Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

För att studera human akut lungskada och lunginflammation, är det viktigt att utveckla djurmodeller för att efterlikna olika patologiska funktioner i denna sjukdom. Här har vi utvecklat en mus lungmodell skada genom intratrakeal injektion av bakterier Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa eller PA). Med hjälp av denna modell, kunde vi visa lunginflammation vid den tidiga fasen av skada. Dessutom har alveolära epitelbarriären läckage observeras genom att analysera bronkoalveolärt lavage (BAL); och alveolär celldöd observerades Tunel analys med användning av vävnad framställt från skadade lungor. Vid ett senare skede efter skada, observerade vi cellproliferation som krävs för reparationsprocessen. Skadan löstes 7 dagar från initieringen av P. aeruginosa injektion. Denna modell efterliknar den sekventiella förlopp lunginflammation, skador och reparationer vid lunginflammation. Detta kliniskt relevant djurmodell är lämplig för att studera patologi, mekanismen för reparation, ffter akut lungskada, och kan också användas för att testa potentiella terapeutiska medel för denna sjukdom.

Introduction

Lungor exponeras för miljömässiga patogener och är mottagliga för inflammation och skada 1-3. Under patologiska tillstånd såsom lunginflammation eller andnödssyndrom (ARDS), patogener samt inflammatoriska faktorer släpptes av leukocyter inducerar skador och dödsfall av alveolära celler 1-3. Det är viktigt att utveckla djurmodeller av akut lungskada för att underlätta studiet av patologin vid skada samt mekanismen för reparation.

För närvarande, de flesta människor använder hyperoxi och bleomycin-inducerad mus lungskademodeller 4. Men mekanismerna för hyperoxi vållat skada är inte samma sak som de flesta vanliga lungskador som uppstår vid lunginflammation eller ARDS 5. Bleomycin inducerad akut skada är sällsynt i ett kliniskt sammanhang 4. Här rapporterar vi en mus lungskada modell med intratrakeal injektion av P. aeruginosa 6,7. Denna modell är kliniskt relevant och härmar processes som händer efter lunginflammation 8.

Som en opportunistisk, nosokomial patogen av nedsatt immunförsvar, P. aeruginosa infekterar vanligen lungvägarna, urinvägarna, brännskador, sår, och orsakar även andra blodinfektioner 6. Bakterierna frisläpper virulensfaktor exotoxin A, multiplicera och utlösa immunsvar 6. Intra-trachael administration av P. aeruginosa speglar situationen i människors exponering för bakterier som orsakar lunginflammation och patologi sannolikt att skilja sig från den nyligen rapporterade influensaviruset H1N1 inducerad lungskada modell 9. Eftersom P. aeruginosa är en opportunistisk patogen, är det relativt säkert att hantera, jämfört med några av de mer virulenta patogener. Här har vi använt intratrakeal injektion för att administrera bakterierna eftersom vi observerat att denna metod införs fler bakterier i distala alveoler regionen av lungan jämfört mednågra andra förfaranden, såsom med hjälp av en kateter via munnen.

Jämfört med andra akuta modeller lungskada, P. aeruginosa modell som beskrivs här är lämplig för att studera lungskada inducerad av bakterier och av överdriven inflammation. Till skillnad från andra djurmodeller som använder P. aeruginosa att inducera sepsis 10,11, här använder vi intratrakeal injektion av dessa bakterier att inducera lokal akut lungskada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De djurförsök godkändes av Animal Care kommittén och institutionella biosäkerhetskommittéer vid University of Illinois i Chicago.

OBS: Alla procedurer som involverar pseudomonas bör utföras med biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) metoder, som inkluderar, men är inte begränsade till: mask, ögonskydd, klänning eller byxdress, och dubbla handskar. Arbeta i certifierad biosäkerhet skåp. Behandla instrument i kontakt med bakterier med blekmedel eller klordioxid baserade desinfektionsmedel. Använd en sluten låda för transportprover.

