تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

Developmental Biology
 

Summary

دراسة أقرب أحداث تطور الخلية سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية غير محورية لفهم وعلاج السرطان. نحن هنا تصف طريقة للحث مشروط التحولات الخلايا الظهارية والتصوير الحي لاحق من الفطري تفاعل الخلايا المناعية مع HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد في يرقات الزرد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ramezani, T., Laux, D. W., Bravo, I. R., Tada, M., Feng, Y. Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin. J. Vis. Exp. (96), e52107, doi:10.3791/52107 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

فرط نمو ذرية خلية سابق للورم داخل ورقة الظهارية عادية على خلاف ذلك تعتمد بقوة على التفاعل مع المكروية لها. التفاعل مع الأنسجة مضيفه من المرجح أن يكون المحدد الرئيسي لما إذا كانت الخلية سابق للورم قادرة على تأسيس مكانة نسيلي لمواصلة تطوير إلى السرطان كاملة. وعلى الرغم من أهميته في التنمية، وهذه المرحلة الأولية من تطور سرطان هي التي يتعذر الوصول إليها في الأنظمة النموذج الأكثر شيوعا في الجسم الحي.

الزرد، دانيو rerio، هو نموذج كائن راسخة للدراسات التصوير الحية بسبب الشفافية في جميع أنحاء التنمية، وإمكانية للتلاعب الجيني، وسهولة الوصول للأدوية للذوبان في الماء. الدراسات الحديثة باستخدام نموذج الزرد اليرقات، overexpressing الجين الورمي البشري HRAS G12V لتحويل الخلايا الظهارية، وأظهرت أن الخلية المضيفة إشارات مشتقة، ولا سيما H 2 O 2 الرصاص لتجنيد الخلايا المناعية الفطرية. ومن المثير للاهتمام، وتجنيد خلايا المناعة، العدلات والضامة وقد أظهرت، أن يكون لها دور التغذية في دعم انتشار الخلايا سابق للورم 2،3.

من أجل فهم الأحداث في وقت مبكر من بدء الورم والتقدم فضلا عن مساهمة استجابة التهابية، ويحتاج المرء أن يكون قادرا على صورة هذه الأحداث من أقرب نقطة زمنية فصاعدا. ولذلك فمن الضروري للسيطرة على التحولات خلية بطريقة معينة الزمنية والأنسجة. علينا الاستفادة من نظام / UAS GAL4 التي تم تكييفها بنجاح من ذبابة الفاكهة 4 للتعبير مشروط في الجين الورمي البشري HRAS G12V تحت سيطرة المروج الجلد محدد الكيراتين 4 (krt4) 5. نسخة معدلة من النسخي المنشط GAL4، وهي KalTA4 يمكن التعبير عن HRAS G12V تحت سيطرة المنبع تفعيل تسلسل (UAS). للحث مشروط التعبير المنشط النسخي، وقد تنصهر KalTA4 إلى متحولة ملزم يجند المجال من α مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان (ER T2) 7 الذي يربط على وجه التحديد 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. في غياب 4-OHT لا بد من ER T2 في السيتوبلازم من البروتينات الحرارة صدمة. على 4 OHT ملزمة الحرارة في صدمة البروتينات تنفصل، والسماح لإزفاء النووي من KalTA4-ER T2 وتفعيل لاحق من UAS تسيطر الجينات في المصالح 8 (الشكل 1C، ب). كما يعتمد هذا النظام التعبير عن وجود 4 OHT، وKalTA4 تسيطر تعبير عن الجينات في المصالح هو عكسها. وعلى النقيض من لجنة المساواة العرقية-ER T2 / نظام السلمون المدخن، الأمر الذي يؤدي إلى حدث إعادة التركيب لا رجعة فيه، وتحريض تفعيل النسخي التي كتبها KalTA4-ER T2 هو عكسها عن طريق إضافة أو إزالة 4-OHT.

وألو بروتوكول التالية WS تحولا مشروط من خلايا الجلد في يرقات الزرد ومراقبة لاحقة من التفاعل مع الخلايا المناعية الفطرية التي كتبها الفلورسنت التعبير البروتين. المنهجيات الأساسية المستخدمة في هذا البروتوكول هي مماثلة لبعض التقنيات المستخدمة عادة داخل المجتمع الزرد 9-13.

توليد واستخدام توفيقية من خطوط المعدلة وراثيا مع Microinjection من يبني المعدلة وراثيا تمكن نهج عابرة فقط لتحويل الخلايا واحد بطريقة الفسيفساء. نفاذية الأكسجين من الجنينية واليرقات الجلد الزرد تثير إمكانية لمرور الزمن الدراسات التصوير الحي من قبل عالية الدقة المجهر من ساعات إلى أيام. وعلاوة على ذلك، فإن الوصول إلى الأدوية للذوبان في الماء تسمح دراسات الآلية المستقبلية ورصد الأحداث البيولوجية خلية في الجسم الحي والتي قد تؤدي إلى فهم أفضل للالمراحل الأولى من تطور مرض السرطان.

_content "> هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأداء مشروط التعبير الجيني في أي نوع من الأنسجة من الاهتمام في يرقات الزرد، بطريقة الفسيفساء. يمكن للمرء أيضا تحسين وضع المجهر في سبيل العيش صورة أعمق الأنسجة الأخرى من الجلد.

Protocol

وأجريت الإجراءات التجريبية التالية بما يتفق بدقة مع الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986.

1. إعداد البلازميد الحمض النووي ل microinjection

  1. تنقية البلازميد pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP مع DNA البلازميد عدة التجارية تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتمييع DNA البلازميد إلى تركيز المحلول النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. خطي ترانسبوزاز التي تحتوي على البلازميد pT3TS / Tol2 14 بواسطة إنزيم BamHI تقييد الهضم، وبعد بروتوكول الشركة المصنعة. هذه الخطوة يمكن أن تمتد بين عشية وضحاها. ترسيب الحمض النووي خطي من قبل استخراج الفينول / الكلوروفورم، في أعقاب بروتوكول قياسي.
  3. في المختبر نسخ الرنا المرسال ترانسبوزاز من البلازميد خطي مع مجموعة النسخ التجارية لكميات كبيرة من الحمض النووي الريبي توج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وتمييع وقسامة لتركيز المحلول النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر في nuclease خالية من المياه. ضمان الجودة من الحمض النووي الريبي المنقى مع الأم 1-2٪ TAE (40 ملي تريس، 20 ملم حمض الخليك، 1 ملم EDTA) الاغاروز الكهربائي هلام (80-120 V). تخزين الحمض النووي الريبي في -80 ° C.

2. Microinjection من البلازميد الحمض النووي للعابر التعبير الجيني

  1. إعداد لوحة حقن الاغاروز لعقد البويضات المخصبة خلال الحقن. صب السائل 3٪ الاغاروز إلى 90 مم طبق بتري. دع بارد الاغاروز إلى 40-50 درجة مئوية وإضافة حقن مكروي العفن على شكل وتد-TU-1 على رأس الاغاروز السائل. بعد تصلب في درجة حرارة الغرفة، والسماح للبقية الاغاروز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل إزالة العفن. قوالب حقن مكروي تخزين عند 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها.
  2. إعداد قسامة من الحل الحقن. نفذ الخطوات التالية على الجليد. ماصة 1 ميكرولتر من DNA البلازميد (تركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر)، 2 ميكرولتر من ترانسبوزاز مرنا (النهائي تركيز 20 نانوغرام / ميكرولتر)، 2ميكرولتر من 10 ملغ / ميكرولتر رودامين B ثيوسيانات-ديكستران، 2 ميكرولتر من حل 5X Danieau (290 مم كلوريد الصوديوم، 3.5 ملي بوكل، 2 ملي MgSO 3 ملي كا (NO 3) 2، 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6) إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر في nuclease خالية من المياه.
  3. إعداد الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات من 1 مم تحتوي على خيوط الداخلي عن طريق سحب الشعرية في اتجاهين متعاكسين مع ممص مكروى بولير. استخدام البرنامج التالي: حرارة 530، وسحب 200، سرعة 80 و 150 مرة.
  4. شغل إبرة واحدة مع 2 ميكرولتر من محلول الحقن (أبقى على الجليد). تجنب الفقاعات من خلال سحب بعناية غيض microloader حين الافراج عن حل في شعري. كسر بعناية غيض من الإبرة مع ملقط.
  5. تنظيم حجم الانخفاض مع مضخة هوائية بيكو. قياس قطرة قطره / حجم (V = 4/3 πr 3) وضبط حجم الانخفاض مع ميكرومتر العين تحت المجسام في dimethylpolysiloxane. ونحن نوصي100 ميكرون، أي ما يعادل 0.5 NL. هذا يؤكد تركيزات موحدة وقابلة للتكرار في كل جنين حقن. عاير تركيز حقن وضبط كل بناء وإعداد البلازميد.
  6. ضع بيضات ملقحة (الشكل 1A) التي تم الحصول عليها من كرة عرضية من تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 15 مع تيراغرام (lysC: dsRed2) nz50Tg 16 في قوالب من لوحة حقن عن طريق استخدام 3 مل pastette. وفي الوقت نفسه، والحفاظ على غيض من قبل مستعدة حقن إبرة في dimethylpolysiloxane لتجنب الحل من تجفيف والتخثر.
  7. حقن قطرة premeasured (100 ميكرون الموافق 0.5 NL) تحت المجسام من خلال المشيمه في blastodisc 17، قبل أن الانقسام الأول (الشكل 1A). الحقن في مرحلة خلية واحدة يزيد من احتمال وجود توزيع موحد من DNA البلازميد وRNA في كتلة الخلايا النامية وإمكانية انتقال سلالة الجرثومية. ومنالجدير بالذكر أن التعبير عن ثوابت في كثير من الأحيان يميل إلى أن يكون الفسيفساء.

3. الشرطي تحول الجلد خلية بنسبة 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)

  1. نقل الأجنة حقنه في حل 0.3x Danieau والاحتفاظ بها في 28.5 درجة مئوية في حاضنة. إزالة بويضة غير مخصبة من الطبق في المجال المرحلة 17. وحقن شارك رودامين B ثيوسيانات-ديكستران يمكن استخدامها كعنصر تحكم حقن تحت المجسام الفلورسنت.
  2. الأجنة الشاشة في 24 HPF (التسميد آخر ساعة) للتعبير القلب من EGFP. مواصلة رفع cmlc: EGFP الأجنة الزرد إيجابية حتى 72 HPF. ترصد بدقة نوعية المياه (0.3x Danieau).
  3. إزالة المشيماء تلك الأجنة التي لم تفقس مع ملقط في 72 HPF. كزة بعناية المشيماء مع 1 ملقط وتسحبه بعيدا باستخدام البعض. اختر الأجنة لlysC: dsRed2 التعبير باستخدام المجسام الفلورسنت.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 10 مليالأسهم من (Z) -4-Hydroxytamoxifen إلى 20 مل من محلول 0.3x Danieau (تركيز النهائي من 5 ميكرومتر). استخدام 4-OHT الحث-حل لطبق بيتري قياسي واحد (90 ملم) على دفعة من 40-60 الأجنة.
  5. نقل الأجنة في طبق بتري جديدة تحتوي على 20 مل من تقدم طازجة الحث-حل. لديه 4-OHT ليتم تخزينها والتعامل معها في الظلام. قد يتم الكشف عن أول علامات التعبير 2 ساعة بعد تحريض بدء. في خطوة الاستقراء يمكن تمديد بين عشية وضحاها، مع الأخذ في الاعتبار أن الأولية الخلية المضيفة: التفاعلات الخلية سابق للورم يمكن أن يحدث بالفعل بعد ساعات قليلة من العلاج.

4. تصاعد وتصوير لايف من اسماك الزرد اليرقات

  1. إعداد 60 مم طبق بتري عن طريق إدخال حفرة يبلغ قطرها 18-20 ملم. استخدام عالية فراغ سيليكون الشحوم لتغطية وختم ثقب في الجزء السفلي الخارجي للطبق بيتري مع 25 مم الغطاء الزجاجي (الشكل 1B).
  2. إعداد 1٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز. الحفاظ على واحد أنبوب 1.5 ملمن LMP الاغاروز عند 37 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
  3. تحديد مسبق تيراغرام (krt4: KalTA4-ER T2، UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) اليرقات لالخضراء الفلورسنت خلايا الجلد وdsRed2 إيجابي الفطري التعبير الخلايا المناعية، تحت المجسام الفلورسنت. تخدير اليرقات عن طريق إضافة 1 مل من تريكين 18 0.4٪ إلى الحل تحريض 20 مل.
  4. نقل اليرقات انتقاؤه مع pastette في الاغاروز LMP السائل. السماح لليرقات تغرق في LMP الاغاروز ونقلها على الزجاج غطاء (الشكل 1B). توجيه الأجنة تحت المجسام. اليرقات يجب أن توضع مباشرة على الزجاج لتقليل المسافة العمل (حتى 6 اليرقات).
  5. تغطية الاغاروز LMP مع تريكين تحتوي على حل تحريض بعد أن تصلب (الشكل 1B السهم).
  6. صورة اليرقات جزءا لا يتجزأ باستخدام الفلورسنت المقلوب، ليزر المسح الضوئي أو القرص الغزل المجهر متحد البؤر. استخدام 40X 63X أوالهدف كأهداف مع مسافات العمل الطويلة تمكن تركز من خلال يرقات بأكملها.

Representative Results

تم جمع nz50Tg 10-15 دقيقة بعد الإخصاب (الشكل 1A) للحصول على 1-مرحلة خلية الأجنة بيضات ملقحة من عبور بين تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 وتيراغرام (dsRed2 lysC). بعد الحقن أثيرت الأجنة حتى 3 DPF، قبل الاستقراء مع 4-OHT وتصاعد للتصوير الحية (الشكل 1B). 2-6 بعد ساعة الاستقراء وضعت الأجنة التي شنت إما تحت المجهر الفلورسنت المقلوب (الشكل 2A) أو مجهر مقلوب مبائر (الشكل 2B-C) وتصويرها لمدة 2-3 ساعة مع فترات 1.5 دقيقة. ويمكن تحديد خلايا الجلد السطحية سابق للورم عن طريق التشكل أكثر تنوعا مقارنة مع الخلايا الكيراتينية العادية، فضلا عن الانبعاثات الفلورية الخضراء للغشاء محلية EGFP-HRAS G12V. وقد تم اختيار مناطق التصوير للمشاركة في توطين سابق للورم خلايا الجلد والخلايا المناعية الفطرية (الشكل 2A رأس السهم). نظرا لMIG سريععملية التموينية من العدلات تم اختيار فترات الوقت الفاصل بين أن يكون بين 1-1.5 دقيقة مع Z كومة خطوة أحجام 0،7-1،7 ميكرون للحصول على أقصى قدر من التوقعات شدة (الشكل 2، فيديو 1). وهناك مجموعة واسعة من السلوكيات التي يمكن ملاحظتها في حين التصوير الحي: العدلات تهاجر بجوار وتحت خلايا سابق للورم (الشكل 2C، فيديو 1)، تشكل اتصالات مباشرة إلى الخلايا (الشكل 2B و C)، وإزالة بقايا خلايا سابق للورم أن الخضوع موت الخلايا المبرمج (فيديو 1)، أو بنشاط تبتلع أجزاء من خلايا سابق للورم (لا يظهر). لالتقاط مجموعة كاملة من التفاعلات، فإنه من المستحسن اتباع السلوكيات من خلال الوقت الفاصل بين التصوير الحي.

الشكل (1)
الشكل 1: تخطيطي للالمشروط تحول خلايا الجلد في يرقات الزرد. (A) صورة من البيضة الملقحة من تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) الزرد في 10 دقيقة بعد الإخصاب (MPF). ويحيط البويضة المخصبة من قبل المشيمه (رأس السهم). الموقع للحقن هو blastodisc (النجمة)، التي شكلتها تيارات حشوية من صفار البيض (السهم) الذي يعرف القطب الحيواني من الجنين. (ب) تركيب اليرقات الزرد. 60 ملم طبق بتري مع 18-20 ملم حفرة (رأس السهم) التي مختومة من قبل 25 مم غطاء زجاجي. ويجمد اليرقات الزرد والتي شنت على غطاء زجاجي بنسبة 1٪ الاغاروز آخر دورة شهرية. ويستخدم 0.3x Danieau حل (السهم) التي تحتوي على 5 ميكرومتر 4-OHT لتغطية الاغاروز LMP. (C) 4-OHT الناجم عن التحولات من خلايا الجلد السطحية. (أ) تخطيطي عبر الملف الشخصي قطاعات من الجلد اليرقات. يتكون الجلد الجنينية واليرقات من طبقتين الخلايا الظهارية، وهي طبقة الخلايا السطحية وطبقة الخلايا القاعدية من الخلايا الكيراتينية التي تتصل الغشاء القاعدي الأساسي (BM). (ب) التعبير عابر النظام رس لحث على استنساخ الخلايا سابق للورم بين خلايا الجلد السطحية. وأعرب عن KalTA4-ER T2 حصرا في طبقة الجلد الأبعد مدفوعا المروج krt4 (الصفراء). التعبير فسيفساء من KalTA4-ER T2 ينشط UAS للرقابة (الأزرق) EGFP-HRAS G12V التعبير في الخلايا السطحية، مما يؤدي إلى استنساخ الخلايا سابق للورم (الخضراء). (D) تخطيطي لنظام التعبير عابر. (أ) كاسيت Tol2 لل pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP ناقلات التعبير المستخدم عابر (ب) الحث الشرطي التعبير المنشط النسخي. وتنصهر KalTA4 إلى متحولة ملزم يجند مجال الاستروجين البشري مستقبلات α (ER T2) الذي يربط على وجه التحديد 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). في غياب 4-OHT لا بد من ER T2 في السيتوبلازم من البروتينات الحرارة صدمة (Hsp90). على 4 OHT ملزمة Hsp90 يتفكك، والسماح لإزفاء النووي من KalTA4-ERT2 وتفعيل لاحق من UAS تسيطر EGFP-HRAS G12V التعبير. مقياس شريط A = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تصوير مباشر من سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية. (AC) صور ل4 DPF تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) الجنين الذي تم حقنه مع pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP وترانسبوزاز مرنا في مرحلة خلية واحدة. واتخذت صورة بعد 6 ساعات من 4 OHT الاستقراء (A) نظرا الجانبي المنطقة tailfin في 6 ساعات بعد العلاج، وتبين بقع من EGFP-HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد (السهم)، وlysC: dsRed2 + العدلات (رأس السهم). (BC) صور الممثل تاكين من متحد البؤر فيلم مرور الزمن، والتي تبين العدلات (أحمر) التفاعلات مع EGFP-HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد (الخضراء). (ب) خلية سابق للورم تشكل امتدادا filopodial قصيرة مع الاتصال العدلات (رأس السهم). (C) العدلات (الأحمر) هو على اتصال وثيق لاستنساخ خلايا الجلد سابق للورم (الخضراء). شريط النطاق في A = 100 ميكرون. B / C = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1 : الوقت الفاصل بين التصوير المباشر لسابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية. الوقت الفاصل بين 4 DPF تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) الجنين، حقن مع pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP وترانسبوزاز مرنا في مرحلة خلية واحدة. متحد البؤر فيلم الوقت الفاصل بين الفترة من 6-9 حواورس بعد 4-OHT تحريض تظهر lysC: dsRed2 + العدلات (أحمر) التفاعلات مع EGFP-HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد (الخضراء). العدلات تهاجر بجوار وتحت خلايا سابق للورم وإزالة بقايا خلية سابق للورم أن يخضع لموت الخلايا المبرمج. فترات الوقت الفاصل بين 1.5 دقيقة أكثر من 3 ساعة مع Z كومة خطوة الأحجام من 1.3 ميكرون.

Discussion

خلال مرحلة التطور الجنيني ونمو اليرقات، ويتكون الجلد الزرد الجنينية من طبقتين الظهارية، وطبقة سطحية دعا محيط بالأدمة وطبقة من الخلايا الكيراتينية القاعدية التي تعلق على الغشاء القاعدي الأساسي 19 (الشكل 1C، أ). بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة واضحة للحث مشروط تحول الخلية سابق للورم في طبقة الجلد السطحية لليرقات الزرد، ويسمح للتحليل التفاعل لاحق مع الخلايا المناعية الفطرية عن طريق التصوير الحي. المنهجيات الأساسية في بروتوكول لدينا تتبع تقنيات الزرد راسخة 9-13، وبروتوكول لدينا يمكن أن تتكيف بسهولة وتعديلها.

المروج krt4 5 المستخدمة هنا يدفع KalTA4-ER T2 التعبير على وجه التحديد في طبقة الجلد الأبعد (الشكل 1C، ب). ومع ذلك، فإن وحدات متعددة المواقع بوابةاستنساخ استراتيجية، وتستخدم لتوليد krt4: KalTA4-ER T2 بناء (1D الشكل، أ)، ويوفر إمكانية استنساخ أي مروج للاهتمام أمام KalTA4-ER T2 في خطوة الاستنساخ واحدة. للتكيف من طريقة المقدمة في هذه الوثيقة هو بالتالي من الممكن بالنسبة لمعظم الأنسجة خلال مرحلة التطور الجنيني ومراحل اليرقات. توافر تسلسل المروج هو بهذا العامل المحدد. وعلاوة على ذلك، أي ما يقرب من الجينات في المصالح المستنسخة وراء UAS يمكن overexpressed مشروط في مراحل تنموية مختلفة عن طريق استخدام والمكاني وتسيطر زمنيا التعبير KalTA4-ER T2. لذلك، لدينا بروتوكول يمكن تكييفها لأداء مشروط التعبير الجيني في أي نوع من الأنسجة من الاهتمام في يرقات الزرد، بطريقة الفسيفساء. يمكن للمرء أيضا تحسين وضع المجهر في سبيل العيش صورة أعمق الأنسجة مثل الكبد أو البنكرياس.

وصفناها تطبيق واحد باستخدام بروتوكول انهإعادة، وبالمثل، يمكن للمرء أن بإفراط عن جهري التهاب الأخرى التي تستخدم هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الاستجابات الالتهابية، باعتبارها واحدة يمكن أن يعيش بسهولة العدلات صورة والتغيرات السلوكية بلعم التالية تحريض واعتقال في التعبير عن المغير التهابات مرشح. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول تكييفها أيضا أن يكون مفيدا لأولئك الذين يريدون لتتبع حركة الخلية وتغيير السلوك خلال مراحل مختلفة من التشكل الأنسجة وتشكيل هيئة وصورة حية أخيرا تفاعل الفطرية تفاعلات الخلايا المناعية مع غيرها من الأنساب الخلية المحددة التي يمكن أن تستهدف قبل KalTA4-ER نظام T2 / UAS التعبير محرض.

استخدمنا ناقلات pDestTol2CG من Tol2kit الزرد 23 - 20 التي تحتوي على cmlc2: EGFP والسلطة الفلسطينية كاسيت (1D الشكل، أ) والتي تتيح اختيار لاحقة من الأجنة التي كتبها الخضراء الفلورسنت قلوب إيجابية باعتباره حد ذاتهافصل من الكتاب المقدس علامة 20 التي تبسط عملية الفرز F0. ومما يسهل والإدراج المستقر للينقول يحيط الجينات في المصالح في الجينوم من شارك في حقن الحمض النووي البلازميد مع ترانسبوزاز مرنا. إعداد DNA البلازميد ومرنا ترانسبوزاز ل microinjection يتبع البروتوكولات القياسية. ومع ذلك، فإن التكامل الناجح للبناء في الجينوم يعتمد على تبديل استنادا Tol2-14. هذا يسلط الضوء على اهتمام خاص لدفعها إلى العمل على الجليد تحت ظروف معقمة لتجنب التلوث والتدهور التي كتبها RNases وDNases. حقن مكروي في خلية واحدة الأجنة مرحلة هي تقنية قوية وراسخة لتحقيق مكاسب وخسائر من الدراسات وظيفة في 9،10 الزرد. على الرغم من أن الشخص المدربين تدريبا جيدا يمكن حقن بسهولة في صفار البيض من أكثر من 1،000 الأجنة في 1 ساعة، والحقن في blastodisc (الشكل 1A، النجمة) يتطلب المزيد من الخبرة والتدريب. الحرجة أثناء هذا الإجراء طليالي التعامل مع الإبرة. الإبرة يجب أن تكون رقيقة جدا لاختراق الخلية دون ضرر، وبالتالي لابد من كسر فقط على طرف ذاته. من المهم للسيطرة بانتظام وقياس حجم انخفاض خلال الحقن لضمان حقن موحد في كل جنين. التعامل معها بعناية، الإبرة يمكن أن تستخدم لتدوير الجنين. وغالبا ما يحتاج هذا للعثور على blastodisc وزاوية الاختراق المثلى.

تركيز الحمض النووي وترانسبوزاز مرنا المستخدمة للحقن يكاد يكون من المؤكد يؤثر على كفاءة التعبير. الجرعات العالية يمكن أن يؤدي إلى زيادة نسبة الخلايا معربا عن التحوير ولكن مع تركيزات أعلى من الحمض النووي (> 50 نانوغرام / ميكرولتر) وترانسبوزاز مرنا (> 100 نانوغرام / ميكرولتر) أيضا إمكانية الآثار السامة بين الأجنة المحقونة لا تنشأ. ونحن نحبذ استخدام 10 نانوغرام / DNA ميكرولتر و 20 نانوغرام / ميكرولتر ترانسبوزاز مرنا للحقن، والتي تتطابق إلى 50 خريج من DNA البلازميد و 100 خريج من الحمض النووي الريبي في الإدارة الانتخابية حقنريو. 100٪ من الأجنة المحقونة مع هذه التركيزات لا تتطور بشكل طبيعي، وبين 40-70٪ عرض EGFP-HRAS G12V التعبير، وبعد 4-OHT الاستقراء، وهذا يتوقف على كفاءة الحقن في خلية واحدة. بين الأجنة إيجابية ونحن عادة تجد ما يقرب من 30٪ أن يكون 1-10 استنساخ، و 40٪ أن يكون 10-50 استنساخ و 30٪ وجود أكثر من 50 الحيوانات المستنسخة. نظرا لأهداف أبحاثنا، فإننا نفضل استخدام الأجنة مع عدد أقل من الحيوانات المستنسخة معربا عن EGFP-HRAS G12V. نختار الأجنة مع 10-50 استنساخ لتجارب عابرة لدينا. لتوليد الأسماك مؤسس المعدلة وراثيا، ونحن نوصي لتحديد الأجنة مع كل من EGFP علامة القلب الإيجابية وعدد كبير من الحيوانات المستنسخة إيجابية EGFP-HRAS G12V في البشرة بهم فقط.

(Z) -4-Hydroxytamoxifen يخضع لرابطة الدول المستقلة العابرة (EZ) interconversion عند تعرضها للضوء 24 ساعة. وقد وجد أن الأيزومر رابطة الدول المستقلة (E) هو 100X أقل المضادة للاستروجين من نظيره العابرة لل25،26. Exposurلذا الإلكترونية للضوء لابد من تجنبها. الحل الأسهم 4-OHT المذاب في الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام على مدى فترة زمنية طويلة. من المستحسن استخدام مربع لحماية أطباق بتري من خلال ضوء الهدف تحريض الجينات داخل الحاضنة والنقل. على الرغم من أن مجال التصوير صغيرة جدا وتعرض 4-OHT للأشعة فوق البنفسجية يتم تقليل إلى أدنى حد ممكن، تبادل مستمر من حل تحريض كل 2 ساعة بينما يوصى التصوير على مدى فترات زمنية أطول للحفاظ على مستويات التعبير القصوى. 4-OHT permeabilizes بشكل فعال من خلال المشيمه وطبقات الجلد الأبعد خلال مرحلة التطور الجنيني الزرد، وبالتالي فإنه يمكن أن تحفز التعبير الجيني بسرعة كبيرة. يمكننا أن نلاحظ بسهولة الانبعاثات EGFP بعد 2 ساعة من الحث وتم الإبلاغ عن أن العلامات الأولى للتعبير الجينات المستهدفة ويمكن ملاحظة بعد 1 ساعة والهضبة بعد 3 ساعات من العلاج 8. قد يكون الاختلاف يرجع إلى المروج المختلفة المستخدمة في دراستنا. كما تم العلاقات العامةذكرت eviously أن 4-OHT العلاج جرعة يعتمد 8،27، اخترنا لاستخدام أعلى تركيز المبلغ عنها من 5 ميكرومتر لتحقيق مستويات التعبير قوية وقابلة للتكرار في نهجنا عابر. وهذا ينبغي أن نضمن أن كل الخلايا التي تحمل التحوير من شأنها أن تحفز التعبير الجيني الهدف.

أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن نهج عابرة المقدمة هنا يمكن أن يؤدي إلى تفاوت مستويات التعبير نظرا لإمكانية متعددة وعشوائية الأحداث الجينوم الإدراج. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مرنا ترانسبوزاز في Tol2 الخلفية المعدلة وراثيا من تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 يمكن أن يؤدي إلى التبديلات المحتملة للالتحوير UAS التي يمكن أن تؤدي في إسكات الجينات أو التعطيل. ومع ذلك، كما أن طريقة المقدمة هنا يمثل نهجا عابرة، والاختيار من الأجنة لاحقة لحقن إلزامي. وقد وجدت العديد من المختبرات التي متواليات UAS تميل إلى أن تصمت في النسل المعدلة وراثيا، وبالتالي فيحقن ثنائي في pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP بناء في تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 الأجنة قد لا تكون فعالة مثل حقن UAS بناء في تيراغرام (krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: GFP ) الأجنة. استخدام خط المعدلة وراثيا مستقر تيراغرام (krt4: KalTA4-ER T2) عبروا مع تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 سيسمح للرصد الدقيق للتشغيل / إيقاف حركية الوقت جرعة يعتمد التنشيط الجيني 4-OHT .

خطوة حاسمة خلال تصاعد اليرقات هي نقل إلى الاغاروز LMP وعلى غطاء زجاجي (الشكل 1B). هو فقط هناك فترة زمنية قصيرة للسائلة في درجة الحرارة LMP الاغاروز التي تسمح للنقل آمنة والتوجه لليرقات انتقاؤه دون الإضرار الأسماك إما عن طريق الصدمة الحرارية أو تصلب هلام. يجب الموجه اليرقات مباشرة على الزجاج غطاء للحد من مسافة العمل لanaly المجهري لاحقجهاز الأمن والمخابرات. وهذا يمكن أن يكون عاملا يحد من خلال الفحص المجهري اختيار الأهداف المناسبة إلزامي. مرة واحدة محمولة، اليرقة يمكن الحفاظ على من ساعات إلى أيام.

ومشروطية في النظام النموذجي المقدمة في هذه الوثيقة يسمح للتحول المتكررة من جانب تفعيل 4-OHT من التحوير. نظام التعبير يعتمد على وجود 4 OHT وبالتالي KalTA4 تسيطر تعبير عن الجينات في المصالح هو عكسها (1D الشكل، ب). وعلى النقيض من لجنة المساواة العرقية-ER T2 / نظام السلمون المدخن، مما يسهل على الجيني لا رجعة فيه الحدث إعادة التركيب 28، KalTA4-ER T2 / UAS يمكن تفعيلها وأبطل مفعولها على إضافة أو إزالة 4-OHT وهذه الإمكانات لتحريض المتكررة هي ميزة من هذه التقنية خلال لجنة المساواة العرقية-ER T2 نظام / السلمون المدخن. ومع ذلك، فإن شرط لمستويات ثابتة من 4 OHT وجود قيود إذا كانت التجربة لابد من فترات طويلة من أيام إلى أسابيع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen Sigma Aldrich H7904 dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C
20X Objective Zeiss 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Objective Zeiss 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Objective Zeiss 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17
BamHI New England Biolabs R0136S
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 META
Cover glass VWR 631-0171 Diameter 25 mm
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPSV
Dow Corning high-vacuum silicone grease  Sigma Aldrich MKBL4135V
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller Sutter Instruments Co. P-97 Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150
Fluorescent stereoscope  Leica M205 FA
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Microinjection mold TU-1 Adaptive Science Tools TU-1
Microloader tip Eppendorf 930001007
Microscope Zeiss Axiovert 200
mMESSAGE mMACHINE Kit Ambion AM1348
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Pneumatic pico pump World Precision Instruments  PV820 
Pneumatic pico pump Warner Instruments PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh
QIAprep Spin Miniprep Kit Quiagen 27106
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma Aldrich R8881 10 mg/μl in water
Stereoscope Leica M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaine/MS-222 Sigma Aldrich A5040
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-100
UltraPure Low Melting Point Agarose  Invitrogen 16520-050
UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol Invitrogen 15593-031 25:24:1, v/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
  2. Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8, (12), e1000562 (2010).
  3. Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22, (13), 1253-1259 (2012).
  4. Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5, (2), 97-110 (2008).
  5. Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223, (2), 204-215 (2002).
  6. Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  7. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237, (3), 752-757 (1997).
  8. Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140, (10), 2235-2243 (2013).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  11. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
  12. Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
  13. Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
  14. Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2, (11), e169 (2006).
  15. Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5, (12), e15170 (2010).
  16. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203, (3), 253-310 (1995).
  18. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
  19. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48, (2-3), 217-231 (2004).
  20. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  21. MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
  22. Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6, (9), e10 (2011).
  23. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
  24. Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47, (12), 2387-2393 (1982).
  25. Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38, (5), 737-743 (1990).
  26. Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25, (2), 127-205 (1984).
  27. Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9, (3), e92217 (2014).
  28. Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4, (2), e4640 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics