1,337 Views
•
07:25 min
•
December 09, 2022
DOI:
Detta protokoll beskriver två lipidtillskottsstrategier med en kombination av longitudinell och transkriptionell analys i modellorganismen, C.elegans. Tekniken beskriver hur man undersöker transkriptionella förändringar med hjälp av få maskar eller dissekerade maskvävnader och hur vätskematningen för en insektspopulation kan kombineras med hydrotekniker. Individer som utför denna teknik måste öva vävnadsdissektion på grund av det korta tidsfönstret för att utföra experimentet för att uppnå adekvat transkriptionsanalys.
Börja med att samla OP50-bakterier genom att centrifugera den övernattade odlade kulturen vid 4 000 G i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten. Suspendera bakteriepelleten i 20 ml bakteriell utspädning, kostbegränsning eller BDR-bas genom virvel och upprepa centrifugeringen igen i 10 minuter.
Efter att ha kastat supernatanten, suspendera bakteriepelleten igen i BDR-mediet för att förbereda en 20 X BDR bakteriestam. Späd bakteriebuljongen till 5X med ett BDR-medium före användning. Använd etanol eller dimetylsulfoxid som lösningsmedel, bered en lipidstamlösning i en ny autoklaverad glasflaska och fyll glasflaskan med argon eller kväve för att förhindra oxidation.
Överför lipidstamlösningen till BDR-bakterielösningen för att uppnå önskad slutlig koncentration under utfodringsförhållanden. Blanda det noggrant genom att virvla i 20 sekunder. Bered det kontrollerade fordonet genom att blanda samma volymer filtrerad etanol eller dimetylsulfoxid med BDR-bakterier.
Utför lipidtillskott och vätskeodling genom att överföra önskad mängd lipid eller vehikelkontroll till varje brunn i en 12-brunnsplatta med tre till fyra replikat för varje matningstillstånd. Blanda den synkroniserade Caenorrhabditis elegans-masksuspensionen med 5X BDR-bakterier i ett-till-ett-förhållande för att uppnå en slutlig koncentration av 1 500 maskar per milliliter och 2,5X för bakterier. Överför sedan två milliliter av maskbakterieblandningen till varje brunn på 12-brunnsplattan.
När du är klar linda in 12-brunnsplattan med folie och skaka plattan i en 20 grader Celsius-inkubator vid 100 RPMM för önskad inkubationslängd. För lipidtillskott på plattor, frö en milliliter av de lipidkonditionerade bakterierna på mitten av ett 10 centimeter nematodtillväxtmedium eller NGM-agarplatta. Se till att den slutliga arbetslösningen virvlas flera gånger mellan sådd av de två plattorna när du arbetar med ett stort antal plattor.
Torka plattan i mörkret inuti en biosäkerhetshuv. Överför 3000 maskar från den synkroniserade maskkulturen till 10 centimeterplattan. Torka plattan i en biosäkerhetshuv tills maskar som simmade på lipidkompletterade plattor, börjar krypa.
När den har torkats, inkubera den lipidkonditionerade plattan i en 20 grader Celsius inkubator under önskad tid och om du använder fleromättade lipider skyddar plattan från ljus. Förbered 20 mikroliter slutlig lyslösning för varje prov genom att blanda 0,2 mikroliter DNase I med 19,8 mikroliter lyslösning i ett PCR-rör och blanda det väl genom att pipettera upp och ner fem gånger. För att extrahera RNA från det lilla antalet hela maskar, ta bort bakterierna genom att överföra 15 till 20 maskar från bakteriegräsmattan till en nysådd NGM-platta.
Överför 15 till 20 maskar från den osådda NGM-plattan till PCR-röret som innehåller 20 mikroliter av den nyberedda slutliga lyslösningen med det minsta antalet bakterier och inkubera lysreaktionen i fem minuter vid rumstemperatur. När inkubationen är över, håll provet i ett fint kallt vattenbad och sond sonika maskarna fyra gånger, fem sekunder varje gång med 30% amplitud och puls i 15 sekunder mellan varje tid av ultraljudsbehandling. Inkubera röret vid rumstemperatur i fem minuter innan du tillsätter två mikroliter stopplösning i lysreaktionen och blanda det genom försiktig tappning.
Inkubera reaktionen i två minuter vid rumstemperatur och ställ sedan röret på is. För att extrahera RNA från maskvävnaden, plocka cirka 20 maskar från bakteriegräsmattan och placera dem i en ny osådd NGM-platta för att ta bort bakterierna från maskarna. Överför 20 maskar med så få bakterier som möjligt till ett klockglas som innehåller 500 mikroliter M9-lösning innehållande fyra mikromolära levamisol.
När maskarna är immobiliserade, dissekera bakterien eller tarmen med en 25 gauge nål som kan fästas på en milliliter spruta. Använd en autoklaverad glaspipett för att överföra de dissekerade vävnaderna till PCR-röret och sätt röret på is i två minuter så att materialet kan avsättas i botten. Ta bort supernatanten från PCR-röret innan du tillsätter 20 mikroliter slutlig lyslösning och blanda den väl genom att knacka.
Efter inkubation av lysreaktionen i fem minuter, tillsätt två mikroliter stopplösning och knacka på röret flera gånger. Inkubera röret i två minuter innan du fortsätter till omvänd transkription. I valideringsstudien visade RNA extraherat från en stor population och några maskar liknande induktion av neuropeptidbearbetningsgenerna, egl-3 och egl-21.
Det tyder på att RNA-extraktionen från några maskar kan vara ett giltigt alternativ till standard CDNA-syntestekniker från stora populationer. I den dissekerade tarmen hos lipl-4-transgenmaskarna, kompletterad med dihomo-gamma-linolensyra, eller DGLA, inducerades inte de neuronala neuropeptidbearbetningsgenerna. DGLA tillskott vid olika koncentrationer räddade livslängd förlängning i maskarna vid fett-3 knockdown.
Maskar med lipidtillskott kan också bearbetas för RNA-sekvensering, proteomik, metabolomik och beteendestudier för att identifiera ytterligare fenotyper under dessa specifika förhållanden. Denna metod kan tillämpas på åldrande forskning, lipidbiologi och alla andra forskningsområden som syftar till att upprätta ett samband mellan en viss fenotyp och en näringsfaktor eller metabolit.
Detta protokoll beskriver lipidtillskottsmetoder i flytande och på plattkulturer för Caenorhabditis elegans, i kombination med longitudinella studier och gentranskriptionsanalys från bulk eller några maskar och maskvävnader.
Read Article
Cite this Article
Savini, M., Lee, Y., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).
Copy