Fluorescens Baserad Primer Extension teknik för att bestämma Transkriptionsstartpunkter och Cleavage platser av RNaser

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schuster, C. F., Bertram, R. Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo. J. Vis. Exp. (92), e52134, doi:10.3791/52134 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens primer förlängning (FPE) är en molekylär metod för att bestämma transkriptionutgångspunkter eller bearbetningsanläggningar RNA-molekyler. Detta åstadkommes genom omvänd transkription av RNA: t av intresse med användning av specifika fluorescensmärkta primrar och efterföljande analys av de resulterande cDNA-fragment genom denaturerande polyakrylamidgelelektrofores. Samtidigt, är en traditionell Sånger sekvenseringsreaktion kördes på gelén för att kartlägga ändarna av cDNA-fragmenten till deras exakta motsvarande baser. I motsats till 5'-RACE (Rapid Amplification av cDNA Ends), där produkten ska klonas och flera kandidater sekvenser, kan huvuddelen av cDNA-fragment som genereras av primerförlängning samtidigt detekteras i en gel körning. Dessutom kan hela proceduren (från omvänd transkription till slutlig analys av resultaten) fyllas i en arbetsdag. Genom användning av fluorescensmärkta primrar, användningen av farliga radioaktiva isotopmärkt reagenskan undvikas och handläggningstiderna reduceras som produkter kan upptäckas under elektroforesförfarandet.

I följande protokoll, beskriver vi en in vivo fluorescerande primerförlängning metod för att på ett tillförlitligt och snabbt upptäcka 5'-ändarna av RNA att härleda transkriptionsutgångspunkter och RNA-bearbetningsställen (t.ex. genom toxin-antitoxin systemkomponenter) i S. aureus, E. coli och andra bakterier.

Introduction

Primerförlängning 1 är en molekylär metod för att bestämma 5 'ändarna av specifika RNA-molekyler upp till en en bas upplösning. Fördelen med att andra metoder, såsom 5'-RACE (snabb amplifiering av cDNA-ändar) är den snabba produktionstiden och förmågan att enkelt analysera en blandning av olika längder av RNA-molekyler.

Denna metod fungerar genom att utsätta RNA-molekyler för att omvänd transkriptionsreaktioner med användning av specifika fluorescerande primrar, genererande cDNA-fragment av vissa längder. Dessa cDNA-molekyler körs parallellt traditionella Sanger sekvenseringsreaktioner 2 på denaturer polyakrylamidgeler och kan detekteras genom sin fluorescens på grund av användningen av fluorescerande primers. Längderna av de cDNA-fragment bedöms sedan genom jämförelse med sekvenseringsstege, vilket gör att avbildningen av 5 'RNA-ändar.

Traditionellt är primer-förlängningsreaktioner som används i sambandmed radioaktiva isotoper för att detektera cDNA-molekyler på röntgenfilmer. På grund av hälsorisker, frågor avfallshantering och enkel hantering, nyare protokoll utnyttjar fluorescens för detektion av primerförlängning med automatiserade sequencers, även om deras känslighet är något lägre. Använda fluorescerande primers, kan det återkommande procedur radioaktiva märkningen utelämnas, som fluorescerande primers är stabila under en längre tid (mer än ett år i våra händer).

Den metod som vi beskriver här använder en automatiserad gel sequencer, men med smärre ändringar, kan kapillär sequencers också användas för cDNA separation och detektion 3. Parallell natur gelanalys gör det möjligt att upptäcka även en liten mängd av RNA klyvning eller behandling. En annan fördel är den höga upplösningen av denna metod, som terminal klyvning eller bearbetning av en enda bas kan detekteras.

När det gäller upptäckt av RNA klyvning eller behandling, typically två olika typer av primer-extensions särskiljs. I ett fall är den enzymatiska behandlingen sker in vitro med användning av renat RNA och renat enzym, medan det i det andra fallet är det behandlats in vivo och den resulterande RNA renas. I båda fallen är det RNA utsattes för en primerförlängning utförs in vitro, dock beroende på källan av RNA, är förfarandet antingen kallas en in vitro eller in vivo primerförlängning. I det protokoll som vi presenterar här fokuserar vi enbart på in vivo primerförlängning, på grund av användarvänlighet (inga renade proteiner behövs) och möjligheten att bestämma transkriptionsutgångspunkter och bearbetning på samma gång. Men primer in vitro extensions i princip ställa in på samma sätt och detta protokoll kan tjäna som utgångspunkt.

Metoden som illustreras här kan tillämpas på många bakteriearter, så länge som de är mottagliga för högrenhet och högt utbyte beredning av nukleinsyror.

Forskningen i vårt labb fokuserar på den rättsliga räckvidden av toxinantitoxin (TA) system 4,5, ett område där det primerutsträckning metoden används flitigt. TA-system är små genetiska element som finns i prokaryota genom som består av en stabil och endogent aktiv toxiskt protein och en mestadels instabil protein eller RNA antitoxin som motverkar toxicitet 6,7. Toxinaktivitet ibland utövas av inhibering av replikation, cellväggssyntes eller andra mekanismer, men mest genom RNas-aktivitet 8,9. Typiskt är RNas specificitet bestämdes genom att utföra olika tester, av vilka en är den primerförlängning metoden. Primerförlängning reaktioner är väl lämpad för denna tillämpning, såsom en blandning av kluvna och fullängdsfragment kan samtidigt analyseras för att bestämma deras 5'-ändar. Med hjälp av en blandning av in vitro och in vivo primer förlängningar, denspecifika toxin RNas klyvning, t.ex. sekvensspecificiteten kan bestämmas 10-13.

Figur 1
Figur 1. Översikt av primerförlängning förfarandet. Bakteriella kulturer inkuberas och behandlas i enlighet med de experimentella behov. Total RNA extraheras från cellerna, som behandlats med DNas för att avlägsna DNA-spår och utsattes för en omvänd transkription reaktion med användning av målgruppspecifika fluorescerande DNA-primers som ger cDNA. Genomiskt DNA eller plasmider extraherades och därefter används för fluorescerande Sangers sekvenseringsreaktioner för storleksjämförelse med cDNA-fragmenten. Primerförlängningsprodukter körs parallellt Sanger sekvenseprodukter på en denaturer urea polyakrylamidgel och analyserades med en automatiserad laser och mikroskop. Kartläggningen bas som ställer upp med cDNA-bandet är last bas av 5'-cDNA-änden (blå pil). Mer information på Fekete et al. 3 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

En översikt av hela primerförlängning förfarande kan hittas i figur 1. I korthet, bakteriella cellerna odlas, skördas, cellpelleten lyserades och RNA extraherades. Renat RNA behandlas sedan med DNas I för att avlägsna spår av DNA-molekyler som kan fungera som mallar för det omvända transkriptaset. Specifika fluorescenta primrar adderas till RNA, hybridiserade till regionen av intresse och därefter transkriberas omvänt, vilket resulterade i enkelsträngat komplementärt DNA (cDNA). En sekvenseringsstege skapas av traditionella Sånger-sekvensering med användning av fluorescenta primrar och separerades på en denaturerande polyakrylamidgel vid sidan av de primer-förlängnings cDNA-fragment. Den resulterandegelén analyseras genom att jämföra de fluorescerande band, vilket möjliggör identifiering av den 5 'ändarna av intresse. Transkriptionsutgångspunkter och behandlingsplatser bedöms sedan individuellt av sekvensjämförelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. High Yield-RNA Förberedelse

  1. RNA-isolering
    OBSERVERA: Höga koncentrationer av totalt RNA krävs för primerförlängningsreaktionen. Spin kolumn kit vanligtvis inte ger den mängd RNA som behövs (~ 5-16 mikrogram i 5 ^ volym). Därför rening med hjälp av syra guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform extraktion metod rekommenderas, beskrivs nedan.
    OBS: Fenol är cancerframkallande, giftiga och frätande. Läs säkerhetsdatablad och använda under en huv med lämpligt skydd!
    1. Växa eller behandla bakterieceller (S. aureus eller E. coli i det här exemplet) som önskat och skörd genom 10 min centrifugering vid 4600 x g och 4 ° C. Anm: Normalt skördar vi en total OD 600 av 20 - 70. Cellpellettar kan lagras under flera veckor vid -20 ° C.
    2. Resuspendera cellpelleten i 1 ml av syra guanidinium-tiocyanat-fenol-kloroform-lösning och överför till en2 ml skruvkopp innehållande 0,5 ml 0,1 mm glas zirkonium / kiseldioxidpärlor.
    3. Lyse cellerna tre gånger i snabb prep / pärla visp på 6,5 m / sek i 30 sekunder i tre omgångar, kylning av proverna på is i 5 min efter varje körning. Anm: homogeniserade provet kan lagras vid -80 ° C under flera veckor.
    4. Inkubera lysatet för 5 min vid RT och sedan lägga till 200 | il kloroform.
    5. Skaka eller virvel provet under 30 sekunder för att extrahera RNA.
    6. Inkubera vid RT i 3 min centrifugera sedan i 15 min vid 13.000 - 15.000 x g och 4 ° C. OBS: Lösningsmedel separeras i en lägre organisk fas (rosa, innehåller proteiner), en gränssnitts (vit, innehåller DNA) och en övre vattenfasen (klar, innehåller RNA).
      OBS: Från och med det här steget på användning endast RNas fria reagens och plastartiklar!
    7. Bered en färsk RNas-fri 1,5 ml reaktionsrör, etikett på lämpligt sätt och tillsätt ca 500 l 100% RNas fri isopropanol vardera (använd ungefär samma volume som den vattenhaltiga fasen i den förra rör).
    8. Håll röret i vinkel och överföra vattenfasen (ca 500 l) till de förberedda rören med hjälp av RNas gratis tips. Stör inte interfasen.
    9. Utfällning av RNA genom att vända flera gånger och inkubering under 10 min vid RT.
    10. Centrifugera proverna i 15 min vid 13.000 - 15.000 x g och 4 ° C och avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration (vattenjetaggregat och nappflaska). Stör inte den vita genomskinliga RNA pellet i botten.
    11. Tillsätt 1 ml 70-80% RNas fri etanol (inte vortex) att tvätta. Obs: RNA i etanol kan lagras under flera veckor vid -20 ° C.
    12. Centrifugera i 5 minuter vid 7.500 x g och 4 ° C och kasta supernatanten genom pipettering eller företrädesvis aspiration.
    13. Lufttorka RNA pellets för 15-30 min under dragskåp. Låt inte stryk kanske annars pellets vara svårt att återupplösning.
    14. Återsuspendera pelleten i 50 pl RNas gratis DDH 2 O eller RNA lagringsbuffert.
    15. Mät RNA koncentration med en microvolume UV-Vis spektrofotometer eller en kvartskyvett (och konventionella fotometer) och fortsätt till DNase matsmältningen.
  2. DNas I-digerering av RNA för att avlägsna spår av DNA
    Anmärkning Eftersom DNA kan fungera som en falsk templat i den omvända transkriptionen (primerförlängning) reaktion, bör den tas bort från provet. Olika metoder för att avlägsna DNA från RNA lösningar finns som vanligtvis är beroende av DNas matsmältningen. En enkel men effektiv och kostnadseffektiv metod för DNA-avlägsnande skisseras nedan.
    1. Värm vattenbad till 37 ° C.
    2. Blanda föreningarna uppräknade i Tabell 1 i ett 1,5 ml reaktionsrör.
    3. Inkubera blandningen under en timme vid 37 ° C i ett vattenbad och sedan gå direkt till fenol / kloroform-extraktion. OBS: Värmeinaktivering av DNas rekommenderas inte, eftersom det kan försämra RNA.
    </ Li>
  3. Fenol / kloroform-extraktion av RNA efter DNas I Digestion
    OBS: RNA måste renas för att avlägsna fria nukleotider, DNA-fragment och buffertkomponenter från DNas I digerering. Fenol / kloroform-extraktion medger hög utvinning och koncentrationen av RNA-provet, och är därför skisseras nedan. Andra metoder för RNA-rening kan också användas, om de uppfyller dessa krav.
    1. Dela upp 500 l DNas I nedbrytnings blanda i två 250 ul prover i 2 ml provrör.
    2. Lägg en volym (250 | il) av sur P / C / I-lösning (i vatten mättad fenol, kloroform och isopentanol, förhållande av 25: 24: 1, pH 4,5 till 5).
      OBS: P / C / I lösning är cancerframkallande, giftiga och frätande. Läs säkerhetsdatablad och använda under en huv med lämpligt skydd!
    3. Kraftigt virvel eller plats i en virvel plattform 1 - 3 min.
    4. Centrifugera i 30 minuter vid 13.000 - 15.000 x g och 4 ° C.
    5. Samla den övre (vatten) fasen och överföring till nytt rör (250 l).
    6. Lägg 1/9 volym (28 | il) av 3 M natriumacetat pH 5,2.
    7. Lägg 2.5-3 liter ren etanol (700 l).
    8. Blanda genom att vortexa kort och rum vid -80 ° C under 30 min eller vid -20 ° C under 2-3 h. Om det behövs, lagra RNA O / N vid -20 ° C.
    9. Centrifugera i 30 till 60 min vid 13.000 - 15.000 x g och 4 ° C.
    10. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration.
    11. Tvätta pelleten genom att tillsätta 1 ml av 70% etanol på pelleten. Inte virvelprov.
    12. Centrifugera provet i 5 minuter vid 13.000 - 15.000 x g och 4 ° C.
    13. Avlägsna supernatanten genom pipettering eller aspiration.
    14. Lufttorka pellet under dragskåp. Lagra pelleten vid -20 ° CO / N om det behövs.
    15. Upplös pelleten i 30 | il DEPC-behandlat H2O genom att vortexa i 2 min och använda denna lösning för att lösa upp den peLLET av det motsvarande andra röret per prov (30 ul lösning per en extraktion par).
    16. Mät RNA-koncentrationen, och se till att den överstiger 1 mikrogram / l för användning i primer förlängning av genomsnittligt uttryckta mRNA.
    17. Om det behövs, lagra RNA vid -20 ° C under flera veckor upp till några månader.

2. primerförlängningsreaktion

  1. Primer design
    OBS: När du utformar primers för en primer förlängning experiment lyda allmänna råd PCR primer design (se instruktionerna som medföljer automatiserad gelen sequencer för mer information och diskussion i den här papper).
    1. Specifikt se till att primers (i) inte innehåller serier av baser, (ii) har en G eller C vid 3 'änden, (iii) har en balanserad GC: AT-förhållande, (iv) har en härdningstemperatur på cirka 55-60 ° C, och (v) binder åtminstone 50 bp, bättre 100 bp nedströms av regionen av intresse att erhålla klara bilder.
  2. Primerförlängningsreaktion
    OBS: primerförlängningsreaktion (cDNA-syntes) kräver stora mängder av mall-RNA. Om mängderna av RNA som används väljs till låg, kan signalen vara för låg för att upptäcka! Vi rekommenderar därför rening av RNA som beskrivits ovan.
    OBS: VARNING: Använd RNas fria reagens och plastartiklar !!!
    1. Värm PCR-apparat till en temperatur av 95 ° C och utföra alla ytterligare inkubation steg i en PCR-apparat för enkel användning och reproducerbarhet.
    2. Blanda föreningarna från tabell 2 i ett PCR-rör för varje RNA-prov.
    3. Denaturera prover för 1 min vid 95 ° C.
    4. Placera rören på is och kyla till 5 minuter för att hybridisera RNA och primrar.
    5. Ställ in PCR-maskin till 47 ° C.
    6. Under tiden förbereda omvänd transkription Master Mix som beskrivs i tabell 3.
    7. Tillsätt 4 pl omvänd transkription Master Mix till varje hybridiserade RNAprov.
    8. Inkubera rören i en timme vid 47 ° C. Obs: Den optimala temperaturen för AMV RT är 42 ° C, men högre temperaturer bidra till att lösa sekundära strukturer av RNA-molekyler.
    9. Stoppa reaktionen genom upphettning av proverna till 95 ° C under 2 min.
      OBS: Formamid är frätande, giftigt och kan vara skadligt för det ofödda barnet. Läs säkerhetsdatablad, handtag med omsorg och ha lämpligt skydd!
    10. Lägg 6 | il formamid laddningsfärg (95% (vol / vol) avjoniserad formamid, 10 mM EDTA, 0,05% (vikt / vol) bromfenolblått) och lager för O / N till två veckor vid -20 ° C i mörker.

3. Framställning av den sekvenseringsstege

OBS: Kartläggningen stege reaktionen kräver antingen måttliga mängder plasmider eller höga halter av genomiskt DNA. När det är möjligt, är användningen av plasmider i sekvensen reaktionen rekommenderas på grund av hur lätt isolering och hög SIGnal intensitet. I andra fall, som rutinmässigt använder vi en metod som antagits från Marmur 5,14 förbereda iskt DNA från E. coli och S. aureus-celler utan behovet av att använda fenol. I princip kan vilken som helst metod som ger höga mängder och renhet av genomiskt DNA.

  1. Genomisk DNA-isolering
    1. Grow 10 ml av E. coli eller S. aureus-celler O / N i LB, BM 5 eller TSB-medium.
    2. Skörda cellerna genom centrifugering under 10 min vid 4600 x g i en 15 ml Falcon-rör.
    3. Resuspenderades pelleten i 2 ml buffert P1 som hittas i vissa mini förberedelsepaket (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 | ig / ml RNas A).
    4. Lyserar celler för 45-60 min med 20-40 | il lysostafin (0,5 mg / ml, lagring vid -20 ° C). Obs! För E. coli-celler den enzymatiska förbehandlingen kan antingen utelämnas eller lysozym använts.
    5. Addera 100 pl av en mättad SDS-lösning (i 45% etanol) till suspensionen och incubate för 5 min vid 37 ° C.
    6. Lägg 650 l 5 M NaClO 4 och kort virvelcellerna.
      NOTERA: Kloroform är ett potentiellt karcinogen. Läs säkerhetsdatablad och använda under en huv med lämpligt skydd !!!
    7. Tillsätt 3 ml kloroform / isopentanol (24: 1 ratio) till blandningen och skaka i minst 60 sek. OBS: Vätskan ska förvandlas till en homogen vit emulsion.
    8. Centrifugera provet i 10 min vid 4600 x g och rumstemperatur för att separera faserna.
    9. Försiktigt överföra den klara övre (vattenhaltiga) fasen till ett färskt rör. Om lösningen är grumlig, upprepa kloroform / isopentanol extraktion. Mäta volymen av DNA-lösningen och förbereda ett nytt rör med två volymer etanol (100%).
    10. Långsamt dekantera eller pipett DNA-lösningen i etanol innehållande röret. Obs: DNA ska fälla så transparenta, täta spolar på botten eller när helt uttorkad som ett flytande vitt kluster.
    11. Hämta DNA använder krokar gjorda av glas Pasteur pipetter (figur 2) och tvätta varje prov två gånger genom doppning i ett enskilt rör med 1 ml 70% etanol.
    12. Placera krokarna stående i ett ställ och lufttorka pelleten i 60 min. Om det behövs, lagra den torkade DNA för flera dagar vid RT.
    13. Lös DNA genom att bryta av de DNA-täckta glaskrokar och placering i en 2,0 ml reaktions rör innehållande 100-500 l DDH 2 O. Justera volymen till en slutlig DNA-koncentration av 1,000 - 1,500 ng / l. För en sekvenseringsreaktion, använd 10-18 pg av genomiskt DNA.

Figur 2
Figur 2. Instruktion om hur du skapar en DNA fiskespö. Håll spetsen av ett glas pasteurpipett i lågan från en bunsenbrännare. Detta gör att glaset ska börja smälta efter några sekunder, vilket skapar en liten krok vid than slutar. Snabbt bort från lågan och låt svalna i 1 minut.

  1. Plasmid Isolation
    1. Bereda plasmider med användning av standardminiförberedelsepaket och lös upp i elueringsbuffert (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Beroende på plasmidstorlek, använd 100-500 ng plasmid för en sekvenseringsstege.
  2. Sånger Sequencing reaktion
    OBS: Hitta nedanför ett enkelt protokoll som använder en fluorescerande primer sekvense kit med 7-deaza-dGTP som fungerar bra för att primer förlängningar. Se sekvense kit manualen för mer information. Observera att sekvenseringsreaktionen måste använda samma primer som primer-förlängningsreaktion för att skapa produkter med samma längd.
    1. Blanda 12 pl iskt DNA (~ 10 - 15 mikrogram) och 1 pl DMSO och 1 l fluorescerande primer (2 pmol / l).
    2. Till vardera 1 pl av de fyra sekvenseringsreaktionsblandningar (A, C, G eller T), tillsätt 3 | il av DNA / DMSO / Primer mix. Placera proverna i en PCR-maskin, och kör följande PCR-program: 95 ° C under 2 min; 35 cykler av 95 ° C under 20 sek, 54 ° C under 20 sek, 70 ° C under 30 sek; hålla vid 4 ° C för evigt.
    3. Efter körningen, avlägsna proverna ur maskinen, tillsätt 6 | il laddningsfärg och lagra på is (kortvarigt) eller vid -20 ° C under flera dagar till veckor.

4. Gel Setup och Apparater Run

OBS: Information om hur sekvenseringsgelen apparaten monteras gelén bereds och hur gelen körs finns i tillverkarens protokoll.