1. P. aeruginosa kultur och tillväxt

  1. Butiks P. aeruginosa PA103 såsom ett bakteriellt lager i en skruvkork cryovial vid -80 ° C.
  2. Placera flaskan i ett rack i en låda med 70% etanol fuktade pappershanddukar och ta till biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) laboratorium.
  3. Serie bakterierna på fårblod-agarplattor och växa vid 37 ° C under ~ 15 h i en inkubator. I ett BSL2 huva, skrapa bakterierna från plattan med bakterier slinga och återsuspendera i 5 ml PBS.
  4. Förvara lager vid 4 ° C i upp till 3 månader. Emellertid bestämma titern var 2 veckor.
  5. Seriellt späda bakterierna i PBS (vanligtvis från 1:10 4 till 1:10 7) och plattan ut den kända spädning på fårblodagar plattor.
  6. Inkubera plattorna under ~ 15 h. Räkna kolonier och beräkna kolonibildande enhet (CFU) för att bestämma bakteriekoncentrationen.
  7. Resuspendera lämpliga koncentrationer (~ 5 x 10 3 CFU / il) i 0,5 ml PBS i 1,5 ml sterila skruvlock kryokärl. Täta cryovials och placera dem i en cryovial rack på desinficerande lastade pappershanddukar i ett kick lock box.
  8. Transportera rutan till BSL2 djuranläggning. Väl där, öppna lådan i BSL2 skåpet.

2. P. aeruginosa Instillation

  1. Utför överlevnad kirurgi aseptiskt (sterila handskar, sterila instrumentoch aseptisk teknik). Använd en steril duk för att ge en arbetsyta för sterila (autoklaveras) kirurgiska instrument. Sterilisera instrumenten med hjälp av en varm pärla autoklav mellan varje luftrör instillaförfarande.
  2. Väg möss före anesthetization. Söva möss med ketamin (100 mg / kg), xylazin (5 mg / kg), i 0,1-0,2 ml PBS intraperitonealt (ip). Bestämma effektiviteten av bedövningsmedlet genom icke-mottaglighet till tå nypa. Använd en veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
  3. Hindra möss på en kirurgisk styrelse i BSL2 skåp.
  4. Identifiera området för snittet ner. Raka här området och förbereda huden med omväxlande alkohol och povidonjodid kompresser 3 gånger.
  5. Behandla snittet området med lokalbedövning (lidokain) eftersom detta anestesi är tillräckligt för en mindre operation, såsom en hud snitt för att få tillgång till luftstrupen.
  6. Gör ett litet snitt (ca 5 mm) vid mittlinjen av halsen, och använda trubbigt forceps att försiktigt röra muskeln för åtkomst till luftstrupen. Exponera luftstrupen genom kirurgisk dissektion.
  7. Rita bakterie lösningen i en 1 ml engångsspruta med 27 G nål. För varje mus, administrera 20-30 pl av bakterier vid lämplig koncentration (upp till 10 5 CFU varje mus).
  8. För in nålen i luftstrupen. Injicera lösningen långsamt in i luftrör.
  9. Se till att djuret flämtar, som vanligtvis tyder på att lösningen har nått in i lungan.
  10. Stänga såret med sterila suturer (6-0 monofilament) under aseptiska förhållanden.
  11. Använda 0,1 mg / kg buprenorfin genom subkutan injektion som postoperativ analgesi för att styra postoperativ smärta.
  12. Se till att den tid som krävs från initiala anestetisk induktion för incision lutningen är mindre än 15 min.
  13. Efter injektionen, kassera sprutor och nålar i lämplig biologiskt avfallsbehållare.
  14. Behandla kirurgiska instrument med klordioxid baserad DISInfectant för 15 minuter, skölj och återgå till labbet för sterilisering och återanvändning vid behov.
  15. Hus mössen ensamma i rena burar vid varm miljö.
  16. Kontrollera om djuret var 30 min tills den återfår medvetandet och börjar röra sig; och senare vid 12 timmars intervall för de första tre dagarna efter operationen.
  17. Hålla mössen i djuret BSL2 anläggningen under hela experimentet. Se till att bara vävnad som finns i tät låda lämnar djuret BSL2 anläggning. Om mössen uttrycka någon av de döende beteenden (definierade som andnöd, trötthet, bristande pendla som svar på skonsam stimulering) vid någon punkt i studien, euthanize möss genom CO2 inhalering från en flaska källa följt av halsdislokation.
  18. Avliva försöksperson genom blodtömning under narkos.
    1. Samla lungvävnad från avlivade möss. Utföra dessa förfaranden i en BSL2 huva. Vid behov överförs prov användning av slutna rör som placerats i en rack på desinficerande lastade pappershanddukar i ett kick lock låda för vidare process.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Från 24 till 72 timmar efter P. aeruginosa injektion, ökades cellularitet observerats i lungsektioner (Figur 1A-D). Lungan började återhämta sig från 96 timmar efter skadan (Figur 1E). Vid 7 dagar efter P. aeruginosa, normal alveoler morfologi till stor del återställd (figur 1F). Tunnel färgning använder lungsektioner beredd vid 24 timmar efter P. aeruginosa visade celldöd i alveolerna celler (Figur 1G-I). För att studera reparationsprocessen i denna skada modellen, var BrdU injicerades i möss vid tre dagar efter P. aeruginosa. Lungor isolerades vid 5 timmar efter BrdU injektionen och behandlas för BrdU antikroppar färgning. Såsom visas i figur 1J och K, signifikant ökat antal celler inkorporerade BrdU vid 72 h efter P. aeruginosa administrering indikerar hyperproliferation.

För att studera förändringen i barriären permeability och inflammation efter skada, bronkoalveolärt lavage (BAL) vätska samlades upp vid olika tidpunkter efter P. aeruginosa injektion. Proteinkoncentrationen i BAL ökades signifikant vid 48 timmar efter P. aeruginosa injektion (figur 2A), vilket tyder på epitelial barriär otätheten. Cell nummer i BAL ökade också signifikant vid 48 timmar efter P. aeruginosa injektion (figur 2B), vilket tyder på ett inflammatoriskt svar. Vid 4 - 5 dagar efter P. aeruginosa injektion, både BAL proteinnivå och cellnumret började sjunka föreslå återvinning (Figur 2A, B). Vidare lung lysat samlas på olika ställen stolpe P. aeruginosa administrering och nivån av makrofaginflammatoriskt protein 2 (MIP2), en cytokin inblandad i neutrofil attraktion 12, mättes genom ELISA. I överensstämmelse med BAL analysresultaten, avsevärt ökat sj MIP2 nivå sed vid 48 h efter P. aeruginosa injektion och återvände till basal nivå vid 96 timmar efter P. aeruginosa injektion (figur 2C). Vidare har celler från BAL fast på glasskivor och utsattes för hematologi färgning. Utan P. aeruginosa, fanns det bara ett litet antal monocyter i BAL-vätska (figur 2D). I motsats därtill stor mängd neutrofiler var närvarande i BAL isolerats vid 48 h efter P. aeruginosa injektion (Figur 2E). Vid 96 timmar efter P. aeruginosa injektion, cell sammansättning BAL återvände till kontrollnivån (Figur 2F). För att summera, resultaten i figur 2 anges en akut neutrofil inflammatoriskt svar tillsammans med en ökad alveoler barriär permeabilitet och ökning av cytokin-koncentrationer, vilka är alla kännetecken akut lungskada 13. I alla experiment var det injektion av saltlösning användes som kontroll.

ve_content "> En del av uppgifterna, bland annat H och E-färgning, BrdU märkning, TUNEL analys BAL analys och nivåmätning MIP2, tidigare publicerad 7. I den här artikeln, studerade vi rollen som FoxM1, en ​​transkriptionsfaktor, i reparation av alveolär skada med hjälp av P. aeruginosa lungskada modell som beskrivs här 7.

Figur 1
Figur 1. Histologi, celldöd och spridning i P. aeruginosa medierad musmodell lungskada. (AF) Lung isolering, snittning och H / E-färgning utfördes med hjälp av icke-P. aeruginosa-injicerade (icke-PA) kontroll lungor (A) samt lungorna vid 24 h (B), 48 h (C), 72 h (D), 96 h (E), 7 dagar (F) stolpen P. aeruginosa iprojicerings (post-PA). (GI) lungsektioner bereddes från kontroll lungor (G) och 24 h post-P. aeruginosa injicerade lungor (H, I) och fortsätt till Tunel analys för att detektera celldöd. Lung sektioner färgades för lung epitelceller markör Sp-C (blå), T1α (röd) för att visa morfologi och även färgas för TUNEL (grön). Pilar i (H) indikerar Tunel positiva celler. (J, K) var BrdU injicerades i icke-P. aeruginosa injicerade möss (J) och 72 h efter P. aeruginosa injicerade möss (K) genom ip, var lungorna beredda vid 5 timmar efter BrdU injektionen och behandlas för antikroppar färgning mot BrdU (grön missfärgning). Skala bar = 60 pm för AF, 50 pm för G och H, 20 pm för I, och 100 pm för J och K. Denna siffra har modifierats Liu 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Alveolär barriär permeabilitet och inflammation efter i P. aeruginosa inducerad lungskada. (A, B) BAL uppsamlades från kontroll och P. aeruginosa behandlade lungor. (A) Proteinkoncentrationen i BAL ökade vid 48 timmar efter P. aeruginosa injektion och minskade vid 96 h, 5 dagar efter P. aeruginosa injektion. (B) Totalt cellantal i BAL ökat i 48 timmar efter P. aeruginosa injektion (B) och retuned kontrollnivån vid 96 h efter P. aeruginosa injektion. (C) MIP-2-nivåer mättes ossing lung lysat isolerade från kontrollmöss liksom möss vid 48 timmar och 96 timmar efter P. aeruginosa injektion. Data presenterades på medelvärde ± SE, n ≥ 3. (DF) Celler från BAL centrifugerades och fixerades på glasskivor och utsattes för HEMA3 färgning. Ett litet antal monocyter var närvarande i BAL hos kontrollmöss (D). Stor mängd neutrofiler var närvarande i BAL isolerats vid 48 timmar efter P. aeruginosa injektion (E). Vid 96 timmar efter P. aeruginosa injektionen fanns det ett litet antal monocyter i BAL (F). Scale bar = 10 | im, är dessa resultat är representativa för åtminstone fem oberoende experiment. Denna siffra har modifierats Liu et al. 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den Pseudo musen lungskada modell som vi beskriver här härmar hela processen av inflammation, lungskada, reparation och upplösning som inträffar efter akut lungskada eller lunginflammation. Den har unika fördelar jämför med flera andra modeller skada genom att den är kliniskt relevant och relativt säker och lätt att hantera.

Det kritiska steget i förfarandet är att injektionen av bakterier lösningar måste vara mycket långsam. Om injektion är för snabb, mössen kommer sannolikt att dö av choke. Efter en lyckad injektion, mössen brukar visa flera djupa andetag och kippa, som hjälper bakterierna partiklarna kommer in i lungan.

Stammen vi använde var PA103 6. En av de kritiska punkterna i denna modell är att den titer av P. aeruginosa måste hårt kontrollerad. Sats av P. aeruginosa från annan källa kunde visa olika grader av inflammation och skador även näranvänds vid samma CFU. Därför rekommenderas det att varje nytt parti av bakterier testas för att de orsakande effekter (såsom inflammation, celltillväxt, etc.), och följaktligen justera antalet CFU som ska användas. Om inkonsekventa resultat sker med hjälp av kylda bakterier lager, kan man använda färsk lager som erhålls genom växande bakterier från en ny platta för varje experiment. Dessutom kan tillväxtfasen av de bakterier och val av media också ha en inverkan på den effekt på värdsvar. Därför bör man se till att bakterie vaccinationer inträffar under samma fas av den bakteriella tillväxtcykeln.

Det kan finnas en skillnad i svar på P. aeruginosa av olika stammar av möss. Den stam som vi använde var en blandning av C57BL / 6 och FVB / N. Lämplig P. aeruginosa titer bör bestämmas för olika möss stammar.

En faktor att tänka på för den här modellen äratt skadan av bakterierna inte är begränsad till en celltyp. Till exempel, epitel, endotel, fibroblaster kunde alla har skadats. Därför är denna modell inte lämpad för att studera effekterna av celltyp specifika lungskador. Bakterierna orsakar lung celldöd genom att stimulera inflammatoriska svar samt genom att utsöndra gifter i vävnaden 6. Levande bakterier rensas oftast från lungan inom 48 timmar efter skadan 7,14. En hög koncentration av döda bakterier kan också orsaka skada genom att inducera inflammatoriska svar 15.

Mekanismerna för lungskada och reparation kommer sannolikt att vara olika i beroende av olika typer av lungskada. Därför är det viktigt att jämföra flera skademodeller. P. aeruginosa modell som beskrivs här är ett trevligt komplement till de andra modellerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine pharmaceutical grade
27 G needle Fisher 1482648
syringe Fisher 14823434 1 ml
scissors Fine Science tools
forceps Fine Science tools
suture  Fisher 19-037-526
Eye gauge, glove, gown
Biosafety Cabinet
chlorine dioxide based disinfectant Clidox
sheep blood agar plates  Medex supply HL-1160

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
  2. Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
  3. Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31, (8), 524-531 (2003).
  4. Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
  5. Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
  6. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
  7. Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
  8. Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
  9. Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
  10. Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
  11. Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391, (3), 1555-1560 (2010).
  12. Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
  13. Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
  14. Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
  15. Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics