Lipidensuppletie voor een lange levensduur en gentranscriptionele analyse bij Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft twee lipidensuppletiestrategieën met een combinatie van longitudinale en transcriptionele analyse in het modelorganisme, C.elegans. De techniek beschrijft hoe transcriptionele veranderingen kunnen worden onderzocht met behulp van enkele wormen of ontleed wormweefsels en hoe de vloeibare voeding voor een insectenpopulatie kan worden gekoppeld aan hydrotechnieken. Personen die deze techniek uitvoeren, moeten weefseldissectie oefenen vanwege het korte tijdvenster om het experiment uit te voeren om adequate transcriptionele analyse te bereiken.

Verzamel om te beginnen OP50-bacteriën door de ‘s nachts gekweekte cultuur gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 4.000 G te centrifugeren. Gooi het supernatant weg. Suspensie de bacteriële pellet in 20 milliliter bacteriële verdunning, dieetbeperking of BDR-base door vortexing en herhaal opnieuw de centrifugatie gedurende 10 minuten.

Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspenseert u de bacteriële pellet opnieuw in het BDR-medium om een bacteriële bouillon van 20 X BDR te bereiden. Verdun de bacteriële bouillon tot 5X met behulp van een BDR-medium voor gebruik. Gebruik ethanol of dimethylsulfoxide als oplosmiddel, bereid een lipide stockoplossing in een nieuwe glazen injectieflacon met autoclaaf en vul de glazen injectieflacon met argon of stikstof om oxidatie te voorkomen.

Breng de lipidevoorraadoplossing over naar de BDR-bacterieoplossing om de gewenste eindconcentratie in voedingsomstandigheden te bereiken. Meng het grondig door 20 seconden te vortexen. Bereid het voertuig voor dat wordt bestuurd door dezelfde hoeveelheden gefilterde ethanol of dimethylsulfoxide met BDR-bacteriën te mengen.

Voer lipidensuppletie en vloeistofcultuur uit door de gewenste hoeveelheid lipide- of voertuigcontrole over te brengen naar elke put van een 12-putplaat met drie tot vier replicaties voor elke voedingsconditie. Meng de gesynchroniseerde Caenorrhabditis elegans wormsuspensie met 5X BDR bacteriën in een één-op-één verhouding om een uiteindelijke concentratie van 1.500 wormen per milliliter en 2,5X voor bacteriën te bereiken. Breng vervolgens twee milliliter van het wormbacteriemengsel over naar elke put van de 12 putplaat.

Als u klaar bent, wikkelt u de 12-putplaat met folie en schudt u de plaat in een incubator van 20 graden Celsius bij 100 RPMM voor de gewenste incubatielengte. Voor lipidensuppletie op platen, zaai een milliliter van de lipide geconditioneerde bacteriën op het midden van een 10 centimeter nematode groeimedium of NGM agar plaat. Zorg ervoor dat de uiteindelijke werkoplossing meerdere keren wordt gevortexed tussen het zaaien van de twee platen bij het werken met een groot aantal platen.

Droog de plaat in het donker in een bioveiligheidskap. Breng 3000 wormen over van de gesynchroniseerde wormencultuur naar de 10 centimeter plaat. Droog de plaat in een bioveiligheidskap totdat wormen die op de met lipiden aangevulde platen zwommen, beginnen te kruipen.

Eenmaal gedroogd, incubeer de lipide geconditioneerde plaat in een incubator van 20 graden Celsius voor de gewenste tijdsduur en als u meervoudig onverzadigde lipiden gebruikt, beschermt u de plaat tegen licht. Bereid 20 microliter eindlysisoplossing voor elk monster door 0,2 microliter DNase I te mengen met 19,8 microliter lysisoplossing in een PCR-buis en meng deze goed door vijf keer op en neer te pipetteren. Om het RNA uit het kleine aantal hele wormen te extraheren, verwijdert u de bacteriën door 15 tot 20 wormen van het bacteriële gazon over te brengen naar een vers ongeplaatste NGM-plaat.

Breng 15 tot 20 wormen over van de ongezaaide NGM-plaat naar de PCR-buis met 20 microliter van de vers bereide eindlysisoplossing met het minimum aantal bacteriën en incubeer de lysereactie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zodra de incubatie voorbij is, houdt u het monster in een mooi koudwaterbad en sondet u de wormen vier keer, vijf seconden per keer met 30% amplitude en pulseert u gedurende 15 seconden tussen elke tijd van ultrasoonapparaat. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat u twee microliter stopoplossing aan de lysisreactie toevoegt en meng deze door zachtjes te tikken.

Incubeer de reactie gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en zet de buis vervolgens op ijs. Om RNA uit het wormweefsel te extraheren, pluk je ongeveer 20 wormen uit het bacteriële gazon en plaats je ze in een verse ongezaaide NGM-plaat om de bacteriën uit de wormen te verwijderen. Breng 20 wormen met zo min mogelijk bacteriën over naar een horlogeglas met 500 microliter M9-oplossing met vier micromolaire levamisol.

Wanneer de wormen zijn geïmmobiliseerd, ontleedt u de kiembaan of darm met behulp van een naald van 25 gauge die aan de spuit van één milliliter kan worden bevestigd. Breng met behulp van een geautoclaveerde glazen pipet de ontleedde weefsels over in de PCR-buis en laat de buis gedurende twee minuten op ijs zakken, waardoor de afzetting van het materiaal aan de onderkant mogelijk wordt. Verwijder het supernatant uit de PCR-buis voordat u 20 microliter uiteindelijke lysisoplossing toevoegt en meng het goed door erop te tikken.

Nadat u de lysisreactie gedurende vijf minuten hebt geïncubeerd, voegt u twee microliter stopoplossing toe en tikt u meerdere keren op de buis. Incubeer de buis gedurende twee minuten voordat u doorgaat met de omgekeerde transcriptie. In de validatiestudie vertoonde RNA geëxtraheerd uit een grote populatie en een paar wormen een vergelijkbare inductie van de neuropeptideverwerkingsgenen, egl-3 en egl-21.

Het suggereert dat de RNA-extractie uit een paar wormen een geldig alternatief kan zijn voor standaard CDNA-synthesetechnieken uit grote populaties. In de ontleedde darm van de lipl-4 transgene wormen, aangevuld met dihomo-gamma-linoleenzuur, of DGLA, werden de neuronale neuropeptideverwerkingsgenen niet geïnduceerd. DGLA-suppletie bij verschillende concentraties redde levensduurverlenging in de wormen bij fat-3 knockdown.

Wormen met lipidensuppletie kunnen ook worden verwerkt voor RNA-sequencing, proteomics, metabolomics en gedragsstudies om aanvullende fenotypen onder deze specifieke omstandigheden te identificeren. Deze methodologie kan worden toegepast op verouderingsonderzoek, lipidenbiologie en elk ander onderzoeksgebied dat gericht is op het vaststellen van een relatie tussen een bepaald fenotype en een voedingsfactor of metaboliet.