  1. Beredningar
    1. Förbered 10x TBE som anges i tabell 4.
    2. På dagen för gelén run förbereda ett L i 1x TBE-buffert med ultrarent DDH 2 O.
    3. Bered 10% (vikt / volym) APS. Obs: Kan förvaras i 200 l alikvoter vid -20 ° C i flera månader, men aktivitet kan minska med tiden <./ Li>
  2. Montering av gelgjutning kammare
    1. Undvik damm och smuts mellan glasskivorna. Därför grundligt rena arbetskläder ytor med våtservetter.
    2. Rengöra ett par 25 cm glasplattor med användning av engångspappershanddukar och destillerat vatten på båda sidor och därefter isopropanol för den inre sidan av glasplattorna.
    3. Placera 0,25 mm distansorgan på den bakre glasplattan och sänka den skårade glasplattan på toppen (fig 3).
    4. Fäst gel skenor på båda sidor av glasskivorna med den skårade änden och järnvägsinträdes piloter uppåt och dra åt rattarna lätt.

Figur 3
Figur 3. Sprängskiss av gelelektrofores glasplåtar. Glasplattor bör användas riktnings. Var försiktig för att möta den inre sidan av glasplattorna inåt och den yttresidan utåt.

Figur 4
Figur 4. Vy av en monterad gel-apparat. Efter injicering gellösningen är fickan spacer placeras i lösningen mellan glasplattor. Gjutnings Plattan tas sedan glida mellan den främre glasplatta och gelen skenor och säkras genom att fästa sken rattarna.

  1. Gjutning gelen
    OBS: ej polymeriserade akrylamid är neurotoxiskt! Läs säkerhetsdatablad och använda med lämpligt skydd !!!
    1. Lägg till de föreningar som anges i tabell 5 i en bägare och blandas med användning av en omrörarstav och en magnetomrörare.
    2. Omedelbart efter att ha lagt APS och TEMED, ta upp gelen lösning i en 50 ml spruta och placera en 0,45 nm filter på spetsen.
    3. Antingen hålla den övre kanten av glasplattan med en hand eller placera sandwich på en gel gjutning står för att skapa en lutning vinklad 10 - 20 °.
    4. Sakta dispensera gellösningen mellan glasskivorna medan kontinuerligt rörliga sprutspetsen från en sida till den andra och slutar så snart gelen lösning möter den nedre änden.
    5. Flytta åt sidan eller ta bort helt och hållet alla bildade bubblor med en bubbla krok.
    6. Skjut gel ficka spacer (0,25 mm) mellan glasskivorna på den skårade ände, dränka i gellösningen och fixera det genom att fästa gjutningsplatta.
    7. Fäst övre skenskruvar lätt (Se Figur 4 för fullt monterade apparater).
    8. Låt gelen set för 1 - 2 tim.
    9. Avlägsna gjutning plattan och fick spacer och rengör fickan från salt och gel rester.
    10. Skölj med DDH 2 O och torka upp överflödig lösning med mjukpapper.
  2. Löpning och visualisera gelen
    OBS: sekvenseringsgeler direkt för elektrofores i gelén kameran, medanfluorescensen detekteras samtidigt genom en lasermikroskop. I motsats till konventionell gelelektrofores, där gelén körs först och sedan färgades och synliggjordes, är detekteringsenheten fast och avsöker banden i realtid allt eftersom de passerar lasern. Nedanför ett förfarande för ImagIR Datainsamling programvara på OS / 2 beskrivs, som kan antas till senare versioner. För mer information, se instruktionsboken.
    1. Skjut bufferttank hållaren i gelen skenor på de främre glasplattor och dra åt rattarna.
    2. Placera gelen i nedre geltank av den automatiserade gel kameran mot värmeplattan och fixera genom att skjuta järnväg posten piloten i apparatfästen.
    3. Fyll 1x TBE-buffert i de nedre och övre gel buffertkammare, stänger den nedre buffertkammaren och anslut den övre buffertkammaren till makten med hjälp av nätsladden.
    4. Om det finns, rengör gelen fickan från saltrester genom att upprepade gånger pipettera buffert i fickan.
    5. Stäng den övre bufferttank kammare med toppbuffert locket.
    6. Stäng luckan och slå på värmekameran och datorn och starta Base ImagIR Datainsamling programvara.
    7. Skapa ett nytt projekt fil (Arkiv-> Ny ...), ange en projekt filnamn, välj lämpliga laserområden (700 eller 800 nm) och bekräfta med OK.
    8. Välj Options-> Auto vinst ... från bildmenyn längst upp klickar du på Auto för att starta den automatiska förstärkningsmätning och accepterar inställningarna genom att klicka på OK.
    9. Fokusera lasern genom att välja Inställningar-> Fokus ... från skannerkontrollmenyn, klicka på Auto-knappen och acceptera inställningarna genom att klicka på OK.
    10. Upprepa automatisk förstärkningsförfarandet för att anpassa sig till den nya fokuserade området.
    11. Setup skannerkontroll enligt dessa inställningar: 2.000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, Scan filter: 3, Skanningshastighet: 3.
    12. Prerun den tomma gel för 20 min (välj spännings PÅ och tryck på <ENTER> ).
    13. Under tiden, värm sekvenseringsstege och de primerförlängningsprodukter i en PCR-maskin för 2 min till 90 ° C, därefter kyla på is.
    14. Stoppa elektrofores, öppna automatiserade gelen sequencer och ta bort locket övre bufferttank.
    15. Sätt i haj tand-kam i mellan glasskivorna och något borra gelén med haj tänder (se fig 5).

Figur 5
Figur 5. Närbild bild av gel med haj tand kam. Prov (lila) tillämpas mellan hajtänder.

  1. Pipett antingen 1-2 ul av primerförlängningsprodukter eller sekvenseringsstege reaktioner till varje gel ficka (som bildas av haj tänder).
  2. Om inte alla fickor behövs, fylla tomma fickor med laddningsfärg för att förhindra inkonsekvent kör beteende.
  3. Stäng bufferttanken och dörr av gelén sequencer.
  4. Starta elektrofores och slå på lasern (Välj Voltage ON och lasern och tryck <ENTER>).
  5. Stoppa elektrofores när regionen av intresse har passerat lasern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Såsom avbildas i Figur 6, kan en primer-förlängningsreaktion användas för att bestämma de transkriptionella platser av transkript av intresse utgångs och kan hjälpa till att härleda promotorregioner (typiskt identifieras med -10 och -35 element). Den översta (längst) cDNA-fragmentet representerar den 5 'änden av mRNA och sålunda lätt kan mappas i jämförelse med sekvenseringsstege.

Figur 6
Figur 6. Representativa resultat av en reaktion med primerutsträckning. På vänster sida en fullständig in vivo primerutsträckning gel från E. coli med olika plasmider visas. Enskilda områden av intresse är förstorad. I den övre delen (A), är fastställandet av ompA transkriptionsstartpunkt avbildas. Den omvända transkriptionen slutar vid 5'-änden av mRNA och således skapar ett band av fullängds RNA (indicated med en pil). Genom att anpassa det cDNA-bandet med sekvenseringsstege, kan 5'-änden av mRNA-sekvensen bestämmas såsom visas i den bifogade sekvens. I den nedre delen (B), är klyvning av ompA avskriften av YoeB-seq2 RNas visas. Banorna 1-3 representerar prover där toxinet YoeB-seq2 saknas eller inaktiva, medan banorna 4-5 representerar prover med en aktiv RNas, sammanfaller med frånvaro och närvaro av cDNA-produkter. Två huvudsakliga klyvningsprodukter skapas såsom visas av pilarna. DdNTP som används i varje spår och motsvarande RNA-basen av sekvenseringsstege är märkt. Avskrift delar är markerade med blått teckensnitt, promotorelement och augusti start kodon av magenta teckensnitt. För mer information; se den ursprungliga forskningsartikel från Nolle et al., Microbiology 159, 1575-1585 (2013). Klicka här för attse en större version av denna siffra.

I exemplet som visas i figur 6 exempel var TSP av ompA mRNA bestämdes till att vara en G-bas (markerad med en pil i sekvensen nedan gelén). Detta är i linje med ompA TSP publiceras före 15. De -35 och -10 delar av promotorn kan härledas vara TTGTAA och TAGACT 16 som motiven skiljer bara två baser vardera från sina respektive konsensussekvenser (TTGACA och TATAAT respektive).

I motsats till andra metoder, såsom 5 'RACE, kan primer-förlängningsreaktioner användas för att exakt bestämma och kvantifiera klyvningen av RNA-molekyler. Klyvning av RNA-molekyler skapar fria 5 'ändar, vilka kan detekteras samtidigt som cDNA-banden i gelén. Identifiera flera klyvningsprodukter av ett mRNA är svårare i 5'RACE experiment, eftersom flera PCR-produkter måste sekvenseras för att erhålla klyvningsproduktersom endast utgör en liten bråkdel av den totala (obearbetad) -RNA bulk.

I den nedre delen av figur 6, är RNA-kartering av klyvning med en RNas avbildad. Såsom tidigare beskrivits 5, RNas YoeB-seq2, en del av en TA-system från S. equorum 17, klyver mRNA nära startkodonet. Denna klyvning kan hämmas av det besläktade antitoxin YefM-seq2. När RNas YoeB inte är närvarande eller inaktiva (banorna 1-3) är inga primerextensionsprodukter bildas nära startkodonet. Närhelst RNasaktivitet är närvarande (spår 4 och 5), två starka band strax nedströms om startkodonet visas. Genom att använda denna metod, kan klyvningsmönster lätt identifieras.

Figur 7 visar en misslyckad primerförlängning experimentet. På grund av överskott RNA i den omvända transkriptionsreaktionen, den genererade mängden av cDNA som skapar en så stark signal, att enskilda cDNA-bands kan inte särskiljas. Detta gör 5 'RNA-änden bestämning omöjlig.

Vid användning höguttryckta RNA i primerförlängningsreaktionen, till exempel en ribosom RNA (som visas i Figur 7), risken för överexponerade områden ökar. Därför måste mängden totalt mall-RNA justeras till överflödet av RNA av intresse. I motsats härtill, när transkript av intresse endast utgör en liten del av det totala RNA: t, det belopp i den omvända transkriptionsreaktionen måste ökas, annars signalerna kommer att vara alltför svag (ej visad). Detta gäller även för Sangers sekvenseringsreaktionen, som multikopie mallar per cell (t.ex. rRNA gener eller gener som kodas på plasmider) resulterar i mycket starkare signaler.

Figur 7
Figur 7. Representant resultat av en misslyckad primerförlängning från ng> S. aureus. 16S RNA är mycket rikligt förekommande i bakterieceller. Detta leder till starka omvända transkriptionssignaler när måttliga mängder av totalt RNA användes. I det fall som visas här, de starka cDNA-band maskera den exakta 5'-änden och således förhindra 5 'kartläggning. Dessutom ribosomala RNA är mycket strukturerat och därför kan säga omvänd transkription förtid, producera korta cDNA produkter som inte representerar fullängdsfragment. I detta fall ökar omvänd transkription temperatur, tillsammans med ett värmeresistent omvänt transkriptas kan göra det lättare att syntetisera senaste sekundära strukturer. På grund av att flera kopior av sekvensen i det genomiska DNA: t, är Sangers sekvenseringsstege starkare än för enkelkopiegener. För att förbättra gelen bilden, RNA och DNA belopp för omvänd transkription och Sanger reaktion bör minskas och / eller mindre produkt appliceras gelen._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: DNas I-digerering av RNA.

Substans Mängd
RNA från steg över 70-100 mikrogram
10x DNas I-buffert (100 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) 50 | il
DNas, RNas-fritt (2 U / ^ il) 10,0 ^ il (upp till 10 pg av RNA per 1 | j, l av DNase I)
Ta volym upp till 500 l med DDH 2 O (DEPC behandlade)

Reaktionsvolymen och mängden av DNas I kan skalas upp eller ner beroende på mängden of-RNA användas.

Tabell 2: RNA-Primer hybridisering.

Förening Belopp för en reaktion
RNA 5-15 ^ g
Fluorescensmärkt primer 2 pmol
Ta volym till 6 l med DDH 2 O (DEPC behandlade)

Inrätta en reaktion per RNA-prov och primer.

Tabell 3: Primerförlängning huvudblandning.

Förening Belopp för en reaktion
DDH 2 O (DEPC behandlade) 1,3 ^ il
AMV RT Buffer (10x) 1,0il
dNTP (10 mM, RNas gratis) 1,0 ^ il
RNas-inhibitor 0,2 ^ il
AMV omvänt transkriptas (RT) (20-25 U / ^ il) 0,5 ^ il

Skala upp till det antal reaktioner som krävs.

Tabell 4: 10x TBE recept.

Substans Mängd
Tris-bas 107,8 g
BORSYRA 55,0 g
EDTA 7,4 g
Ta volymen upp till 1000 ml med ultrarent DDH 2 O och filter för att ta bort damm och ludd

Filter för att ta bort damm och ludd och förvara vid 4 °C.

Tabell 5: Sekvense gel recept.

Förening Mängd
Urea 10,5 g
DDH 2 O (MilliQ) 13,0 ml
10x TBE 2,5 ml
XL Rapid gellösning 5,0 ml
TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamin) 25 | il
APS (ammoniumpersulfat 10%) 175 | il

Process gellösning snabbt efter tillsats av TEMED och APS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescerande primerförlängning är en enkel och snabb metod för bestämning av 5-ändarna av RNA: n, antingen för TSP- eller sekundär RNA-bearbetning identifiering. På grund av användningen av fluorescerande primers, kan reaktionerna sättas upp och köra utan extra säkerhetsåtgärder (till skillnad från i fallet med radioaktivt märkta primers). Eftersom samplen detekteras genom fluorescens, kan de avbildas medan elektroforesen pågår vilket möjliggör snabb analys i jämförelse med radioaktiva metoder där röntgenfilmer är vanligen använda.

I allmänhet, är kvaliteten på den primerförlängningsreaktion starkt beroende på grad och bindande kapaciteten hos primern. Om bindningsstället väljs för nära det intressanta området, kan primer-utstryk maskera signalen, medan ett bindningsställe för långt bort (> 300 bp) från 5'-änden kan resultera i en dålig signal.

Det fluorescerande färgämnet måste vara kovalent bunden till5 'änden av den anpassade DNA-oligonukleotid under syntes och oligonukleotiden bör renas genom HPLC för att förhindra interferens med den omvända transkriptionsreaktionen av restsalter. De oligonukleotider med lämplig färg modifiering (se reagenser lista tabell för mer information om kompatibla färgämnen) kan beställas från de flesta oligonukleotidsyntes företag och bör förvaras i mörker. Tyvärr är vi inte till några enzymatiska tekniker för att fästa färgen på tidigare befintliga oligonukleotider, som är möjligt med radioaktivt märkta nukleotider.

I sekvenseringssystemet som beskrivs här, kan två olika fluorescerande färgämnen användas för att samtidigt detektera två prover, eftersom deras magnetisering (cirka 700 och 800 nm) och emissionsspektra är distinkta. Bortsett från den ursprungliga tillverkaren färgämnen, kan andra färgämnen såsom anges i den förteckning reagens användas för att producera utmärkta resultat.

En annan viktig faktor för prIMER förlängningsreaktioner är den RNA-kvalitet och mängd. Försiktighet bör vidtas för att avlägsna DNA-föroreningar, som omvänt transkriptas såsom AMV RT kan använda DNA som mall 18.

Såsom visas i figur 7, är den detekterade signalstyrkan hos banden i gelén körningen beroende RNA-mängden som används i den omvända transkriptionsreaktionen. Det är därför nödvändigt att justera mängden av totalt RNA, beroende på den proportionella mängden av RNA av intresse är närvarande i provet. Den låga känsligheten hos denna metod är också en av dess nackdelar, såsom låg uttryckta RNA-sekvenser kan vara svår att upptäcka. Om inga signaler kan detekteras alls, kan man öka mängden totalt RNA eller RNA av intresse kan vara artificiellt överuttryckt från en plasmid.

Gel detektionskänsligheten för fluorescens primer förlängningen handlar om faktor tio mindre än 32p eller 33p radioisotop primer förlängning 19. Emellertid kan denna nackdel kompenseras genom justering av mängden av cDNA laddades på gelén eller genom att öka mängden av RNA-mallen som används i den omvända transkriptionsreaktionen. I de flesta fall, är känsligheten hög nog för tillfredsställande resultat 4,5. Känslig liknar radioaktiva primer förlängningar har rapporterats vid användning av fluorescerande primers i kombination med en kapillär sequencer 3, med fördelen av korta exponeringstider.

Kostnader jämförelser mellan fluorescens och radioaktivitet baserade primer förlängningar är svårt, eftersom de är beroende av flera faktorer såsom tillgängliga maskiner, primers, stegreaktioner, tillgänglighet och underhåll av ett laboratorium för arbete med radioaktiva ämnen, omhändertagande av radioaktivt avfall, utbildning och individuella hälsorisker . Fluorescerande primers är cirka fem till tio gånger dyrare än icke-märkta standard primers (20 bp). Men dessa primrar kan användas för att åtminstoneett år (mer sannolikt flera år) jämfört med 32 P-märkta primers, som har en mycket kortare halveringstid. Ommärkning av primrar är tidskrävande och kostsamt, på grund av behovet av nya radioaktiva ämnen i täta intervall. Om samma uppsättning primrar används under en lång tidsperiod, fluorescenta primrar är billigare än vanliga, radioaktivt märkta primrar. Den huvudsakliga kostnaden punkten kommer dock att vara den fluorescerande sequencer eller kameran och köpa denna apparat enbart i syfte att primer förlängningar kan inte vara kostnadseffektivt. Den metod som beskrivs här är ganska intressant för grupper som är i besittning av eller har tillgång till en sådan maskin.

Om en automatiserad gel sequencer inte är tillgänglig, kan andra metoder för fluorescensdetektion också användas. I detta fall kan gelen köras i en vanlig elektroforesapparat, torkas vid behov och överförs till en fluorescerande imager sedan (modeller finns som liknar en flatbed scanners). Trots fördelen av att visualisera gelén under körningen är förlorad, kan användningen av radioaktiva isotoper kan undvikas på detta sätt, en viktig fördel för den som utför experimentet. Dessutom, om möjligt, en kapillär sequencer kan användas för separation och realtidsdetektering, vilket kan bidra till att öka känsligheten.

Olika metoder har publicerats om hur du använder fluorescerande primer förlängning med automatiserad gel sekvense maskiner eller kapillär sequencers, men dessa metoder kräver ofta en cDNA fällningssteg för att koncentrera provet (och ta bort orenheter) 19. I metoden som presenteras här, är DNA-utfällning inte nödvändigt på så sätt minska den tid beredningen. Viktigare är emellertid att utelämna detta steg gör det möjligt att semikvantitativt bestämma mängden av RNA-molekyler i provet som inkonsekvenser i fällningsförfarandet kan elimineras.

Det bör noteras, att även om5'-ändarna av RNA-molekyler kan kartläggas i primerextensionsprodukter reaktioner, bearbetas och primär ändar (transkriptionsstartpunkter) kan inte vara lätt att skilja. För att kringgå dessa begränsningar, är avgörande minutiös planering av experiment med lämpliga kontroller. Uppenbara promotorsekvenser kan indikera närvaron av en transkriptionsstartpunkt och mutera eller radera promotorelement bör sedan avskaffa cDNA-banden. Å andra sidan, om sådana sekvenser saknas eller är specifika konsensussekvenser är närvarande, de band som kan orsakas av behandling av det RNA. Om behandlingen enzymet är känd och kan renas, kan primer in vitro extensions ge upplysningar i transkription och bearbetning kan separeras. Dessutom kan andra metoder såsom 5 'RACE (inklusive enzymatisk anrikning av obearbetade RNA-molekyler) kompletterar primer extensions att skilja transkriptionsstartställena från RNA-bearbetning.

The primerförlängning metoden jämförs ofta med andra metoder såsom 5'RACE och S1 nukleas skyddsanalyser och därmed dess användbarhet Ibland ifrågasätts. RNAseq teknik i kombination med nästa generations sekvensering till exempel kan hjälpa till att avgöra tsk och bearbetningsanläggningar för många av RNA parallellt, men den ekonomiska bördan och bioinformatiska arbete som krävs gör det ganska oekonomiskt för enstaka RNA av intresse. 5'-RACE å andra sidan är billigare och resultaten är lättare att analysera, men om RNA behandlas på flera sätt eller flera transkriptionsstartpunkter är närvarande, måste produkten klonas och en stor mängd kandidater måste sekvenseras för att få en rättvisande bild av RNA av intresse.

Därför, trots nya metoder har uppstått under åren, även i dag primer förlängningar har sina existensberättigande på grund av användarvänlighet, låg kostnad och kort handläggningstid, vilket gäller särskiltför fluorescensbaserad metod som presenteras här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) NEB / Roche NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free) Ambion (life technologies) AM2222
FastPrep-24 Instrument  MPBio 116004500
Fluorescently labeled primers Biomers n/a 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software Li-Cor Product discontinued
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
Nuclease free water Ambion (life technologies) AM9915G
Plasmid mini preparation kit QIAGEN 12125
RapidGel-XL-40% Concentrate USB US75863
RNA STORAGE BUFFER Ambion (life technologies) AM7000
Roti-Aqua-P/C/I Carl Roth X985.3 Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor Ambion (life technologies) AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP GE Healthcare RPN2538
TRIzol reagent life technologies 15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm BioSpec 11079101z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
  2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
  3. Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
  4. Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
  5. Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
  6. Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
  7. Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
  8. Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
  9. Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
  10. Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
  11. Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
  12. Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
  13. Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
  14. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
  15. Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
  16. Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
  17. Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
  18. Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
  19. Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics