Larvernas RNA-interferens i Röda Flour Beetle, * These authors contributed equally

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

RNA-interferens (RNAi) -baserade gen knockdown tekniker är kärnan i Tribolium forskning. Här ger vi en översikt över vår larver RNAi teknik Tribolium castaneum. Larvernas RNAi är en enkel, men kraftfull teknik som ger snabb åtkomst till förlust-of-funktion fenotyper, där forskarna att studera genfunktioner i olika sammanhang.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. (92), e52059, doi:10.3791/52059 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den röda mjölbagge, Tribolium castaneum, erbjuder en repertoar av experimentella verktyg för genetiska och utvecklingsstudier, inklusive ett fullt kommenterad genomsekvens, transposon-baserade genmodifiering, och effektiv RNA-interferens (RNAi). Bland dessa fördelar, RNAi-baserade gen knockdown tekniker är kärnan i Tribolium forskning. T. castaneum visa en robust systemisk RNAi svar, vilket gör det möjligt att utföra RNAi helst livsfas genom att helt enkelt spruta in dubbelsträngat RNA (dsRNA) i skalbaggen kroppshålan.

I denna rapport ger vi en översikt över vår larver RNAi teknik T. castaneum. Protokollet omfattar (i) isolering av den riktiga etappen av T. castaneum larver för injektion, (ii) förberedelse för inställningen injektion, och (iii) dsRNA injektion. Larvernas RNAi är en enkel, men kraftfull teknik som ger oss snabb tillgång till förlust av funktions phenotypes, däribland flera gen knockdown fenotyper samt en serie hypomorphic fenotyper. Eftersom så gott som alla T. castaneum vävnader är känsliga för extracellulärt dsRNA tillåter larver RNAi-tekniken forskare att studera en mängd olika vävnader i olika sammanhang, bland annat den genetiska grunden för organism svar på den yttre miljön. Dessutom enkelheten i denna teknik stimulerar fler studentengagemang i forskning, vilket gör T. castaneum en idealisk genetiskt system för användning i ett klassrum.

Introduction

Den röda mjölbagge, Tribolium castaneum, ökar i popularitet inom olika områden av biologin beror delvis på hur lätt utföra RNA-interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserade gen knockdown tekniker hjälper forskarna att utföra förlorad funktionsanalyser utan att använda komplexa genetiska metoder. T. castaneum visa en robust systemisk RNAi svar, vilket gör det möjligt att utföra RNAi i något skede genom enkel injektion av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i skalbaggen kroppshålan 4-6. Samtidig knockdown av flera gener är också möjlig i T. castaneum genom insprutning av två eller flera olika dsRNA molekyler samtidigt 7,8. Dessutom kan en rad hypomorphic fenotyper genereras genom att minska koncentrationen av injicerat dsRNA 8. Dessa funktioner gör RNAi-baserade omvända genetiska tekniker attraktiva alternativ till traditionella termins genetik i T. castaneum. Eftersom så gott somalla T. castaneum vävnader är känsliga för extracellulära dsRNA molekyler 9, denna teknik gör det möjligt för forskare att studera en mängd olika vävnader i olika sammanhang. Även om denna rapport är inriktad på att utföra RNAi i T. castaneum, många procedurer som beskrivs här gäller för andra insekter. Därför är detta protokoll användbar för dem som vill utföra förlorad funktionsanalyser i sina sammanhang av intresse i T. castaneum, liksom för forskare som vill tillämpa en RNAi-baserad teknik för att andra insekter.

Injektion dsRNA till larver gör funktionsanalys på en mängd olika skalbaggar levnadsstadier, inklusive larver, pupal och vuxna stadier 4,5,10. Vi har tidigare rapporterat vår övergripande larv RNAi-protokollet inklusive molekylärbiologiska förfaranden 11. I den aktuella rapporten fokuserar vi på att beskriva dsRNA injektion rutiner vilka bäst förklaras med visuella medhjälpare. Vi tillhandahållerdetaljerade steg-för-steg-injektion förfaranden samt goda och dåliga insprutnings exempel. Denna visuella protokoll kompletterar vår tidigare protokollet och när de kombineras, de ger en mer heltäckande bild av de larver RNAi förfaranden T. castaneum. Dessutom diskuterar vi parametrarna för dsRNA molekyler som kan påverka framgången för RNAi, tillämpning av RNAi-baserade analyser för fysiologisk forskning, samt tillämpligheten av larver RNAi-protokollet i en undervisningslaboratorium.

