Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schuster, C. F., Bertram, R. Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo. J. Vis. Exp. (92), e52134, doi:10.3791/52134 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescentie gebaseerde primer extensie (FPE) is een moleculaire methode om transcriptionele startpunten of verwerking websites van RNA-moleculen te bepalen. Dit wordt bereikt door reverse transcriptie van het RNA van belang met specifieke fluorescent gelabelde primers en daaropvolgende analyse van de resulterende cDNA-fragmenten door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. Tegelijkertijd wordt een traditionele Sanger sequencing reactie uitgevoerd op de gel aan de uiteinden van de cDNA-fragmenten wijzen aan hun exacte overeenkomstige basen. In tegenstelling tot de 5'-RACE (Rapid Amplification van cDNA Ends), waarbij het product moet worden gekloneerd en meerdere kandidaat sequentie, kan het grootste deel van de cDNA-fragmenten gegenereerd door primerverlenging gelijktijdig worden gedetecteerd in een gel run. Bovendien kan de gehele procedure (van reverse transcriptie tot de uiteindelijke analyse van de resultaten) in een werkdag worden ingevuld. Door fluorescerend gemerkte primers, het gebruik van gevaarlijke radioactieve isotoop gemerkte reagentiakan worden vermeden en doorlooptijden worden gereduceerd producten tijdens de elektroforese procedure kan worden gedetecteerd.

In het volgende protocol beschrijven we een in vivo fluorescentie primerverlenging methode uiteinden van de RNA 5 'betrouwbaar en snel detecteren afleiden transcriptionele startpunten en RNA verwerking gebeurt (bijvoorbeeld door toxine-antitoxine systeemcomponenten) in S. aureus, E. coli en andere bacteriën.

Introduction

Primerverlenging 1 is een moleculaire methode uiteinden van specifieke RNA-moleculen van de 5 'bepalen tot een basisresolutie. Het voordeel van andere methoden, zoals 5'-RACE (snelle amplificatie van cDNA uiteinden) is de snelle doorlooptijd en de mogelijkheid om een ​​mengsel van verschillende lengtes van RNA-moleculen gemakkelijk analyseren.

Deze methode werkt door het onderwerpen RNA moleculen transcriptiereacties keren met specifieke fluorescente primers genereren cDNA fragmenten van bepaalde lengte. Deze cDNA-moleculen worden uitgevoerd naast de traditionele Sanger sequencing reacties 2 op denaturerende polyacrylamide gelen en kan worden gedetecteerd door de fluorescentie door het gebruik van fluorescent gemerkte primers. De lengte van de cDNA-fragmenten worden vervolgens beoordeeld in vergelijking met de sequentie ladder, waardoor het in kaart brengen van het 5'-RNA uiteinden.

Traditioneel worden primerverlengingsreacties in combinatiemet radioactieve isotopen cDNA moleculen op röntgenfilms detecteren. Door gezondheid, kwesties afvalverwerking en gebruiksgemak, nieuwere protocollen gebruiken fluorescentie voor de detectie van de primerverlenging met automatische sequencers, hoewel de gevoeligheid iets lager. Met fluorescent gelabelde primers, kan de terugkerende radioactieve labeling procedure worden weggelaten, als fluorescerende primers zijn stabiel gedurende lange tijd (meer dan een jaar in onze handen).

De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van een geautomatiseerde sequencer gel, maar met lichte wijzigingen kunnen capillaire sequencer ook worden gebruikt voor de cDNA scheiding en detectie 3. Het parallellisme gel analyse maakt het mogelijk om zelfs een kleine hoeveelheid RNA splitsing of verwerking detecteren. Een ander voordeel is de hoge resolutie van deze werkwijze, als eindstandige splitsing en verwerking van zelfs één base kan worden gedetecteerd.

Met betrekking tot de detectie van RNA splitsing of verwerkingen typically twee verschillende primer extensions onderscheiden. In één geval wordt de enzymatische behandeling uitgevoerd in vitro met gezuiverde RNA en gezuiverd enzym, terwijl in het andere geval wordt de verwerkingen in vivo en de resulterende RNA wordt gezuiverd. In beide gevallen het RNA onderworpen aan een primer extensie in vitro uitgevoerd, echter afhankelijk van de bron van RNA, wordt de werkwijze ofwel genoemd in vitro of in vivo primer extensie. In het protocol hier geïntroduceerde richten we alleen op in vivo primerverlenging, vanwege het gebruiksgemak (niet gezuiverde eiwitten nodig) en de mogelijkheid om transcriptionele startpunten en verwerking uit te tegelijkertijd. In vitro primerverlengingen in principe ingesteld op dezelfde manier en dit protocol kan dienen als uitgangspunt.

De werkwijze hier afgebeelde kan worden toegepast op vele bacteriesoorten zolang ze vatbaar hoogzuiverheid en hoge opbrengst bereiden van nucleïnezuren.

Het onderzoek in ons lab richt zich op het regelgevend kader van toxine-antitoxine (TA) systemen van 4,5, een terrein waarop de primer extension method grote schaal wordt gebruikt. TA-systemen zijn kleine genetische elementen in prokaryotische genomen dat bestaat uit een stabiele en endogeen actief toxische eiwit en een meestal onstabiel eiwit of RNA antitoxine die toxiciteit 6,7 tegengaat. Toxine activiteit wordt soms uitgeoefend door remming van de replicatie, celwand synthese of andere mechanismen, maar meestal door RNase activiteit 8,9. Typisch wordt RNase specificiteit bepaald door het uitvoeren van verschillende tests, waaronder de primer extensie methode. Primerverlengingsreacties zijn geschikt voor deze toepassing, als een mengsel van volledige lengte gesplitst en fragmenten tegelijkertijd worden geanalyseerd om te bepalen hun 5 'einden. Een mix van in vitro en in vivo primer extensions, despecifieke toxine RNase splitsing, bijvoorbeeld sequentie specificiteit te bepalen 10-13.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van primerverlenging procedure. Bacteriële kweken worden geïncubeerd en behandeld volgens de experimentele behoeften. Totaal RNA wordt geëxtraheerd uit de cellen, behandeld met DNase I bij DNA sporen te verwijderen en onderworpen aan een reverse transcriptie reactie met doelspecifieke fluorescente DNA primers hetgeen cDNA. Genomisch DNA of plasmiden worden geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor fluorescerende Sanger sequentiebepaling reacties voor maat vergeleken met de cDNA-fragmenten. Primerverlengingsproducten worden omzomen Sanger sequentiebepaling producten op een denaturerende ureum polyacrylamidegel en geanalyseerd met een geautomatiseerde laser en microscoop. De sequencing basis die lijn staat met de cDNA band is de last basis van de 5 'cDNA (blauwe pijl). Meer informatie in Fekete, et al. 3 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Een overzicht van de gehele primerverlenging procedure is te vinden in figuur 1. In het kort, bacteriële cellen worden gekweekt, geoogst, de cel pellet gelyseerd en het RNA geëxtraheerd. Gezuiverd RNA wordt vervolgens behandeld met DNase I om sporen van DNA moleculen die kunnen fungeren als sjablonen voor de reverse transcriptase verwijderen. Specifieke fluorescerende primers worden toegevoegd aan het RNA gehybridiseerd aan het gebied van belang en vervolgens reverse getranscribeerd, waardoor enkelstrengs complementair DNA (cDNA). Een sequentie ladder wordt gemaakt door traditionele Sanger sequentiebepaling gebruik fluorescente primers en gescheiden op een denaturerende polyacrylamide gel naast het primerverlengingsproduct cDNA fragmenten. Het resulterendegel geanalyseerd door vergelijking van de fluorescerende banden, waardoor de identificatie van uiteinden van belang de 5 '. Transcriptionele uitgangspunten en verwerking sites worden vervolgens individueel door sequentievergelijkingen beoordeeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. High Yield RNA Voorbereiding

  1. RNA Isolation
    OPMERKING: Hoge concentraties van totaal RNA zijn nodig voor de primerverlengingsreactie. Spinkolom kits meestal niet de hoeveelheid RNA benodigde verkregen (~ 5-16 ug in 5 pl volume). Daarom zuivering met zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie methode wordt aanbevolen, hieronder beschreven.
    OPMERKING: Fenol is kankerverwekkend, giftig en corrosief. Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken onder een zuurkast met adequate bescherming!
    1. Groeien of behandelen bacteriële cellen (S. aureus en E. coli in dit voorbeeld) naar wens en oogsten door 10 min centrifugeren bij 4600 x g en 4 ° C. Opmerking: Typisch oogsten we totaal OD600 van 20 - 70. De celpellets worden opgeslagen gedurende verscheidene weken bij -20 ° C.
    2. Resuspendeer de celpellet in 1 ml zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform-oplossing en naar een2 ml schroef kop met 0,5 ml van 0,1 mm zirkonium glas / silica beads.
    3. Lyse de cellen drie keer in een snelle prep / bead beater op 6,5 m / sec gedurende 30 seconden voor drie rondes, de koeling van de monsters op ijs gedurende 5 minuten na elke run. Opmerking: gehomogeniseerde monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken.
    4. Incubeer lysaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en voeg 200 pl chloroform.
    5. Krachtig schudden of vortex het monster gedurende 30 seconden om RNA te extraheren.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min centrifugeer 15 minuten bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C. Opmerking: Oplosmiddelen worden gescheiden in een onderste organische fase (roze, bevat eiwitten), een interfase (wit bevat DNA) en een bovenste waterige fase (heldere, bevat RNA).
      LET OP: Vanaf deze stap op het gebruik alleen RNase vrije reagentia en plastic ware!
    7. Bereid verse RNase-vrij 1,5 ml reageerbuisjes, label op de juiste wijze en voeg ongeveer 500 pi van 100% RNase vrij isopropanol elke (gebruik ongeveer dezelfde volume als de waterige fase in de vorige buis).
    8. Houd de buis onder een hoek om en breng de waterige fase (ongeveer 500 ul) om de vervaardigde buizen met behulp van RNase gratis tips. Laat de interfase niet storen.
    9. Precipiteren de RNA door meerdere keren inverteren en incuberen gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    10. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C en verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie (waterstraal pomp en zuigfles). Laat de witte transparante RNA pellet op de bodem niet verstoren.
    11. Voeg 1 ml van 70-80% RNase ethanol (niet vortex) te wassen. Opmerking: RNA in ethanol kan worden opgeslagen gedurende verscheidene weken bij -20 ° C.
    12. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7500 x g en 4 ° C en verwijder supernatant door pipetteren of bij voorkeur aspiratie.
    13. Lucht drogen RNA pellet voor 15-30 min onder de zuurkast. Niet Kreukherstellend, kan anderszins pellets moeilijk om opnieuw op te lossen zijn.
    14. Resuspendeer de pellet in 50 gl RNase vrij DDH 2 O of RNA opslagbuffer.
    15. Meet RNA-concentratie met een microvolume UV-Vis spectrofotometer of een kwartscuvette (en conventionele fotometer) en ga verder met DNase I spijsvertering.
  2. DNase I digestie van RNA om sporen DNA te verwijderen
    OPMERKING: Aangezien DNA kan als een matrijs in de valse reverse transcriptie (primer extensie) reacties, moet uit het monster worden verwijderd. Verscheidene werkwijzen voor het verwijderen van DNA van RNA oplossingen beschikbaar die meestal afhankelijk DNase spijsvertering. Een eenvoudige maar effectieve en kostenefficiënte methode voor DNA-verwijdering wordt hieronder uiteengezet.
    1. Verwarm waterbad tot 37 ° C.
    2. Meng de in tabel 1 opgesomde verbindingen in een 1,5 ml reageerbuis.
    3. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C in een waterbad, en vervolgens direct doorgaan naar de fenol / chloroform extractie. Opmerking: Hitte inactivatie van het DNase I wordt niet aanbevolen, omdat dit de RNA zou degraderen.
    </ Li>
  3. Fenol / chloroform extractie van RNA na DNase I Spijsvertering
    OPMERKING: De RNA moet worden gezuiverd om vrije nucleotiden, DNA fragmenten en buffercomponenten van de DNase I digestie verwijderen. Fenol / chloroform extractie zorgt voor hoge terugwinning en concentratie van het RNA monster en daarom hieronder beschreven. Andere werkwijzen voor RNA zuivering kan ook worden gebruikt indien zij aan deze eisen.
    1. Split 500 ul DNase I digestie mengen in twee 250 ui monsters in 2 ml reageerbuizen.
    2. Voeg 1 volume (250 pl) van zure P / C / I oplossing (in water verzadigde fenol, chloroform en isopentanol, verhouding 25: 24: 1, pH 4,5-5).
      OPMERKING: P / C / I oplossing is kankerverwekkend, giftig en corrosief. Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken onder een zuurkast met adequate bescherming!
    3. Krachtig vortex of plaats in een vortexen platform voor 1-3 min.
    4. Centrifugeer 30 minuten bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C.
    5. Verzamel de bovenste (waterige) fase en over te dragen aan nieuwe buis (250 ul).
    6. Voeg 1/9 volume (28 pl) van 3 M natriumacetaat pH 5,2.
    7. Voeg 2,5-3 eenheden zuivere ethanol (700 ul).
    8. Meng door vortexen kort en plaats bij -80 ° C gedurende 30 minuten of bij -20 ° C gedurende 2-3 uur. Indien nodig, slaan de RNA O / N bij -20 ° C.
    9. Centrifugeer 30-60 minuten bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C.
    10. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
    11. Was de pellet door toevoeging van 1 ml van 70% ethanol op de pellet. Doe niet vortex monster.
    12. Centrifugeer monster gedurende 5 min bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C.
    13. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
    14. Lucht drogen pellet onder de zuurkast. Bewaar de pellet bij -20 ° CO / N indien nodig.
    15. Los het pellet in 30 pl DEPC behandeld H2O door vortexen gedurende 2 min en deze oplossing pe lossenllet van de overeenkomstige tweede buis per monster (30 ul oplossing per één extractie paar).
    16. Meet RNA-concentratie, en ervoor te zorgen dat het hoger is dan 1 ug / ul voor gebruik in primer uitbreiding van gemiddeld uitgedrukt mRNA's.
    17. Indien nodig, slaan het RNA bij -20 ° C gedurende enkele weken tot enkele maanden.

2. primerverlengingsreactie

  1. Primer ontwerp
    OPMERKING: Bij het ontwerpen van primers voor een primer extensie experiment, gehoorzamen algemene richtlijnen van de PCR-primer ontwerp (zie de handleiding bij de geautomatiseerde gel sequencer voor meer informatie en discussie sectie in dit document).
    1. Specifiek zorgen dat de primers (i) niet runs basen bevatten, (ii) bezit een G of C aan het 3 'uiteinde, (iii) een evenwichtig GC: AT verhouding, (iv) een annealing temperatuur van 55-60 ° C en (v) binden ten minste 50 bp, beter 100 bp stroomafwaarts van het gebied van belang om duidelijke beelden te ontvangen.
  2. Primerverlengingsreactie
    OPMERKING: De primer extensie reactie (cDNA synthese) vereist grote hoeveelheden template RNA. Als de hoeveelheden RNA gebruikt worden gekozen om laag is, kan het signaal te laag op te sporen! Wij adviseren daarom de zuivering van het RNA, zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: LET OP: Gebruik RNase vrij reagentia en plastic ware !!!
    1. Verwarm de thermocycler een temperatuur van 95 ° C en het uitvoeren van alle verdere incubatie stappen in een thermocycler voor gebruiksgemak en reproduceerbaarheid.
    2. Meng de verbindingen van tabel 2 in een PCR-buis voor elk RNA-monster.
    3. Denatureren de monsters gedurende 1 min bij 95 ° C.
    4. Plaats de buizen op ijs en kou voor 5 min naar RNA's en primers hybridiseren.
    5. Stel de PCR machine tot 47 ° C.
    6. Ondertussen bereidt de reverse transcriptie master mix zoals beschreven in Tabel 3.
    7. Voeg 4 ul van reverse transcriptie master mix aan elkaar gehybridiseerd RNAmonster.
    8. Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij 47 ° C. Opmerking: De optimale temperatuur voor AMV RT 42 ° C, maar hogere temperaturen helpen om secundaire structuren van de RNA-moleculen te overwinnen.
    9. Stop de reactie door verhitting van de monsters tot 95 ° C gedurende 2 min.
      OPMERKING: Formamide is corrosief, giftig en kan schadelijk zijn voor het ongeboren kind. Lees de Material Safety Data Sheets, met zorg te behandelen en draag geschikte bescherming!
    10. Voeg 6 pl formamide ladingskleurstof (95% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 10 mM EDTA, 0,05% (w / v) broomfenolblauw) en opslag voor O / N tot twee weken bij -20 ° C in het donker.

3. Bereiding van het Sequencing Ladder

OPMERKING: De sequencing ladder reactie vereist hetzij matige hoeveelheden plasmiden of grote hoeveelheden genomische DNA. Waar mogelijk, wordt het gebruik van plasmiden in de opeenvolging reactie aanbevolen omwille van het gemak van het isolement en hoge signal intensiteit. In andere gevallen, we routinematig een werkwijze van Marmur 5,14 aangenomen om genomisch DNA van E. voorbereiden coli en S. aureus cellen zonder fenol gebruiken. In principe elke werkwijze die grote hoeveelheden en zuiverheid van genomisch DNA oplevert worden gebruikt.

  1. Genomisch DNA Isolation
    1. Kweek 10 ml van E. coli of S. aureus O / N in LB, BM 5 of TSB medium.
    2. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 4600 x g in een 15 ml Falcon buis.
    3. Pellet geresuspendeerd in 2 ml buffer P1 zoals in sommige mini voorbereiding kits (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 ug / ml RNase A).
    4. Lyse cellen gedurende 45-60 minuten bij 20-40 gl lysostafine (0,5 mg / ml, opslag bij -20 ° C). Opmerking: Voor E. coli cellen de enzymatische voorbehandeling kan ofwel worden weggelaten of lysozyme gebruikt.
    5. Voeg 100 ul van verzadigde SDS-oplossing (in 45% ethanol) om de schorsing en incubate gedurende 5 min bij 37 ° C.
    6. Voeg 650 ul 5 M NaClO 4 en de kort vortex cellen.
      OPMERKING: Chloroform is een potentieel carcinogeen. Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken onder een zuurkast met adequate bescherming !!!
    7. 3 ml chloroform / isopentanol (24: 1 verhouding) aan het mengsel en schud gedurende tenminste 60 sec. Opmerking: De vloeistof moet veranderen in een homogene witte emulsie.
    8. Centrifuge monster gedurende 10 minuten bij 4600 xg en RT om de fasen te scheiden.
    9. Dragen de duidelijke bovenste (waterige) fase zorgvuldig naar een nieuwe buis. Als oplossing troebel, herhaal de chloroform / isopentanol extractie. Meet het volume van de DNA-oplossing en stelt een nieuwe buis met 2 volumina ethanol (100%).
    10. Langzaam decanteren of pipet de DNA-oplossing in de ethanol die buis. Opmerking: DNA moet zo transparant, dichte spoelen op de bodem of als volledig uitgedroogd als een zwevende witte cluster neerslaan.
    11. Haal de DNA met haken van glas Pasteur pipetten (figuur 2) en tweemaal wassen elk monster door dompelen in een afzonderlijke buis van 1 ml van 70% ethanol.
    12. Plaats de haken rechtop in een rek en de lucht droog de pellet gedurende 60 min. Sla zonodig de gedroogde DNA enkele dagen bij kamertemperatuur.
    13. Ontbinden DNA door het afbreken van de DNA bedekt glas haken en het plaatsen in een 2,0 ml reactie buis met 100-500 ul DDH 2 O. Stel het volume op een definitieve DNA-concentratie van 1.000 - 1.500 ng / ul. Voor een sequentiebepalingsreactie Gebruik 10-18 ug genomisch DNA.

Figuur 2
Figuur 2. Instructie over hoe een DNA hengel te maken. Houd de punt van een glazen Pasteur pipet in de vlam van een bunsenbrander. Hierdoor wordt de glazen beginnen smelten na enkele seconden, waardoor een kleine haak thij beëindigen. Snel te verwijderen van de vlam en laat afkoelen gedurende 1 min.

  1. Plasmide Isolation
    1. Bereid plasmiden met standaard mini voorbereiding kits en oplossen in elutiebuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Afhankelijk van de grootte plasmide, gebruikt 100-500 ng plasmide voor een ladder sequencing.
  2. Sanger Sequencing reactie
    OPMERKING: Hieronder vindt u een eenvoudig protocol dat een fluorescent gelabelde primer sequencing kit gebruikt met 7-deaza-dGTP die goed werkt voor de primer extensie. Raadpleeg de sequencing kit handleiding voor gedetailleerde informatie. Let op de sequencing reactie dezelfde primer dient als de primerverlengingsreactie op producten van dezelfde lengte te maken.
    1. Meng 12 ui genomisch DNA (~ 10-15 ug) met 1 pl DMSO en 1 pl fluorescent gelabelde primer (2 pmol / pl).
    2. Aan elk 1 gl van de vier sequentiebepaling reactiemengsels (A, C, G of T), voeg 3 ul van de DNA / DMSO / Primer mix. Plaats de monsters in een PCR-machine, en voer de volgende PCR-programma: 95 ° C gedurende 2 minuten; 35 cycli van 95 ° C gedurende 20 sec, 54 ° C gedurende 20 sec, 70 ° C gedurende 30 seconden; houden bij 4 ° C voor altijd.
    3. Na de run, verwijder de monsters uit de machine, voeg 6 pi laadkleurstof en op te slaan op ijs (korte termijn) of bij -20 ° C gedurende enkele dagen tot weken.

4. Gel Setup en Apparatus Run

OPMERKING: Gedetailleerde informatie over de manier waarop de sequencing gel apparaat wordt gemonteerd, wordt de gel voorbereid en hoe de gel wordt gerund kan worden gevonden in de fabrikant protocol.

  1. Voorbereidingen
    1. Bereid 10x TBE overeenkomstig tabel 4.
    2. Op de dag van de gel run bereiden 1 liter 1x TBE buffer met ultrapuur DDH 2 O.
    3. Bereid 10% (w / v) APS. Opmerking: Kan worden opgeslagen in 200 gl aliquots bij -20 ° C gedurende verscheidene maanden, maar de activiteit kan afnemen in de tijd <./ Li>
  2. Vergadering van gel gieten kamer
    1. Vermijd stof en vuil tussen de glasplaten. Daarom grondig schoon werken oppervlakken met behulp van vochtige doekjes.
    2. Reinig een paar 25 cm glasplaten met wegwerp papieren handdoeken en gedestilleerd water aan beide zijden en isopropanol voor de binnenzijde van de glasplaten.
    3. Plaats 0,25 mm spacers op de achterste glasplaat en laat de schuine glazen bovenplaat (figuur 3).
    4. Bevestig de gel rails aan beide zijden van de glazen platen met de inkeping en de intrede rail piloten naar boven en draai knoppen licht.

Figuur 3
Figuur 3. explosieaanzicht van de gelelektroforese glasplaten. Glasplaten dient directioneel gebruikt. Zorg ervoor dat de binnenzijde van de glasplaten naar binnen en het buitenvlakkant naar buiten.

Figuur 4
Figuur 4. Weergave van een samengestelde gel inrichting. Na de toediening van de geloplossing, de zak afstandhouder wordt geplaatst in de oplossing tussen de glasplaten. De casting plaat wordt vervolgens gleed tussen de voorste glasplaat en de gel rails en beveiligd door de bevestiging van de rail knoppen.

  1. Het gieten van de gel
    OPMERKING: niet gepolymeriseerde acrylamide is neurotoxisch! Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken met een passende bescherming !!!
    1. Voeg de in tabel 5 opgesomde verbindingen in een beker en meng met een roerstaaf en een magneetroerder.
    2. Onmiddellijk na het toevoegen van APS en TEMED, het nemen van de gel-oplossing in een spuit van 50 ml en plaats een 0,45 nm filter op het puntje.
    3. Ofwel houdt u de bovenste rand van de glazen plaat met een hand of plaats de sandwich in een gel gieten staan ​​om een ​​helling schuin 10 te creëren - 20 °.
    4. Langzaam afzien de geloplossing tussen de glasplaten onder voortdurend bewegen van de spuit van de ene zijde naar de andere en stoppen zodra de geloplossing aan de onderkant.
    5. Verplaatsen naar de zijkant of volledig te verwijderen enig gevormd bellen met behulp van een zeepbel haak.
    6. Schuif de gel pocket afstandhouder (0,25 mm) tussen de glasplaten aan de inkeping, onderdompelen in de geloplossing en bevestig door aan het gieten plaat.
    7. Bouten bovenste rail lichtjes (Zie Figuur 4 voor een volledig geassembleerde toestellen).
    8. Laat gel set voor 1-2 uur.
    9. Verwijder de casting plaat en pocket spacer en reinig de zak van zout en gel resten.
    10. Spoelen met DDH 2 O en veeg overtollige oplossing met papieren zakdoekjes.
  2. Hardlopen en het visualiseren van de gel
    OPMERKING: De sequentiegels worden direct onderworpen aan elektroforese in de gel imager, terwijlde fluorescentie gelijktijdig gedetecteerd door een laser microscoop. In tegenstelling tot conventionele gelelektroforese, waarbij de gel eerst wordt uitgevoerd en daarna gekleurd en gevisualiseerd, wordt de detectie-eenheid vast en scant de banden in real time als ze passeren de laser. Onderstaand een procedure voor de ImagIR Dataverzameling software op OS / 2 is geschetst, die aan meer recente versies kunnen worden aangenomen. Voor meer informatie zie de handleiding.
    1. Schuif de buffertank houder in de gel rails aan de voorzijde glasplaten en draai de knoppen.
    2. Plaats gel in de onderste gel tank van de geautomatiseerde gel imager tegen de verwarming plaat en bevestig door te schuiven het spoor toegang piloot in het toestel beugels.
    3. Vul 1x TBE buffer in de onderste en bovenste gelbuffer kamers, sluit de lagere buffer kamer en sluit de bovenste bufferruimte om de stroom met het netsnoer.
    4. Indien aanwezig, het reinigen van de gel zak van zout-residu's door herhaaldelijk pipetteren buffer in de pocket.
    5. Sluit de bovenste buffertank kamer met behulp van de bovenste buffer deksel.
    6. Sluit de deur van de automaat en schakel de imager en de computer en start de Base ImagIR Dataverzameling software.
    7. Maak een nieuw project bestand (Bestand> Nieuw ...), voert een project bestandsnaam, selecteer de juiste laser ranges (700 of 800 nm) en bevestig met OK.
    8. Selecteer Opties> Auto gain ... uit het beeld menu bovenaan, klik op Automatisch om de automatische gain meting te starten en de instellingen te accepteren door op OK te klikken.
    9. De focus van de laser door het selecteren van opties-> Focus ... van de scanner controle menu te klikken op de knop Auto en het accepteren van de instellingen door te klikken op OK.
    10. Herhaal de automatische versterking procedure aan te passen aan de nieuwe aangescherpte regio.
    11. Setup de scanner controle volgens deze instellingen: 2000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, Scan filter: 3, Scan snelheid: 3.
    12. Voorloop de lege gel gedurende 20 minuten (select spanning op en druk op <ENTER> ).
    13. Ondertussen verwarm de sequentie ladder en de primerverlengingsproducten in een PCR machine gedurende 2 min tot 90 ° C, vervolgens afgekoeld op ijs.
    14. Stop de elektroforese, opent u de geautomatiseerde gel sequencer en verwijder de bovenste buffertank deksel.
    15. Steek de haaientand-kam in tussen de glasplaten en iets doorboren de gel met de haaientanden (zie figuur 5).

Figuur 5
Figuur 5. Close-up bekijken van gel met haaientand kam. Steekproef (paars) wordt toegepast tussen de haaientanden.

  1. Pipette ofwel 1-2 pl van de primerextensieproducten of sequencing ladder reacties in elkaar gel pocket (gevormd door de haaientanden).
  2. Als niet alle zakken nodig zijn, vul lege zakken met laadkleurstof om te voorkomen dat inconsistente loopgedrag.
  3. Sluit de buffertank en de deur van de gel sequencer.
  4. Start elektroforese en zet laser (Select spanning op en Laser ON en druk op <ENTER>).
  5. Stop elektroforese eenmaal regio van belang de laser is gepasseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals weergegeven in figuur 6, kan een primer extensie reactie worden gebruikt om de transcriptionele startpunten van transcripten van belang te bepalen en kan helpen om promotergebieden afleiden (gewoonlijk aangeduid met -10 en -35 elementen). De bovenste (langste) cDNA fragment representeert het uiteinde van het mRNA 5 en kan dus gemakkelijk worden toegewezen in vergelijking met de sequentie ladder.

Figuur 6
Figuur 6. Representatieve resultaten van een primerverlengingsreactie. Aan de linkerkant een volledige in-vivo primerextensie gel van E. coli met verschillende plasmiden weergegeven. Individuele gebieden van belang zijn vergroot. In het bovenste deel (A), is de bepaling van de ompA transcriptionele uitgangspunt afgebeeld. De reverse transcriptie stopt op het einde van het mRNA van de 5 'en creëert zo een band van de volledige lengte RNA (inddelgrote door een pijl). Door het uitlijnen van de cDNA band met de sequentie ladder kan einde van het mRNA het 5 'worden bepaald zoals getoond in de bijgevoegde sequentie. In het onderste deel (B), is de splitsing van de ompA transcript door de YoeB-SEQ2 RNase getoond. Lanen 1-3 vertegenwoordigen monsters waarbij de toxine YoeB-SEQ2 ontbreken of inactief, terwijl lanen 4-5 vertegenwoordigen monsters met een actieve RNase, samenvalt met de afwezigheid en aanwezigheid van cDNA producten. Twee splitsingsproducten worden gemaakt zoals aangegeven door de pijlen. De ddNTP in elke baan en de overeenkomstige RNA basis van de sequentie ladder gelabeld. Transcript delen zijn aangegeven met blauw lettertype, promoter elementen en augustus startcodon door magenta lettertype. Voor meer informatie; zie het oorspronkelijke onderzoek artikel van Nolle et al., Microbiology 159, 1575-1585 (2013). Klik hier om tebekijk een grotere versie van deze figuur.

In de in figuur 6 bijvoorbeeld de TSP van het ompA mRNA werd bepaald op een G base (aangegeven met een pijl in de onderstaande volgorde de gel) zijn. Dit strookt met de ompA TSP gepubliceerd voor 15. De -35 en -10 elementen van de promoter kan worden afgeleid om TTGTAA en TAGACT 16 als de motieven verschillen slechts twee basissen elk van hun respectievelijke consensussequenties (TTGACA en TATAAT respectievelijk).

In tegenstelling tot andere werkwijzen, zoals 5 'RACE, kan primerverlengingsreacties worden gebruikt om nauwkeurig te bepalen en kwantificeren van de splitsing van RNA-moleculen. Splitsing van RNA moleculen veroorzaakt vrije 5 'uiteinden, die gelijktijdig kunnen worden gedetecteerd als cDNA banden in de gel. Het identificeren van verschillende splitsingsproducten van een mRNA is moeilijker in 5 'RACE-experimenten, aangezien verschillende PCR-producten moeten worden gesequenced om splitsing producten te verkrijgendat slechts een klein deel van de totale (onbewerkte) RNA bulk.

In het onderste deel van figuur 6, wordt het RNA in kaart brengen van de splitsing door een RNase afgebeeld. Zoals eerder beschreven 5, de RNase-YoeB SEQ2, van een TA-systeem van S. equorum 17, splitst mRNA's dicht bij de start codon. Deze splitsing kan worden geremd door het cognate antitoxine YefM-SEQ2. Wanneer de RNase YoeB niet aanwezig of inactief (lanen 1-3), worden geen primerverlengingsproducten dichtbij het startcodon vormden. Wanneer RNase-activiteit aanwezig (lanen 4 en 5), twee sterke banden kort stroomafwaarts van het startcodon weergegeven. Met deze benadering kan splitsingspatronen gemakkelijk worden geïdentificeerd.

Figuur 7 toont een mislukte primerverlenging experiment. Door overmaat RNA in de reverse transcriptie reactie, de gegenereerde hoeveelheid cDNA creëert zo'n sterk signaal, dat individuele cDNA bandkan niet worden onderscheiden. Dit maakt RNA einde vastberadenheid 5 'onmogelijk.

Bij gebruik van hoog tot expressie RNA in de primerverlengingsreactie, zoals een ribosomaal RNA (zoals weergegeven in figuur 7), het risico op overmatige belichte gebieden verhoogt. Daarom moet de totale hoeveelheid RNA matrijs worden aangepast aan de overvloed van het RNA van belang. Wanneer daarentegen transcripten plaats slechts een kleine hoeveelheid van het totale RNA vormen, de hoeveelheid in het reverse transcriptie reactie moet worden verhoogd, anders de signalen te zwak zijn (niet getoond). Dit geldt ook voor de Sanger sequencing reactie, zoals multi-kopie templates per cel (bijvoorbeeld rRNA genen of genen gecodeerd op plasmiden) resulteren in veel sterkere signalen.

Figuur 7
Figuur 7. Vertegenwoordiger gevolg van een mislukte primer extensie uit ng> S. aureus. 16S RNA veel voorkomt in bacteriële cellen. Dit leidt tot krachtige reverse transcriptie signalen bij matige hoeveelheden totaal RNA gebruikt. In het hier afgebeelde geval, de sterke cDNA banden masker precies 5 'uiteinde en dus voorkomen 5' mapping. Daarnaast ribosomale RNA's zijn zeer gestructureerd en kan dus reverse transcriptie tussentijds te beëindigen, het produceren van korte cDNA producten die niet de volledige lengte fragmenten niet vertegenwoordigen. In dit geval verhogen reverse transcriptie temperatuur, samen met een hittebestendige reverse transcriptase kan het gemakkelijker maken om langs secundaire structuren te synthetiseren. Als gevolg van meerdere kopieën van de volgorde in het genomische DNA, de Sanger-sequencing ladder is sterker dan voor enkele kopie genen. De gel beeld te verbeteren, RNA en DNA bedragen voor de reverse transcriptie en Sanger reactiemengsel te verlagen en / of minder product op de gel gebracht._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1: DNase I digestie van RNA.

Stof Bedrag
RNA uit bovenstaande stap 70-100 gg
10x DNase I buffer (100 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) 50 gl
DNase I, RNase vrij (2 U / ul) 10.0 ul (tot 10 ug RNA per 1 gl DNase I)
Breng het volume tot 500 ul met DDH 2 O (DEPC behandeld)

Reactievolume en de hoeveelheid DNase I kan worden vergroot of verkleind afhankelijk van de hoeveelheid of RNA gebruikt.

Tabel 2: RNA-primer hybridisatie.

Samenstelling Bedrag voor één reactie
RNA 5-15 ug
Fluorescent gelabelde primer 2 pmol
Breng het volume van 6 pi met DDH 2 O (DEPC behandeld)

Opzetten van één reactie per RNA monster en primer.

Tabel 3: Primerverlenging master mix.

Samenstelling Bedrag voor één reactie
DDH 2 O (DEPC behandeld) 1.3 ul
AMV RT Buffer (10x) 1.0ul
dNTP (10 mM, RNase vrij) 1,0 gl
RNase Inhibitor 0,2 pl
AMV Reverse Transcriptase (RT) (20 - 25 U / pl) 0,5 pl

Schalen naar het aantal reacties nodig.

Tabel 4: 10x TBE recept.

Stof Bedrag
Tris Base 107,8 g
Boorzuur 55,0 g
EDTA 7,4 g
Breng het volume tot 1.000 ml met ultrapuur DDH 2 O en filter om stof en vuil te verwijderen

Filter om stof en pluizen en op te slaan te verwijderen bij 4 °C.

Tabel 5: Sequentiebepaling gel recept.

Samenstelling Bedrag
Ureum 10,5 g
DDH 2 O (MilliQ) 13,0 ml
10x TBE 2.5 ml
XL Rapid geloplossing 5,0 ml
TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamine) 25 gl
APS (ammoniumpersulfaat, 10%) 175 ul

Werkwijze geloplossing snel na de toevoeging van TEMED en APS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescerende primer extensie is een eenvoudige en snelle werkwijze voor het bepalen uiteinden van de RNA 5 ', zowel voor TSP- of secundaire RNA processing identificatie. Door het gebruik van fluorescente primers, kan de reactie worden opgezet en uitgevoerd zonder extra veiligheidsmaatregelen (anders dan bij radioactief gemerkte primers). De monsters worden gedetecteerd door fluorescentie, kunnen ze worden afgebeeld terwijl de elektroforese wordt uitgevoerd die een snelle analyse mogelijk maakt in vergelijking met radioactieve werkwijzen waarbij röntgenfilms algemeen worden gebruikt.

In het algemeen is de kwaliteit van de primer extensie reactie is sterk afhankelijk van de kwaliteit en bindende vermogen van de primer. Indien de bindingsplaats te dicht bij het interessegebied wordt gekozen, kan primer smeert het signaal maskeren, terwijl een bindingsplaats te ver weg (> 300 bp) van het 5 'uiteinde kan een slecht signaal.

De fluorescerende kleurstof moet covalent worden gekoppeld aan de5 'uiteinde van het aangepaste DNA oligonucleotide tijdens de synthese en de oligonucleotide worden gezuiverd door HPLC om interferentie met de reverse transcriptie reactie van restzouten voorkomen. De oligonucleotiden met de juiste kleurstof modificatie (zie lijst reagentia tabel voor meer informatie over compatibele kleurstoffen) kan van de meeste oligonucleotidesynthese bedrijven worden besteld en moeten worden bewaard in het donker. Helaas, we zijn niet op de hoogte van enige enzymatische technieken om de kleurstof te eerder bestaande oligonucleotiden hechten, zoals mogelijk is met radioactief gelabelde nucleotiden.

In het sequencing systeem beschreven, kunnen twee verschillende fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om simultaan twee monsters, als excitatie (700 en 800 nm) en emissiespectra onderscheiden. Naast de oorspronkelijke fabrikant kleurstoffen kunnen andere kleurstoffen zoals vermeld in de lijst reagentia worden uitstekende resultaten.

Een andere belangrijke factor voor primer extensie reacties is het RNA kwaliteit en hoeveelheid. Zorg moet worden genomen om DNA verontreinigingen, zoals omkeertranscriptasen zoals de AMV RT DNA kan als een matrijs 18.

Zoals getoond in figuur 7, de gedetecteerde signaalsterkte van banden in de gel termijn is afhankelijk van de hoeveelheid RNA die in de reverse transcriptie reactie. Het is daarom essentieel om de hoeveelheid totaal RNA passen, afhankelijk van de proportionele hoeveelheid van het RNA van belang in het monster. De lage gevoeligheid van deze werkwijze is ook een van de nadelen, zo laag uitgedrukt RNAs moeilijk te detecteren zijn. Indien geen signaal kan worden gedetecteerd in alle, kan de hoeveelheid totaal RNA worden verhoogd of RNA van belang kan kunstmatig worden overexpressie van een plasmide.

Gel detectie gevoeligheid voor fluorescentie gebaseerde primer extensie is ongeveer factor tien lager dan 32P of 33P radioisotope gebaseerde primer extensie 19. Echter, dit nadeel kan worden gecompenseerd door de hoeveelheid cDNA geladen op de gel of door de hoeveelheid RNA sjabloon in de reverse transcriptie reactie. In de meeste gevallen is de gevoeligheid hoog genoeg voor bevredigende resultaten 4,5. Gevoeligheden Soortgelijke radioactieve primerverlengingen gerapporteerd bij gebruik fluorescente primers in combinatie met een capillaire sequencer 3, met het voordeel van korte belichtingstijden.

Kosten vergelijkingen tussen fluorescentie en radioactiviteit gebaseerde primer extensies zijn moeilijk, omdat ze afhankelijk zijn van verschillende factoren zoals de beschikbare machines, primers, ladder reacties, beschikbaarheid en onderhoud van een laboratorium voor het werken met radioactieve stoffen, opslag van radioactief afval, training en individuele gezondheidsrisico's . Fluorescerende primers zijn vijf tot tien keer duurder dan niet-gemerkte standaard primers (20 bp). Maar deze primers kunnen worden gebruikt voor ten minsteper jaar (waarschijnlijker jaren) vergeleken met 32P gemerkte primers, die een veel kortere halfwaardetijd. Re-etikettering van primers is tijdrovend en kostbaar vanwege de noodzaak van nieuwe radioactief materiaal frequent. Als dezelfde set primers wordt gebruikt in een lange periode, fluorescerende primers zijn goedkoper dan gewone, radioactief gelabelde primers. De belangrijkste kostenpost punt zal echter de fluorescerende sequencer of imager en de aankoop van dit apparaat uitsluitend voor het verrichten van primer uitbreidingen misschien niet rendabel zijn. De hier beschreven methode is nogal interessant voor groepen die in het bezit zijn van of toegang hebben tot een dergelijke machine.

Als een geautomatiseerde sequencer gel niet beschikbaar is, kunnen andere werkwijzen voor fluorescentiedetectie eveneens worden gebruikt. In dit geval kan de gel worden uitgevoerd in een standaard elektroforese-inrichting, indien nodig gedroogd en vervolgens overgebracht naar een fluorescentie imager (modellen beschikbaar die vergelijkbaar zijn flatbed scanners). Hoewel het voordeel van het visualiseren van de gel tijdens de run verloren, kan het gebruik van radioactieve isotopen worden vermeden Aldus zal een belangrijk voordeel voor de experimentator. Bovendien, indien beschikbaar, een capillaire sequencer kan worden gebruikt voor scheiding en real-time detectie, die kunnen helpen om de gevoeligheid te verhogen.

Verschillende werkwijzen zijn gepubliceerd over fluorescerende primer extensie met geautomatiseerde sequencing gel machines of capillaire sequencer gebruiken, maar deze methoden vaak cDNA precipitatiestap om het monster te concentreren (en verwijderen onzuiverheden) 19. In de hier voorgestelde methode, DNA neerslag niet noodzakelijk waardoor de voorbereidingstijd verminderen. Belangrijker echter, weglaten van deze stap is het mogelijk om semi-kwantitatief de hoeveelheid RNA moleculen in het monster de inconsistenties van de precipitatie procedure kan worden geëlimineerd.

Opgemerkt wordt, dat hoeweluiteinden van RNA moleculen het 5 'kunnen worden ingepast primerverlengingsreacties, verwerkt en primaire einden (transcriptionele startpunten) kan niet gemakkelijk worden onderscheiden. Om deze beperkingen te omzeilen, zorgvuldige planning van de experimenten met de nodige controles is essentieel. Obvious promotor sequenties kan de aanwezigheid van een transcriptie startpunt aangeven en muteren of verwijderen promotorelementen moet dan afschaffen cDNA bands. Anderzijds, indien dergelijke sequenties ontbreken of specifieke consensus sequenties aanwezig zijn, de banden kan worden veroorzaakt door bewerking van het RNA. Als de verwerking enzym bekend en kunnen worden gezuiverd, kunnen in vitro primerverlengingen brengen verduidelijking transcriptie en verwerking kan worden gescheiden. Bovendien kunnen andere werkwijzen zoals 5 'RACE (inclusief enzymatische verrijking van onverwerkte RNA moleculen) primerverlengingen aanvulling op transcriptie startplaatsen van RNA processing onderscheiden.

The primerverlenging wordt vaak vergeleken met andere methoden, zoals 5 'RACE en S1 nuclease bescherming en daarmee de bruikbaarheid soms ondervraagd. RNAseq technieken in combinatie met next generation sequencing bijvoorbeeld kan helpen bij het bepalen van TSP en verwerking websites van veel van RNA's in parallel, maar de financiële lasten en bioinformatical werk dat nodig maakt het nogal oneconomisch voor enkelvoudige RNA's van belang. 5'-RACE anderzijds goedkoper en de resultaten zijn gemakkelijker te analyseren, maar als RNA verwerking op verschillende manieren of meerdere transcriptionele startpunten aanwezig zijn, moet het product worden gekloneerd en een groot aantal kandidaten moeten worden gesequenced om het verkrijgen van een representatief beeld van de RNA's van belang.

Daarom, in weerwil van nieuwe methoden door de jaren heen hebben voorgedaan, zelfs vandaag primer extensies hebben hun raison d'être te wijten aan het gebruiksgemak, lage kosten en een korte doorlooptijd, dat is vooral het gevalde fluorescentie gebaseerde methode hier gepresenteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) NEB / Roche NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free) Ambion (life technologies) AM2222
FastPrep-24 Instrument  MPBio 116004500
Fluorescently labeled primers Biomers n/a 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software Li-Cor Product discontinued
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
Nuclease free water Ambion (life technologies) AM9915G
Plasmid mini preparation kit QIAGEN 12125
RapidGel-XL-40% Concentrate USB US75863
RNA STORAGE BUFFER Ambion (life technologies) AM7000
Roti-Aqua-P/C/I Carl Roth X985.3 Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor Ambion (life technologies) AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP GE Healthcare RPN2538
TRIzol reagent life technologies 15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm BioSpec 11079101z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
  2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
  3. Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
  4. Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
  5. Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
  6. Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
  7. Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
  8. Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
  9. Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
  10. Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
  11. Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
  12. Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
  13. Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
  14. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
  15. Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
  16. Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
  17. Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.
  18. Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
  19. Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics