperatuur- en pH-evenwicht mogelijk te maken voordat u de test uitvoert. Verdun de gewenste verbindingen en gemodificeerde kunstmatige cerebrale spinale vloeistof zonder BSA tot de uiteindelijke voorraadconcentratie van de werkconcentratie voor respectievelijk poort A tot en met D.

Laad voorzichtig 75 microliter van de verdunde verbindingen voor in de juiste injectiepoorten van de sensorcartridge door de uiteinden halverwege in de injectiepoorten te plaatsen in een hoek van 45 graden met de punt tegen de wand van de injectiepoort, omdat volledige inbrenging samengestelde lekkage door de poort kan veroorzaken. Trek daarna de uiteinden voorzichtig uit de poorten zonder luchtbellen te creëren en tik niet op een deel van de cartridge om luchtbellen te voorkomen. Inspecteer vervolgens visueel de injectiepoorten voor gelijkmatig laden, zodat alle vloeistof in de poort zit en er geen restdruppels bovenop de cartridge aanwezig zijn.

Nadat u de sensorcartridge op de gebruiksplaat hebt geplaatst, plaatst u deze gedurende 30 minuten in een incubator om deze tot 37 graden Celsius te laten opwarmen terwijl u voorzichtig hanteert door alleen de nutsplaat vast te houden en zo min mogelijk te bewegen. Laad eerst de testsjabloon in de software en druk vervolgens op de groene startknop. Plaats vervolgens de sensorcartridge op de gebruiksplaat in de instrumentenlade, zorg ervoor dat de plaat correct zit en plat is, en laad de met geneesmiddelen gevulde sensorcartridge in de analysator voor kalibratie.

Volg daarna de instructies op het scherm om te kalibreren. En de sensoren in evenwicht brengen. Zodra de equilibratiestap is voltooid, verwijdert u de kalibratieplaat en vervangt u deze door de oogplaat met het gaas en de plakjes weefsel.

Meet vervolgens het zuurstofverbruik in elke put van de plaat, met behulp van de testprotocollen zoals beschreven in het manuscript. Analyseer vervolgens de meetgegevens van het zuurstofverbruik en de efficiëntiegegevens van de koppeling. Zuurstofverbruikssnelheden voor verschillende diktes en ponsgroottes van plakjes in de controlegroep vertoonden een stabiele basale ademhaling over de hele meting en waren evenredig met het volume van de plak.

Bovendien was het zuurstofverbruik gedurende vijf uur relatief stabiel met minder dan 10% rundown. De mitochondriale koppelingsefficiëntie werd vergeleken en de plak met een dikte van 150 micrometer en een ponsgrootte van 1,5 millimeter vertoonde de hoogste koppelingsefficiëntie. De zuurstofverbruikssnelheden werden gemeten voor jonge en oude groepen Pink1 knock-out en hun leeftijdsgematchte wild-type muizen.

Het basale zuurstofverbruik was vergelijkbaar in zowel de knock-out- als de wildtypegroepen voor jonge muizen. Het nam echter af voor de knock-out muizen in de oude groep. De mitochondriale disfunctie bij de knock-out muizen werd echter waargenomen voor de jonge leeftijdsgroep, aangegeven door de verminderde koppelingsefficiëntie veroorzaakt door de knock-out van Pink1.

De kritieke stappen in dit protocol omvatten het voorbereiden van hersensegmenten, het overbrengen ervan naar de bovenkant van het opnamescherm, het plaatsen van dia’s in putjes en het vasthouden aan het opnamescherm tijdens de metingen.