Protocol

1. T. castaneum Aktier och Odling

  1. Besluta om en T. castaneum stam att använda för experimentet.
    OBS: Flera labb etablerade T. castaneum stammar är tillgängliga. Ga-1 (Georgia-1) är moderstammen i Ga-2 som användes för genomsekvense 3. Eftersom Ga-1 aktier flesta DNA-polymorfismer (såsom single nucleotide polymorphisms, SNP) med Ga-2, och är friskare än Ga-2 på grund av mindre inavel, är den idealisk för RNAi-experiment. Pu-11 är ett annat praktiskt påfrestning att använda , eftersom dess unika förbättrad gula fluorescerande protein (EYFP) uttryck i framtiden flygeln primordia tillåter oss att skilja den sista larv instar från andra instars (se figur S4 av et al. Clark-Hachtel 2013 12). Det är viktigt att dokumentera vilken skalbagge stam användes i experimentet, som genetiska bakgrunder förefaller signifikant affect RNAi fenotyper 13.
  2. Förbered T. castaneum kultur mjöl genom tillsats av 5% (vikt) av i förväg siktat öljäst till organisk hel-vetemjöl (efter blandning, förvara kultur mjöl vid -20 ° C). Alikvotera kultur mjöl (vid rumstemperatur) i 6 oz plast Drosophila stock flaskor (omkring 40 g / flaska).
  3. Kultur T. castaneum vid 30 ° C med 70% luftfuktighet. Använd en fuktighetskontrollerad inkubator om möjligt. Lägg 30-40 vuxna per odlingsflaska (män: kvinnor förhållandet 1: 1) för att starta kulturen.
    OBS: Även om formen är sällan ett problem vid 30 ° C, lägre temperaturer (t.ex. 25 ° C) med 70% luftfuktighet kan orsaka mögeltillväxt i kulturen mjöl. Sänk luftfuktigheten om detta inträffar.
  4. Överför de vuxna till en ny kultur flaska varannan vecka för subodling (se steg från 5,2 till 5,5 för hur man isolera vuxna från kultur mjöl).
    OBS: Det tar ungefär tre veckor att få det sista stadiet larver. Alternattivt, T. castaneum kulturer kan hållas vid en lägre temperatur (20-25 ° C), om än med en längre odling period (utvecklings tid vid 25 ° C är ungefär dubbelt så stor som vid 30 ° C).

2 Beredning av lösningar och instrument för Larv dsRNA Injektion

  1. Syntetisera dsRNA-molekyler som är homologa med målgenen genom transkription in vitro. Förvara vid -80 ° C. Se Filip och Tomoyasu 2011 11 för detaljerade molekylärbiologiska förfaranden. Se även diskussion om ett antal parametrar som måste beaktas när man utformar dsRNA molekyler.
  2. Gör 10 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,6 vid 25 ° C) genom att blanda 8,5 ml 1 M Na 2 HPO 4 med 1,5 ml av 1 M NaH 2 PO 4. Kontrollera pH med en pH-meter och justera.
  3. Gör 1 ml 10x injektion buffert genom att blanda 10 | il av 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,6 vid 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 pl grön livsmedelsfärg och 790 l av dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O). Späd 10x injektionsbuffert till 2x injektion buffert (200 l 10x injektion buffert + 800 l DDH 2 O). Lagra både 10x och 2x injektion buffertar vid 4 ° C tills det behövs.
  4. Förbered Sticky glas.
    1. Täck en hel glasskiva med en form av flyttbar lim för larv injektioner. För vuxna eller PUPP injektioner, göra två tunna remsor av lim längs de längre kanterna på bilden.
    2. Låt limmet torka i flera dagar, vilket säkerställer att limmet fortfarande är klibbigt nog att hålla sig skalbaggar till bilden, samtidigt som resterande böjlig nog för att underlätta deras avlägsnande efter injektion.
      OBS: Om limmet förblir alltför klibbigt, använd ett finger och knacka på limmet, vilket kommer att minska klibbigheten. Varje bild kan innehålla upp till 40 eller 50 skalbaggar, och kan återanvändas tills det inte säkert hålla djuren. Alterntivt kan dubbelhäftande tejp också användas, även om bandet ibland Ej klister nog att hålla larver.
  5. Gör en eterisering Basket.
    1. Ta bort kolven från en 10 ml engångsspruta, och skär sprutan på mitten runt 6 ml linjen.
    2. Kassera den nedre halvan av sprutan. Kortfattat värma den skurna ytan av den övre delen av sprutan med en gasbrännare, och snabbt driva smält plast på en bit nylonnät för att limma mesh på sprutan. Klipp bort överflödigt nät när plasten härdar.
  6. Förbered eter flaskan. Lägg 30 ml eter till en smal klöv 100 eller 250 ml glasflaska. Tillsätt flera bitar av mjukpapper för att öka förångning av eter.
    OBS: Eter utgör en brandrisk och är också skadligt. Hantera alltid eter under en huv. Stäng locket tätt när den inte används.
    OBS: Is kan användas som ett säkrare alternativ (till exempel i ett klassrum), även om sedation är mindre effektiv.

3 Beredning av Larv Injection Apparatus

  1. Lägg ut en XY mekanisk skede på en dissekera mikroskop.
    OBS: XY mekaniska steg är tillgängliga från stora mikroskop företag. Alternativt kan billiga steg mikroskop också användas för de flesta dissekera mikroskop med vissa modifieringar (se Material tabellen till exempel).
  2. Placera en mekanisk nål manipulator nära XY mekaniska scenen.
  3. Sätt ihop en injektionsspruta. Använd en fyra-vägs avstängningskran (med Luer-anslutningar) för att ansluta en 30 ml engångsspruta till en glas nålhållare, vilket tillåter manipulering av injektionssprutan utan att påverka trycket i injektionsnålen (se Philip och Tomoyasu 2011 11 för den detaljerade injektionsspruta montering).

4. Draginjektionsnålar

  1. Dra borosilikatglas nålar (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm lång) med ennål avdragare.
    OBS: För Sutter P-87 eller P-97, använd inställningen "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tid = 90" eller följa kapitel 2 i Pipette Cookbook: Oförenligt Cell, C. elegans, Drosophila, och Zebrafish - Rekommenderade program. De optimala inställningarna varierar beroende på vilken modell av nålen avdragare. Inställningen för en generisk Drosophila injektionsnål är en bra utgångspunkt.
  2. Store drog nålar i ett plasthölje (t.ex. en plast CD-fodral) och säkra med avtagbar montering kitt.

5. Isolering och Val av larver

  1. Placera en # 25 sikt på en sikt mottagare.
  2. Placera innehållet i odlingsflaska (skalbaggar och kultur mjöl) på sikten, och sålla innehållet omedelbart. Lämna inte innehållet på sikten utan siktning, som larver kommer snabbt försöka gräva genom sikten och fastna. Aggressivt sålla innehållet att låta mjölet fallaigenom och lämnar äldre larver (vanligtvis 6: e och 7: e INSTAR larver), puppor och vuxna (tillsammans med deras gjutna-off nagelband, exuviae) bakom ovanpå sikten.
  3. Överför det material som finns kvar på sikten (skalbaggar och exuviae) till utsädet pannan. Håll knacka pannan för att förhindra skalbaggar från att fly.
  4. Avlägsna exuviae och mjölpartiklar som finns kvar på ytan av de skalbaggar genom att försiktigt blåsa över fröet pannan.
  5. Tryck fröet pan att flytta innehållet till botten av pannan. Sedan lämnar pannan outnyttjad i flera sekunder. Vänta de vuxna, som är mer rörliga än andra stadier, att komma ut ur högen. Ta vuxna med hjälp av en konst pensel (t.ex. 1 cm bredd).
  6. Separat puppor genom att försiktigt knacka fröet pan samtidigt hålla mynningen av pan något nedåt, så puppor tendens att rulla snabbare mot munnen. Använd en pensel för att ta bort puppor, vilket innebär att endast larver på fröet pannan.
  7. Place den isolerade larver i en ren petriskål. Välj ett lämpligt skede av larver för injektion och placera dem i en separat petriskål.
    OBS: Tidigt förra stadiet larver (1-2 dygn efter sista larv molt) är ofta lämpliga vid analysen av RNAi effekten på vuxna morfologier samt metamorfos. Det är dock ibland nödvändigt att utföra RNAi på näst sista (eller ännu tidigare) steget att utvärdera tidig genfunktion (t.ex. figurerna 3E-3H. Se även Clark-Hachtel et al. 2013 12). Använd puppor som storleksreferens för att identifiera stadiet av larver. Det sista stadiet larver är något längre än puppor. Alternativt kan pu-11 användas för att identifiera den sista stadiet larver samt att bestämma tidsförloppet för utveckling av förra stadiet larver (Figur S4 av Clark-Hachtel et al. 2013 12).
  8. Håll den valda larver i en petriskål tills eterisering. Placera restenlarver och andra stadier av skalbaggar (som puppor och vuxna) tillbaka till en odlingsflaska med mjöl och returnera den till inkubatorn.

6 Beredning av injektionsnålar

  1. Placera en tidigare drog glasnål på en glasobjektsglas med antingen klibbiga please eller dubbelhäftande tejp. Använd pincett, testa drog änden av nålen samtidigt som du tittar igenom dissekera mikroskop för att se var spets böjar. Ta området något mot toppsidan av där nålen krökar med tången och vridning för att bryta.
  2. Håll goda nålar och kasta andra. Betrakta en bra nål som har en öppning som är varken för stor eller för liten (ca 0,05 mm diameter. Figurerna 1A och 1B), och är vinklat för att göra penetrering av larver ytterhud enklare (figurerna 1B och 2A-2B). Betrakta en dålig nål som (i) är för liten, vilket gör upptaget av dsRNA lösningen in i nålen svårigkult (steg 7) (figurerna 1D och 2D), (ii) alltför stor, vilket orsakar larv skada och möjlig dödlighet vid injektion (Figurer 1C och 2F), (iii) trubbig, vilket gör penetrering av nagelband svårt och ökande skada.
  3. Stick in nålen i nålhållaren.
    1. Först skruva loss nålspetsen hållaren och placera den bakre änden av nålen i hållaren tips. Sedan placera gummipackningen under hållaren spetsen (minst 1 cm från den bakre änden av glasålen).
    2. Sätt i baksidan av nålen i hållaren, med gummipackningen helt in i öppningen av nålen hållaren. Skruva spetsen tillbaka på hållaren.
  4. Placera den monterade nålhållaren på nålen manipulator. Håll nålhållaren nära horisontalplanet. Justera läget av manipulatorn, så att nålens spets är belägen i centrum av vyn när man tittar genom den MICRoscope.

7 Förhandstilldelning dsRNA Solution i Needle

  1. Förbered dsRNA injektionslösningen strax före injicering genom justering av koncentrationen med DDH 2 O och blandning av dsRNA lösningen med lika stora volymer 2x injektionsbuffert (steg 2,3). Förvara den blandade lösningen på is. Se diskussion avseende dsRNA koncentration.
  2. Skär spetsen av en 20 | il av engångstyp pipettspetsen. Pipettera 10 | il av lösningen i den trimmade pipettspetsen. Ta försiktigt bort pipettspetsen från pipetten samtidigt som vätskan på spetsen genom baktryck. Alternativt försiktigt bort spetsen och sedan flytta lösningen till slutet av spetsen genom att ge tryck med hjälp av ett finger.
  3. Placera pipettspetsen med dsRNA lösningen på mikroskop scenen med hjälp av klibbiga please med öppningen vänd mot nålspetsen.
  4. Titta i mikroskopet, för sakta laddade spets mot nålen tills spetsen pånålen är innanför den inlästa pipettspetsen och in i lösningen.
  5. Titta i mikroskopet, försiktigt dra tillbaka kolven i injektionssprutan för att dra långsamt dsRNA lösningen i nålen.
    OBS: Överfyll inte nålen. Som i slutet av dsRNA lösningen närmar sig nålspetsen, sänka takten för att dra och stoppa lastning lösning innan nålspetsen skulle nå luft. Om luften når spetsen, kommer lösningen att snabbt dras in i nålhållaren, vilket resulterar i allvarliga föroreningsproblemen. Detaljerade rengöringsrutiner av nålhållaren beskrivs i Philip och Tomoyasu 2011 11.
  6. Avlägsna trycket från injektionsspruta och nål genom att öppna kranen. Därefter flyttar pipettspetsen bort från spetsen av nålen. Höj nålen upp från scenen för att förhindra oavsiktligt skada nålen medan placera larverna på scenen. Ta den tömda pipettspetsen från scenen.
  7. 8. dsRNA Injektion

    1. Placera larver i eterisering korgen. Använd mindre än 10 larver, om att lära sig tekniken. Använd 30-40 larver i en omgång gång bekväm med tekniken.
    2. Placera korgen med larver i etern flaskan och stäng locket.
      OBS: Eter utgör en brandrisk och är också skadligt. Utför detta steg under en huv.
    3. Etherize larver under ca 3 min. Kontrollera larverna för rörelse efter 3 min. Placera dem tillbaka i etern flaska för ytterligare 30 sekunder om de fortfarande rör sig. Inte etherize under mer än fem minuter, eftersom detta kan öka dödlighet.
      OBS: Den optimala eterisering tiden kan variera beroende på temperatur och luftfuktighet.
    4. Överför etherized larver från korgen till den icke-vidhäftande kanten av en glas klibbig slide. Använd pincett och samtidigt tittar i mikroskopet, plocka upp varje larver en efter en och placera dem på bilden. Lägg dem i sidled och försiktigt knacka ner deras kroppar from huvud till svans med pincett, något stretching dem som du går, se till att de är säkrade till bilden.
    5. Placera den klibbiga slide med larver på mikroskop scenen.
    6. Sätt i dsRNA laddade nålen försiktigt i ryggsidan av larverna att undvika skador på CNS. Undvik också ryggens mittlinje, eftersom larv hjärta ligger här. I denna och senare steg, använd alltid steget att flytta larverna till nålen (istället för att använda nålen roboten att flytta nålen).
      OBS: Det specifika injektionsstället spelar ingen roll eftersom RNAi i T. castaneum tycks vara systematiska. Det är dock oftast enklast att injicera i ryggsidan av bröst eller buken segment.
    7. När du har satt in nålen i larverna, dra nålen något tillbaka för att ge utrymme för dsRNA att komma in i larvkroppshålan.
    8. Tryck försiktigt på injektionssprutan tills larverna turn green (eller färgen på injektions buffert) och ser stretched och full.
      OBS: Om att lära sig tekniken, försök att injicera så mycket som möjligt för att bestämma mängden av lösning som kan injiceras i en larv utan betydande dödlighet. Det är i allmänhet ca 0,5-0,7 l.
    9. Ta bort nålen från larverna. Medan nålen tar bort något drar tillbaka på injektionsspruta för att undvika dsRNA förlust (även noga med att inte dra in luft).
    10. Injicera all larver på bilden. Se till att ta bort larver som inte framgångsrikt injiceras. Komplett injektion innan larver vaknar (i ca 10 min).
    11. Ta bilden med injicerade larver från injektions mikroskop och lämna bild för ytterligare 5 minuter tills alla larver återhämta sig från eterisering.
    12. Med pincett och under en dissekera mikroskop, försiktigt lyfta larverna från huvud till svans för att frigöra dem från den klibbiga slide. Placera nyutgivna larver i en ren petriskål. Låt larver på petriskål i 10-15 min så att injektionen wound att koagulera.
    13. Placera larver i en ny flaska med rent mjöl och etikett på lämpligt sätt, inklusive stamnamn, typ av dsRNA injiceras, koncentration av dsRNA, antal larver injiceras, samt datum.
    14. Kultur den injicerade larver vid 30 ° C med 70% luftfuktighet. Observera larverna för RNAi regelbundet fenotyper.
      OBS: Det sista stadiet larver förpuppas inom 7 dagar. Därefter kommer puppor Eclose till vuxna efter 7 dagar (om det inte finns något onormalt i timing orsakad av RNAi).

    9 Bekräftelse av Knockdown och Fenotypiska Analyser

    1. Överväg bedöma effektiviteten av RNAi riva av flera olika molekylärbiologiska tekniker, såsom kvantitativ omvänd transkription-PCR (QRT-PCR) och Western blotting. Se et al. Miller 2012 7 och Philip och Tomoyasu 2011 11 för detaljerad qPCR och Western Blot-protokoll, respektive.
    2. Analysera RNAi relaterade fenotyper.
      OBS: RNAi närståendefenotyper kan observeras på flera olika stadier och under olika odlingsbetingelser, beroende på vilka gener som var riktade. RNAi kan påverka skalbagge morfologi, metamorfos, fysiologi och beteende. Hur ofta närvaron av fenotyp kontrolleras och under vilka förutsättningar skalbaggar föds upp bör anpassas till de specifika frågor som undersöks genom RNAi.

Representative Results

En av de viktigaste stegen för lyckad injektion är att göra en bra nål. Som beskrivs i steg 6 måste spetsen på nålen brytas före injektion T. castaneum. Exempel på goda och dåliga nålar visas i Figur 1. En bra nål har en skarp och stel spets, med en öppningsdiameter omkring 0,05 mm (figur 1B).

Figur 2 visar en lyckad injektion (Figur 2A och 2B) samt flera fall av misslyckade injektioner (figur 2C-2F). Med en korrekt storlek injektionsnål, tränger nålspetsen larvnagelbanden med minimalt motstånd (Figur 2A) och dsRNA lösningen (grön) strömmar in i larverna utan något läckage (Figur 2B). Inte över-inject, eftersom det kommer att orsaka överflöde av dsRNA lösningen även med rätt storlek på injektionsnål (Figur2C). Om nålspetsen är för tunn, ofta misslyckas nålspetsen att penetrera larver nagelband och kurvor, vilket gör injektionen svårt (Figur 2D). Om detta händer hjälper trimning nålspetsen ibland. St är ofta fortfarande användbar, om än med vissa svårigheter att tränga larver nagelband (figur 2E). Dock är en stor del av dsRNA lösningen lätt tryckas ut från nålen, även med lätt tryck på injektionsspruta, ofta resulterar i ett överflöd av dsRNA-lösning (Figur 2F).

När du utför RNAi, är det viktigt att ha en positiv kontroll för att bedöma att RNAi fungerar korrekt, och en negativ kontroll för att kontrollera att effekten observeras inte är en icke-specifik effekt av dsRNA eller en följd av injektionsförfaranden (exempelvis skador genom injektion, eller onormalt från eterisering). Injektion av dsRNA inriktning EYFP kan fungera som engod positiv kontroll vid användning av pu-11 stam 5,7. När EYFP dsRNA injiceras i det sista larvstadiet, kan observeras en signifikant reduktion i EYFP signal i de framtida ving primordia så tidigt som en dag efter injektion (Figur 3A). Den knockdown av EYFP är fullständig två dagar efter injektion av EYFP dsRNA (figur 3B) och denna knockdown kvarstår genom puppstadium (figurerna 3C och 3D) och under hela livet av skalbagge om dsRNA koncentration är tillräckligt hög (såsom en ^ g / ^ il) 7. EYFP dsRNA kan också användas som en negativ kontroll eftersom det är en icke-endogen gensekvens och bör inte orsaka morfologiska eller fysiologiska störningar (figurerna 3A-3D).

Vi gav bilder av larver RNAi för vestigial (VG), en kritisk ving gen 12, som ett annat exempel på hur eftivt denna injektion baserade RNAi teknik är i T. castaneum. När dsRNA för vg injiceras i näst sista larvstadiet (ett steg före den sista larvstadiet), kan en fullständig förlust av vingstrukturerna i puppstadium (figurerna 3E och 3F). Den resulterande vuxna också helt saknar vingstrukturer (figur 3G och 3H). Den RNAi resultat vg exemplifierar både robusthet och det gäller systemiska RNAi i T. castaneum.

Figur 1
Figur 1: (A) Exempel på obrutna, bra och dåliga nålar (B) Spetsen på en väl bruten bra nål (C) Spetsen på en bruten nål som är för stor och trubbig (D) Tipset... av en pank n nål som är för tunt. Skala barer (röd) är 0,05 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2:... (A) En korrekt storlek injektionsnål in i den sista instar larven (B) Larv lämpligt injicerades med den gröna dsRNA-lösning (C) Spill i dsRNA-lösning vid insprutningspunkten som orsakas av över-injektion (D ) En tunn nål misslyckas med att penetrera larver nagelband (E) En stor injektionsnål in i det sista stadiet larv.. (F) Larva injiceras med en stor nål, vilket resulterar i spill och läckage av dsRNA lösningen. Pilar indikerar de nålar.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Exempel på framgångsrika RNAi i T. castaneum. (AD) Senaste larv injektion av EYFP dsRNA resulterar i en reduktion av EYFP expression. (A) Larver en dag efter injektion. (B) Larver två dagar efter injektion. (C) Kontroll puppor. (D) Puppor resulterande från larver EYFP dsRNA injektion. De negativa kontrollerna är buffert injektion (A, B) och dsRed dsRNA injektion (C, D). Arrowheads och pilarna visar EYFP uttryck eller saknar därav i flygeln primordia och ögon, respektive. (EH) Pennaultimata larver RNAi för vg. (E) vildtyp puppa. (F) vg RNAi puppa. Bristen på vingkonstruktioner syns redan i puppstadium (pil). G) vildtyp vuxna. (H) vg RNAi vuxen. Wing relaterade strukturer helt saknas (pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det finns ett antal viktiga frågor som måste övervägas för att säkerställa framgång för RNAi, inklusive längd och koncentration av dsRNA molekyler, konkurrens mellan olika dsRNA molekyler (vid försök multipel slå ner), och möjligheten att ej åsyftade effekter (OTE).

dsRNA Längd

Längden på dsRNA molekyler påverkar effektiviteten av den system RNAi svaret, med en längre dsRNA är mer effektivt att utlösa RNAi 7,14,15 (även om längre gränsen för dsRNA är för närvarande okänt). Den dsRNA längd måste vara längre än 50 räntepunkter till framkalla effektiva RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellan 150 bp och 500 bp verkar vara perfekt för RNAi-experiment. Även längre dsRNA molekyler kan också användas, kommer de att ha en ökad risk för OTE och genen-kloning steg kommer att bli allt svårare.

dsRNA Koncentration

ve_content "> Olika grader av genen knockdown kan uppnås beroende på koncentrationen av dsRNA. 1 ug / ul tycks vara en rimlig startkoncentration, vilket ofta ger en nära-noll-fenotyp (kan variera beroende på den gen (er) av intresse ). RNAi kan utföras med en högre koncentration (t.ex., 7-8 ng / ^ il) för att erhålla en starkare RNAi fenotyp. RNAi med en serieutspädning av dsRNA kan ibland vara fördelaktigt att producera en serie av hypomorphic fenotyper (Supple Data av Tomoyasu et al. 2009 8, och Borràs-Castells opublicerade data).

RNAi Konkurrens

Flera gen knockdown kan åstadkommas på T. castaneum genom injicering av ett flertal olika dsRNA molekyler samtidigt. Emellertid är det också känt att ha flera olika dsRNA molekyler i organismen resulterar ofta i konkurrensen mellan dsRNAs för tillträde till RNAi komponenterna (t.ex. Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, och Yang et al. 2009 18). Även möjligt, fyrdubbla RNAi (eller flera) kan vara en utmaning, eftersom det sannolikt skulle leda till betydande minskning av RNAi effektivitet för alla fyra mål gener.

Off-inriktning

OTE är en inneboende oro för RNAi-baserade metoder. Ett sätt att minimera OTE är att identifiera områden i målgenen som delar liknande sekvenser med andra gener och undvika dessa regioner vid utformningen dsRNA. En enkel BLAST-analys mot T. castaneum förutspådde gen set kan identifiera sådana områden. Flera online verktyg kan också utvärdera potentiella OTE (t.ex. E-RNAi 19). Performing RNAi för två icke-överlappande regioner av målgenen är ett enkelt och effektivt sätt att eliminera möjligheten att observerade fenotyper orsakas av OTE. Möjligheten att OTE minimeras om RNAi för två icke-överlappande regioner producerar samma fenotyper (om inte de två icke-överlappande områden delar en liknande sekvens).

Utvärdera gen knockdown av andra än fenotypisk analys medel ofta är avgörande för att på ett effektivt sätt presentera RNAi-relaterade uppgifter. Två viktiga sätt att utvärdera gen knockdown är QRT-PCR och Western blot-analys. QRT-PCR är ett bekvämt sätt att mäta graden av mål-mRNA, och har använts i många RNAi relaterade studier inklusive de i T. castaneum (se Miller et al. 2012 7 till exempel). However, ska försiktighet iakttas, eftersom vi nyligen har sett några fall där mål-mRNA nivån är uppregleras av RNAi (även om protein produkten nedregleras) (Borràs-Castells opublicerade data). Det är för närvarande okänt om detta RNAi inducerade mRNA uppreglering kan vara omfattande eller unikt för vissa gener. Western blot-analys är ett annat sätt att bekräfta gen knockdown. Denna metod är ganska tillförlitliga eftersom den mäter mängden av den slutliga proteinprodukten. Kravet på en specifik antikropp mot proteinet produkten av målgenen är en nackdel med detta tillvägagångssätt. Använda flera oberoende mätningar utöver fenotypisk analys kommer att öka förtroendet för de fenotypiska data som erhålls genom RNAi-baserade analyser.

Sedan dess utformning i T. castaneum, har RNAi främst använts för att studera geners funktion i utvecklingen och mönsterbildning. Dessa T. castaneum utvecklingsstudier har varit mycket framgångsrika i känneterizing evolutionärt bevarade och avvek funktioner gener (översikt i Denell 2008 1 och Klingler 2004 2). Men RNAi-baserade studier i T. castaneum är inte begränsade till utvecklingsbiologi. Till exempel kan RNAi utnyttjas för att studera genfunktion i ett brett spektrum av fysiologiska och beteendemässiga reaktioner, inklusive stresstolerans, predation, aggression, partnerval, aktivitetsmönster, och försvarsmekanismer.

En svårighet att tillämpa RNAi till dessa sammanhang är sannolikheten för pleiotropa effekter. Ofta kommer gener av intresse att ha en mängd olika roller i hela T. castaneum livscykel, vilket gör avlägsnandet av gener utan oavsedda fenotypiska effekter svåra. Däremot kan möjligheten att enkelt utföra RNAi på en mängd olika stadier ofta vara en effektiv strategi för att undvika dessa pleiotropiska effekter. Till exempel kan utföra RNAi hos vuxna istället för larver eller puppor tillåta oss att kringgå unintenderade dödlighet orsakad av gen knockdown under tidig utveckling. Flexibiliteten i RNAi respons i T. castaneum gör därför den här modellen ett attraktivt val för att anpassa RNAi experiment av geners funktion i fysiologiska och beteendemässiga reaktioner.

The T. castaneum systemet är också idealisk för användning i en undervisningslaboratorium. T. castaneum lätt kan odlas på ett mjöl / jäst blandningen vid rumstemperatur (25 ° C) utan frekvent subodling och RNAi-tekniker i T. castaneum är enkla nog att kunna anpassas till ett laboratorium med unga, lärande forskare. Eftersom RNAi blir en viktig teknik i en mängd olika biologiska områden, är det viktigt att eleverna utsätts för denna teknik. Den rättfram karaktär larver RNAi-tekniken i T. castaneum uppmuntrar också fler studenter att delta i forskning, vilket gör T. castaneum en utmärkt kandidat för ett klassrum orienterat genetiskt system. </ P>

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Centrum för bioinformatik och funktionsgenomik (CBFG) vid Miami University för teknisk support. Detta arbete stöddes av Miami University startbidrag (YT) och National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organic whole wheat flour  Heartland Mill Inc. Kansas G1
Brewer’s yeast MP Biomedicals 2903312 Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles Fisher Scientific 11-888
Sieve Fisher Scientific  04-881N 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. 
Sieve Fisher Scientific  04 881 10P 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver Fisher Scientific  04-866B 8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan  Seedburo Equipment Co. Model 33 collection pan
Incubator BioCold Environmental Inc BC26-IN Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4 Fisher Scientific  S374500
NaH2PO4 Fisher Scientific S397-500
KCl Fisher Scientific  P217-500
Food dye  Kroger green, blue, or red preferable
Microscope glass slide  Fisher Scientific  22-038-103
Tack-It Over&Over Aleene's Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case Amazon
Boroslilicate glass capillary Sutter Instrument BF100-50-15 O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller Sutter Instrument P-87 or P-97 
Removable mounting putty  Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster OfficeMax OM96091
Forceps Fine Science Tool 11231-30 Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps Fine Science Tool 11252-20 INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous  Fisher Scientific  E138-500
Nylon mesh Flystuff/Genessee Scientific 57-102 120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml VWR 89000-926
Stereomicroscope Zeiss SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope Fisher/Zeiss 12-070-513  Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage  Zeiss 4354600000000000
X-Y mechanical stage  Microscopenet.com A512 Inexpensive alternative
Manipulator Narishige M-152
Magnetic stand Narishige GJ-1 
Glass capillary holder Narishige IM-H1 
30 ml Disposable syringe BD syringe 309650 BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock  Cole-Parmer Instrument Co. EW-30600-03 Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush Amazon Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece Any general paint brush will work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
  2. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
  3. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  4. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  5. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  6. Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
  7. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
  8. Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
  9. Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
  10. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
  11. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
  12. Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
  13. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
  14. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
  15. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).
  16. Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
  17. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  18. Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
  19. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

Step 4.1 was updated from:

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

to

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics