MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

Biology

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Zhang, L., Vranckx, K., Janssens, K., Sandrin, T. R. Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA). J. Vis. Exp. (95), e52064, doi:10.3791/52064 (2015).

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Abstract

Protocol

주의 : 모든 환경에서 미확인 된 박테리아는 병원성 할 수 있으며, 적절한 바이오 안전성 프로토콜을 사용하여주의하여 취급해야합니다. 라이브 문화에 대한 작업은 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 절차를 사용하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-2 절차에 대한 자세한 내용은 페이지 33-38 "미생물 및 생물 의학 연구소에서 바이오 안전성"CDC / NIH의 제목 설명서,에서 사용할 수 있습니다. 문서에서 온라인으로 볼 수 있습니다 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . 실험복 / 가운, 보호 안경, 니트릴 또는 라텍스 장갑을 포함 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다. 표준 미생물 학적 방법과주의 사항을 준수해야하며, 생물학적 폐기물은 적절히 폐기해야합니다.

이 데모에 사용 된 박테리아는 Kartchner 동굴에서 분리되었다,AZ, USA, 건조 스펠 레오 뎀, 흐름 돌, 촉촉한 스펠 레오 뎀과 종유석 드립 (표 1) 등 4 개 환경에서. 모든 균주의 16S rDNA 염기 서열 분석에 의해 확인 된 25 % 글리세롤 2 B-R 매체에서 -80 ° C에 보관 하였다. 모든 실험은 실온에서 완료 하였다.

참고 : 우리는 데이터베이스 구축 및 미지의 질량 스펙트럼에 대한 질량 스펙트럼을 획득하기 위해 같은 샘플 준비 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 시료 제조 방법은 스펙트럼의 품질 및 재현성에 영향을 미치는 이전에 도시되었다. 다른 샘플 준비 방법을 사용하는 것은 바람직하다 (변형 수준에서 예) 미지의 잘못된 식별, 특히 높은 분류 학적 해상도의 원인이 될 수 있습니다.

MALDI 대상 1. 증착

주의 : 여러 프로토콜 단백질 추출물 GUID에 따라 이용해야 산 및 유기 용매의 사용을 필요로 수득각각의 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)에 포함 elines 및 정보. 적절한 보호구 착용해야하며, 사용되는 화학 물질의 종류와 양에 따라 달라집니다 (예를 들어, 아세토 니트릴 등의 독성, 가연성 솔벤트의 상당 수, 작업 할 때 / 가운, 장갑, 보호 안경, 그리고 호흡 보호 장치를 사용해야합니다 실험실 코트, 포름산과 트리 플루오로 산과 같은 부식성 산).

  1. 스테인레스 스틸 MALDI 표적 판에하고 건조 할 수 있도록 (해당 앞에서 설명한 프로토콜 11-13을 사용하여 얻은)에는 가능한 세포를 포함하지 않는 단백질 추출물 μL 보증금 1. 1 ㎕의 매트릭스 용액 (α 아노 -4- 하이드 록시 - 신 남산 용액)와 단백질 건조 추출물을 오버레이하고 건조시켜야.
  2. 각 생물 복제의 경우, 기술 복제합니다 (5-20 기술 회 반복) 적절한 수의 자리. 여기서, 각 생물 복제에 대 한 (10) 기술 복제하고 3 생물 복제합니다 w를 발견오히려 준비했다.
    참고 : 우리는 단백질 추출 시료 전처리 법을 이용하는 경우 연마 MALDI 스틸 타겟 판을 사용하는 것을 권장. 스틸 그라운드 대상 플레​​이트를 사용하여 확산 및 개별 샘플 우물 외부의 다른 샘플의 의도하지 않은 혼합의 원인이 될 수 있습니다.
  3. 보증금 1 μL의 calibrant의 대상 판에 표준이 건조 할 수 있습니다. 1 μL 매트릭스 솔루션을 오버레이하고 건조 할 수 있습니다.
  4. 음성 대조군으로 대상 접시에 보증금 2 μL 매트릭스 솔루션입니다.

2. 질량 스펙트럼 취득

  1. 질소 레이저 (λ = 337 ㎚)를 구비 한 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 브루 커 FlexControl 소프트웨어를 이용하여 동작.
  2. 100 샷 단위로 500 레이저 샷의 축적에 의해 긍정적 인 선형 모드에서 각 질량 스펙트럼을 수집합니다. 20kV의에 이온 원 (1) 전압을 설정; 이온 소스 (2) 18.15 kV의 전압을; 및 9.05 kV의에 렌즈 전압. 이러한 매개 변수는 악기 정시 참고및 FIC는 최적의 결과를 얻기 위해 다른 악기에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
  3. 충전 당 2 ~ 20 kDa의 자동화 된 스펙트럼 평가를위한 대량으로 충전 범위를 설정합니다. 중심 피크 검출 알고리즘을 사용합니다. (100) 다에서 최소 해상도 임계 값을 설정합니다. 100에서의 최소 세기 임계 값을 설정 2.에서 역치 잡음비 (S N)에 신호를 설정한다.

3. 데이터베이스 건설

  1. 데이터베이스 설계
    1. "새 데이터베이스 마법사"를 사용하여 BioNumerics 7.1에서 새 데이터베이스를 만듭니다.
    2. "실험 유형"패널에서 명령을 사용하여 스펙트럼 실험 유형, 예를 들어,을 Maldi를 만듭니다.
    3. "데이터베이스 디자인 패널"을 이용하여 레벨을 작성합니다. 사용하여 새로운 수준의 추가 "데이터베이스"메뉴의 명령 "레벨> 새로운 차원의 ... 추가". 여기에, "종"수준 "생물 복제"수준 "과"기술 복제 "수준 respectiv를 만들엘리.
  2. 가져 오기 및 원시 질량 스펙트럼을 전처리
    1. "파일"메뉴에서 "내보내기> 질량 스펙트럼"명령을 클릭하여 FlexAnalysis를 사용하여 .txt 파일로 원시 질량 스펙트럼을 보냅니다.
    2. 복제물 기술적 수준에서 데이터베이스로 원료 질량 스펙트럼 (.txt 파일)를 가져.
    3. 원시 질량 스펙트럼을 미리 처리.
      1. 가져 오기 및 재 샘플 (차 피팅 알고리즘을 사용하여).
      2. (50 점의 크기와 회전 디스크 포함) 기준 빼기를 수행합니다.
      3. (창 20 점의 크기와 10 점의 베타 카이저 창) 소음 [연속 웨이블릿 변환 (CWT)], 부드러운을 계산하고, 두 번째 기본 공제 (200 점의 크기와 디스크를 압연)을 수행합니다.
      4. [: 10 (N S) 잡음 비율 최소한의 신호와 CWT] 피크를 감지합니다.
    4. 전처리 한 후, 같은 피크를 포함하는 피크 목록과 같은 각각의 질량 스펙트럼의 특성 패턴을 저장크기, 피크 강도, S : 데이터베이스 N 등.
  3. 복합 질량 스펙트럼을 만들기
    1. "분석"메뉴의 "... 요약"명령을 사용하여 사전 처리 된 스펙트럼에서 복합 스펙트럼을 만듭니다. 목표 수준으로 "생물 복제"를 선택합니다.
    2. 여기에서, "생물 복제"수준에서 그 분리에 대 한 세 가지 복합 질량 스펙트럼의 결과로, 그 식민지의 복합 질량 스펙트럼을 산출하기 위해 같은 식민지의 10 기술 복제물의 질량 스펙트럼을 결합한다.
    3. 여기, 즉 "종"레벨에서 분리하기위한 하나의 복합 스펙트럼을 생성하기 위해 세 가지 복합 스펙트럼을 요약한다.
      참고 : 복합 스펙트럼은 기술 복제물의 포인트 별 평균입니다. 95 % 이상 (기본 설정)의 평균 유사도 (피어슨 상관 관계)를 복제 복합에서 제외됩니다. 그들은 (75 %에있는 경우 복합 스펙트럼의 봉우리 만이라고합니다포함 된 복제물의 기본 설정). 생물학적 복제판 들어, 이러한 설정은 각각 90 및 60 %였다.

4. 질량 스펙트럼 데이터 분석

  1. 데이터베이스의 항목을 선택하고 "비교"패널에서 "새로운 비교 만들기"명령을 클릭하여 비교를 만들 수 있습니다.
  2. 여기에, 비교 및​​ 분석을 보여주기 위해 "기술 복제"및 / 또는 "생명 복제"수준에서 질량 스펙트럼을 사용합니다.
  3. 비슷한 기반 클러스터 분석과 다차원 스케일링 (MDS)
    1. 색상 그룹을 만듭니다. 세 가지 생물학적 복합 질량 스펙트럼을 선택하고 해당 분리에 대 한 그룹을 만듭니다 "그룹"메뉴의 명령 "선택에서 만들기 새 그룹"을 클릭합니다. 자동 이러한 세 질량 스펙트럼에 사용 색을 지정한다.
    2. 또한,의 명령을 사용하여 해당 색상으로 필드 상태를 정의하는 "이 정의 필드를 기준으로 모든 그룹이 그룹에 대해 정의 된 같은 색을 사용하도록 데이터베이스 항목 "패널.
    3. 클러스터 분석을 수행합니다. "클러스터링"메뉴의 "클러스터 분석을 계산"명령을 클릭합니다. 비교 설정 1 페이지, "피어슨 상관 관계"를 선택하고 기본값으로 다른 매개 변수를 둡니다. 2 페이지에서 "UPGMA"를 선택합니다. 그런 다음 "마침"을 클릭합니다.
    4. "통계"메뉴의 MDS를 사용하여 플롯 "다차원 스케일링을 ..."명령을 얻습니다.
  4. 피크 일치
    1. "실험"패널의 스펙트럼 유형 "을 Maldi"을 클릭합니다. 그런 다음 "레이아웃> 이미지보기"를 선택합니다. 스펙트럼 겔 밴드로 표시됩니다.
    2. "스펙트럼"메뉴에서 "피크 일치를 수행"명령을 사용하여 피크 매칭을 수행합니다.
  5. 피크 클래스 식별
    1. 주성분 분석 (PCA)을 수행. 강조 "MALDI 실험 "실험의 유형" "패널과 사용"PCA를 수행하는 통계 "메뉴"에서 명령 "주 구성 요소 분석을 ....
    2. 양방향 클러스터링을 수행합니다. "비교"창에서 "통계> 매트릭스 마이닝을 ..."을 클릭합니다. 피크 클래스에 정합 피크의 세기는 서로 다른 색상 (열 맵)를 이용하여 표현된다.

사용자 지정 데이터베이스 5. 박테리아 식별

  1. 비슷한 계수 기반 방법
    1. 비교를 만들고 단계 4.3.3에 설명 된대로 "기술 복제"수준의 질량 스펙트럼을 기반으로 Dendrogram이를 생성합니다. 유사성의 비교를 위해 Dendrogram이를 저장합니다.
    2. "선택 항목을 확인> 분석"알 수없는 질량 스펙트럼을 선택하고을 클릭합니다. 확인 대화 상자가 나타납니다.
    3. "비교를 기반으로"분류 유형 (또는 저장 classif를 선택IER) 및 "다음"을 클릭합니다. 다음 페이지에서 참조 비교로 저장 Dendrogram이를 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
    4. 식별 방법으로 "기본 유사성"을 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
    5. 채점 방법으로 "최대 유사성"을 선택합니다. 각 매개 변수에 대한 적절한 임계 값과 최소값의 차이 값을 입력하고 "다음"을 클릭합니다.
    6. 계산이 완료되면, 확인 창이 나타납니다. "결과"패널에서 가장 잘 알 수없는 일치하는 데이터베이스의 구성원이 나열됩니다.
    7. 식별 프로젝트를 저장하고 "확인 프로젝트"패널에서 "교차 유효성 검사 분석"명령을 사용하여 ID를 확인합니다.
  2. 잠재적 바이오 마커 기반 방법
    1. 피크 클래스를 정의합니다. "매트릭스 광업"창에서 공통적 인 특징을 공유하는 피크 세트를 선택하고 정시 이러한 피크를 정의FIC 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커)를 사용하여 "스펙트럼> 피크 클래스 유형을 ... 관리" "비교 창"에서.
    2. 여기에, 모든 15 균주에 대한 격리 각 특정 피크 클래스를 정의합니다.
    3. 미지의 질량 스펙트럼을 선택하고, 전술 한 바와 같이 정의 피크 클래스 이러한 스펙트럼의 피크와 일치.

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Representative Results

이 데모에 건설 데이터베이스는 "종", "생물 복제"와 "기술 복제"각각 (그림 1A)을 포함한 "모든 레벨"최고에서 최저 수준을 4 단계를했다. "기술 복제"수준의 기술 복제물의 모든 전처리 스펙트럼을 포함. "생물 복제"와 "종"레벨은 복합 (요약) 스펙트럼을 포함. "모든 레벨"모든 기술적 복제 스펙트럼뿐만 아니라 모든 복합 스펙트럼을 포함.

스펙트럼 요약 절차 대표 피크를 사용하여도 1에 나타내었다. 각 구성원 질량 스펙트럼은 얇은 회색 선으로 나타납니다. 복합 스펙트럼은 빨간색으로 색 선으로 표시됩니다. 인접 피크를 쉽게 육안 검사 (그림 1B)를 허용하는 다른 색으로 표시됩니다.

표 1에 나타낸다. 높은 재현성 바실러스 종 B 대 98.0 ± 1.4이고, 최저 재현성 Curvibacter 종 (표 1)에 대해 89.4 ± 7.8이었다.

복합 질량 스펙트럼 데이터의 계층 구조의 생물학적 복제 수준에서 용이하게 시각화 클러스터 분석. 도 2에 도시 된 바와 같이, 생물학적 모여 회 반복하고, 15 종의 세균은 15 클러스터 형성. 밀접하게 관련 종, 예를 들어, B. 특검팀. A, B, D 및 E는 함께 클러스터링하는 경향이 있었다. 그러나, 아웃 라이어, 예를 들어, B. 특검팀. C와 F는,도 관찰되었다. "기술과 생물"수준에서 질량 스펙트럼에 따라 MDS 플롯은 그림 3. MDS의 페이지에 표시됩니다많은 이들 박테리아의 스펙트럼 사이의 유사성에 대한 명확한, 3-D 시각화를 얻었다. 두 기술 복제하고 생물학적 복제물 유사한 그룹핑 (도 3B)를 나타냈다.

피크 매칭은 질량 스펙트럼에서 피크의 세트를 구별하는 데 사용 하였다. 상수 공차 (X 축상의 점), 선형 공차 (PPM) 및 피크 검출 피크를 포함 레이트 매칭 파라미터는 사용자에 의해 지정 될 필요가있다. m / z × 위치 공차 = 상수 + 공차 선형 공차 : 상수 공차 및 공차 선형 방정식을 사용하여 피크 위치 오차를 계산하는 데 사용되는 요소이다. 증가 m / z으로 일정한 오차의 중요성은 감소한다. 피크 검출 속도는 피크의 스펙트럼 규정 속도 이상에 대한 그 위치에서 발견되는 경우에만, 피크 클래스 제조되는 것을 의미한다. 하나 이상의 패턴에 피크 피크 클래스를 나타냅니다. 예를 들어, 피크 검출 율 등식스펙트럼의 10 % 이상이 피크 위치에있을 경우 10 % (LS), 최고 클래스 만 이루어질 수있다. 이 기술 반복 실험과 일련의 낮은 유병률 피크 (일반적으로 소음 피크)를 제외한다. 세트가 생물학적 복제물의 복합 스펙트럼을 기반으로하는 경우 낮은 유병률 피크 이미 복합 스펙트럼의 작성 중에 필터링 된 바와 같이,이 숫자는 낮은해야 할 수도 있습니다. 이 예제에서, 피크 매칭 "기술 복제"레벨에서 질량 스펙트럼을 사용하여 수행하고, 이러한 파라미터의 값은 각각 1.9, 550, 10 %이었다. 선택된 파라미터에 기초하여, 피크는 다른 피크 군의 결과와 일치하거나 일치하지 않는 것으로 간주 하였다. 피크 매칭 결과의 일례는 단일의 분리에 30 회 반복 (바실러스 종)를 사용하여도 4에 도시된다. 매칭 결과를 원료로서 색상 강도가 존재하는 테이블로 시각화 하였다. 파란색은 낮은 강도를 나타내는 빨간색은 높은 I을 나타냅니다ntensity. 피크 매칭 결과에 기초하여, 사용자는 후속 분석을 용이하게 피크 클래스를 정의 할 수있다.

두 주성분 분석 (PCA) (보충도 1)과 양방향 클러스터링 복합 피크 클래스를 분석하는데 사용될 수있다. "기술 복제"수준의 질량 스펙트럼을 사용하는 대표적인 양방향 클러스터링 결과는 그림 5에 나타나있다. 두 계통도가 표시됩니다. 하나는 m / z 값 옆이며 다른 박테리아 엔트리 상기 (도 5)이다. 피크 강도는 녹색은 낮은 강도를 나타냅니다과 빨간색 높은 강도를 표시하는 색으로 표시했다. 예를 들어, B. 특검팀. A와 F는 B. 특검팀과 거의 피크 클래스를 공유 할 수 있습니다. B와 D (그림 5). 닫기 검사 B. 특검팀 것으로 나타났다. B와 D는 종 특이 피크 클래스 (그림 5)의 세트가있다. 이러한 결과는 특정 피크 인증서 세트를 공유하는 것을 나타낸다 아인 특성 종 수준 잠재적 바이오 마커로 정의 할 수있다. 예를 들어, 피크 열세 세트 B. SP에 속하는. D는 선택 B. 특검팀의 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커)로 정의 하였다. (표 2), 3420.8, 2894.9, 2152.5 4302.0, 4339.9, 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1 및 7849.1를 포함하여 D,. 다른 균주의 피크 클래스는 서로 다른 색상 (보충 그림 2)에 표시 할 수 있습니다. 각 특정 피크 클래스 표 2에 도표화 하였다 격리. 정의 피크 클래스가 상기 수동들은 또한 100 AU의 최소 강도로 모든 기술적 복제판 등장하도록 체크하고, 피크 클래스의 부분 집합은 또한 박테리아의 특성을 용이하게하도록 저장 될 수도 종 및 / 또는 균주 수준에서, 예를 들면, 비 - 병원성 균주의 병원성 균주 구별 및 / 또는 항생제 내성 / 민감도를 조사.

식별과 관련하여 이비인후과 "> 블라인드 부호화 균주의 질량 스펙트럼을 수집하여 데이터베이스에 레퍼런스 질량 스펙트럼과 동일한 방법으로 전처리 하였다. 유사도 계수들의 비교에 기초하여 인증을 행하기 위해서는, 파라미터 값을 최대 유사도 포함한 지정된 최소 유사성이 지정되지 95.0 %와 87 %에서의 평균 유사성에서. (즉, 체크되지 않은 왼쪽). 최소 차이 값은 최대 유사도와의 평균 유사성 모두 5로 설정 하였다.이 값은 더 증가하기 위해 최적화 될 필요가있다 올바른 식별 속도. 그림 6은 유사성 계수 (그림 6)의 비교에 기초하여 식별 결과를 보여줍니다. 일치하는 결과는 블라인드 코드 박테리아는 대부분 B. 특검팀 것을 제안했다. A.이 식별 프로젝트의 비교를 기반으로 유사성 계수는 더 교차 유효성 검사 (보충 그림 3에 의해 검증되었다 (보충 그림 3)이있다. 흥미롭게도, 피크 클래스 비교에 기초하여 식별 프로젝트 교차 검증은 유사도 계수의 비교에 기초하여보다 훨씬 빠르다.

식별은 피크 수준의 매칭 (보충 그림 4)를 기반으로 완료 할 수 있습니다. 피크의 불일치는 (보충 그림 4) 관찰되었다 그러나. 불일치는 각각의 단백질의 아미노산 교환으로 인한 질량 변화에 기인 할 수있다. 하지 일치되는 피크는 종 수준에서의 차별은 아니지만이 변형 특정 또는 분리 피크 수 있습니다. 오, 함께 촬영유사성 계수와 바이오 마커 기반 - - 쉽게 카르스트 샘플 준비를 사용하여 환경, 스펙트럼 획득의 종 수준에서 박테리아를 식별 할 수 있으며, 데이터 분석 워크 플로우 여기에 설명 UR 결과는 모두 식별 방법을하는 것이 좋습니다.

그림 1
그림 1. 데이터베이스 구조 및 질량 스펙트럼의 요약이 데모 (A)으로 구성 데이터베이스의 구조.; Aminobacter(B) 10 기술 반복 실험에서 피크를 사용 피크 요약의 그림입니다.

그림 2
복합 그림 2. Dendrogram이생물학적 복제 수준의 질량 스펙트럼은. 데이터 세트는 각 종족에 대한 세 가지 복합 스펙트럼을 가진 15 종의 스펙트럼을 포함하고 있습니다. 각 종 색상으로 구분되었다.

그림 3
다차원 스케일링 (MDS) (30), 각 종의 스펙트럼 (A)와 각 종 세 복합 스펙트럼 (B)로 생물학적 복제 수준과 기술적 복제 수준에서 질량 스펙트럼 표현이. 색상은 동일한 색상으로 코딩되었다 3.도 도 2에서 사용.

그림 4
그림 4. 피크 매칭 테이블의 그림. 표는 기술 복제 LEVE에서 바실러스 종의 질량 스펙트럼을 기반으로 생성 된리터. 피크 일치하는 매개 변수의 값은 각각 선형 공차 일정한 허용 오차 1.9, 550 및 피크 검출 율 10 %였다. 블루 낮은 피크 강도를 나타내는 빨간색은 높은 피크 강도를 나타냅니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 양방향 클러스터링의 그림입니다. 그림은 기술 복제 수준에서 질량 스펙트럼을 사용하여 생성되었습니다. 그림 2에서 사용 된 균주의 색상이 동일한 색상으로 코딩 하였다. 피크 강도 색, 녹색의 의미 낮은 강도와 빨간색 의미 높은 강도로 표현된다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


사용자 데이터베이스를 사용하여 유사도 계수의 비교에 기초하여도 6 박테리아 식별.

아이디 출처 가장 가까운 상대 B / 왕국 문 / 클래스 수탁 번호 (가장 가까운 상대 B) %의 유사성 BioNumerics 키 재현성 (%)
D2 드라이 스펠 레오 뎀 바실러스 SP. E-257 / 후벽 균 FJ764776.1 98.8 바실러스 94.9 ± 4.0
D7 드라이 speleot밑단 바실러스 SP. GGC-P3 / 후벽 균 FJ348039.1 99.0 바실러스 종 B 98.0 ± 1.4
F1 흐름 돌 바실러스 니아신은 M27 / 후벽 균을 변형 KC315764.1 99.2 바실러스 종 C 96.5 ± 2.4
F4 흐름 돌 바실러스 SP. GGC-P5A1 / 후벽 균 FJ348046.1 99.1 바실러스 종 D 89.8 ± 8.8
F9 흐름 돌 바실러스 SP. OSS 19 / 후벽 균 EU124558.1 99.4 바실러스 종 E 96.5 ± 1.9
R10 종유석 드립 바실러스 SP. K1 / 후벽 균 GU968734.1 99.8 바실러스 종 F 95.4 ± 3.9
D11 드라이 스펠 레오 뎀 Brevibacillus 브레비스 변형 IMAU80218 / 후벽 균 GU125635.1 99.5 Brevibacillus 94.3 ± 5.8
F14 흐름 돌 Exiguobacterium SP. ZWU0009 / 후벽 균 JX292087.1 99.3 Exiguobacterium 96.5 ± 2.5
M7 촉촉한 스펠 레오 뎀 브레 비박 테 리움 SP. N78 / 방선균 HQ188605 97.6 브레 비박 테 리움 97.5 ± 2.0
M14 촉촉한 스펠 레오 뎀 Kocuria rhizophila 변형 Ag09 / 방선균 EU554435.1 (100) Kocuria 종 95.2 ± 4.1
M15 촉촉한 스펠 레오 뎀 브레 비박 테 리움 SP. MN3-3 / 방선균 JQ396535.1 99.5 브레 비박 테 리움 종 B 92.1 ± 4.9
R4 종유석 드립 Aminobacter 특검팀. KC-EP-S4 / α-프로 테오 박테리아 FJ711220.1 99.9 Aminobacter 95.4 ± 2.7
F5 흐름 돌 Comamonas testosteroni 변형 NBRC 12,047 / β-프로 테오 박테리아 AB680219 (100) Comamonas 종 96.4 ± 2.6
R8 종유석 드립 Curvibacter 섬세 / β-프로 테오 박테리아 AB680705 97.0 Curvibacter </ EM> 종 89.4 ± 7.8
F8 흐름 돌 모락 SP. 19.2 KSS / γ-프로 테오 박테리아 HE575924.1 99.9 모락 92.6 ± 4.9

박테리아는 Kartchner 동굴, AZ, 미국에서 분리 및 16S rDNA의 염기 서열을 이용하여 확인 하였다. 두 프라이머 27F (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') 및 1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'), 약 1400 bp의 길이의 16S rRNA 유전자 서열을 얻기 위해 사용 하였다.
B NCBI 데이터베이스의 BLAST 검색을 기준으로합니다.
C보고 된 값은 하나의 표준 편차 ± 30 회 반복 (세 생물학적 복제합니다 (10) 기술 복제물 각)의 평균 상관 계수이다.

표 1. 박테리아는 데모에 사용 된 균주.

BioNumerics 키 피크 클래스 / 잠재적 인 바이오 마커 (다)
바실러스 2152.5, 2224.9, 2595.8, 2894.9, 2921.3, 3380.5, 3496.3, 3515.0, 3733.5, 4302.0, 4340.0, 4385.8,4763.9, 4910.6, 5189.4, 5227.0, 5634.6, 5769.6, 5892.8, 6301.4, 6756.2, 6789.4, 6990.3, 7029.5, 7466.3
바실러스 종 B 2152.5, 2941.2, 3196.9, 3262.7, 3352.9, 3420.8, 3733.5, 3925.2, 4302.0,4339.9, 4629.2, 4713.4, 4859.3, 4900.6, 5189.4, 5227.0, 5541.8, 5878.7, 6388.8, 6524.0, 6704.5, 6838.8, 7142.7, 7317.5, 7466.3, 7849.1, 9263.9, 9721.2
바실러스 종 C 2588.0, 3361.8, 4330.4, 5173.0, 5847.6, 6332.0, 6524.0, 6720.3
바실러스 종 D 2152.5, 2894.9, 3420.8, 4302.0, 4339.(9), 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1, 7849.1
바실러스 종 E 2152.5, 2224.9, 2941.2, 3180.1, 3380.5, 4302.0, 4339.9, 4705.3, 5878.7, 6356.6, 6735.1, 6756.2
바실러스 종 F 3308.6, 3367.8, 3567.5, 4279.7, 4489.2, 4629.2, 4727.9, 4751.7, 5067.7, 6614.7, 6919.7, 7130.9
Brevibacillus 2133.3, 2611.0, 4263.3, 4302.0, 4859.3, 4900.6, 5080.2, 5219.0, 5847.6, 6775.7, 7529.4, 9721.2
Exiguobacterium 2588.0, 3053.3, 3420.8, 3695.5, 4263.3, 5133.1, 5173.0, 5248.8, 6104.8, 6605.3, 6804.4, 6838.8, 7390.2
브레 비박 테 리움 3053.3, 6104.8, 6146.5
Kocuria 종 3080.0, 4366.6, 5080.2, 5163.8, 5207.1, 5892.8, 6160.0, 6197.5, 6445.0, 7433.7
브레 비박 테 리움 종 B 3222.8, 3330.4, 3367.8, 4330.4, 4350.4, 4795.3, 4995.7, 5731.6, 6445.0, 6735.1,7487.3
Aminobacter 2133.3, 2562.4, 3361.8, 3410.4, 4289.2, 4629.2, 4662.0, 4869.8, 6064.1, 6221.0, 6720.3, 6789.4,6818.8, 7216.1, 7447.4
Comamonas 종 2806.0, 2921.4, 3246.5, 4350.4, 4727.9, 5607.5, 5666.3, 6221.0, 6488.3,​​ 7317.5, 9362.6
Curvibacter 2868.6, 3453.2, 4319.8, 5133.1, 6292.4, 6903.4, 7433.7
모락 3011.2, 5698.0, 6720.3, 7064.8, 7366.6

각 종족에 대한 정의 표 2. 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커) (다).

보충도 1 번째에서 질량 스펙트럼들의 주성분 분석 (PCA)도 2에 사용 된 예를 기술 복제 레벨 (A)와 피크 클래스 (B)는. 색상은 동일한 색상으로 코딩되었다.

보충 그림 2. 양방향 클러스터링을 기반으로 선택한 피크 클래스의 그림입니다. 동일한 레이블을 갖는 피크 클래스는 같은 색으로 착색된다.

보충 그림 BioNumerics에서 사용자 정의 데이터베이스를 기반으로 식별 프로젝트 3. 교차 검증 결과.

사용자 지정 데이터베이스를 사용 피크 일치에 따른 보충 그림 4. 박테리아 식별.

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Discussion

이 데모는 특성화 및 MALDI-TOF MS와 사용자 지정 데이터베이스를 사용하여 세균의 식별의 세부 절차를 보여 주었다. 예를 들어 전통적인 분자 방법과 비교하여, 16S rDNA의 염기 서열, MALDI-TOF MS 기반 지문 방법은 다양한 박테리아의보다 신속한 식별을 용이하게한다. 견고성으로 인해,이 기술은 널리 임상 환경에서 설정 1,14-16에서 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 효모를 특성화하기 위해 사용된다. 또한, MALDI-TOF MS는, 어떤 경우에는, 더 높은 해상도 분류학을 수득 것으로보고되었다. 예를 들어, B. 특검팀. A, B, D 및 E는 함께 클러스터링 (도 2) 경향이 있지만, 명확하게 분리시키고, 다른 B. (SP)의 스펙트럼 사이의 유사도. (그림 2) 80 % 미만이었다. 대조적으로, 이들 균주의 16S rDNA 염기 서열은 이들 균주를 구별하기 위해 이용 될 수없는 높은 유사성을 가지고종 수준에서. B. (SP)의 16S rDNA 염기 서열. B 및 D는, 복수의 배향 분석에 기초하여 99 % 유사성을 가지고 B. (SP)의 서열한다. A와 E는 B. (SP)의 순서로 각각 95 %와 96 %의 유사성을 보여준다. B 및 D. 특이점도 관찰되었다. 예를 들어, B. 특검팀. C와 F는 멀리 다른 B. 특검팀에서 그룹화합니다. (그림 2). 특이 균주의 출현은 질량 스펙트럼의 클러스터링 분석이 반드시 계통 관계를 설정하지 않음을 나타냅니다. 분리의 환경은 질량 스펙트럼 클러스터링에 영향을 미칠 수 얻었다. 예를 들어, 브레 비박 테 리움 종 B 촉촉한 스펠 레오 뎀와 B 특검팀에서 분리 하였다 Kocuria 종. 종유석 물방울에서 분리 된 F 함께 (표 1, 그림 2) 클러스터하는 경향이 있지만, 앞으로의 연구는이 ISOL의 큰 컬렉션에서 관찰 여부를 검토 할 필요오버라이드.

이 라이브러리 기반 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 특성은 일반적으로 데이터베이스를 기반으로합니다. 현재 상용 데이터베이스는 주로 박테리아 균주, 특히 병원성들로 구성된다. 이러한 상용 데이터베이스 임상 미생물학 실험실 설정에서 가장 유용합니다. 환경 균주뿐만 아니라 바이러스, 곰팡이와 효모의 특성을 사용자 지정 데이터베이스는 큰 변형 컬렉션을 사용하여 구성해야합니다. 후속 분석에 사용되는 파라미터는, 특히 종 및 균주 수준에서, 분류학 해상도를 증가시키기 위해 최적화 될 필요가있다. 예를 들어, S :이 데모에서 피크 검출을 위해 사용되는 N 값은이 레벨 종의 식별에 적합하지만, 변형 레벨 식별을 위해,이 값을 낮게 할 필요가있다 (10)이었다. 이러한 공정 변수뿐만 아니라 워크 플로우 데이터 처리 때문에 때때로 예, ClinProTools 및 Bionume를 들어, 많은 소프트웨어 패키지 사용자 정의RICS, 파라미터 값과 해당 워크 플로우의 선택의 가능성이 최적화 데이터 분석을 최적화하기 위해 요구 될 것이다. 이 예제에서, 피크 매칭 파라미터들은 임계 값을 식별 프로젝트에 사용하고, 교차 검증이 모두 올바른 식별 율을 개선하기 위해 최적화가 필요했다. 이러한 매개 변수를 최적화하는 방법 및 / 또는 절차를 찾으려면 우리의 실험실에 큰 관심이다. 예를 들어, 하나의 접근 방식은 우리가 MALDI-TOF 데이터 수집 (17)을 최적화하는 자동화 된 최근에 사용 된 통계적 요소 디자인을 포함 할 수있다. 추가 미래의 응용 프로그램 및 MALDI-TOF MS 기반 미생물 지문의 향상은 널리 사용의 건설, 환경 박테리아 및 / 또는 비 세균성 미생물뿐만 아니라 혼합 문화 (18)과 미생물 군집의 특성의 큰 데이터베이스를 포함한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid ACROS Organics 163440050 ≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software Bruker Daltonics version 3.0
Bruker FlexAnalysis software Bruker Daltonics version 3.0
Bionumerics software Applied Maths version 7.1

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References

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