Author Produced

Brug plusTipTracker Software til måling mikrotubulære Dynamics i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Matlab-baseret, open source software-pakke, plusTipTracker, kan bruges til at analysere billede serie af fluorescens-mærket + tips til at kvantificere mikrotubuli dynamikken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. J. Vis. Exp. (91), e52138, doi:10.3791/52138 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikrotubuli (MT) plus-end-tracking proteiner (+ tips) lokalisere til de voksende plus-ender MTS og regulere MT dynamik 1,2. En af de mest kendte og udbredte udnyttede + tips til at analysere MT dynamik er slutningen protein, EB1, som binder alle voksende MT plus-ender, og dermed er en markør for MT polymerisation 1. Mange studier af EB1 adfærd inden vækstkegler har brugt tidskrævende og forudindtagede computer-assisteret, hånd-tracking metoder til at analysere de enkelte MTS 1-3. Vores tilgang er at kvantificere de globale parametre for MT dynamik ved hjælp af software-pakke, plusTipTracker 4, efter købet af høj opløsning, levende billeder af tagget EB1 i dyrkede embryonale vækstkegler 5. Denne software er en Matlab-baseret, open source, brugervenlig pakke, der kombinerer automatiseret detektion, sporing, visualisering og analyse af film af fluorescens-mærket + tips. Her præsenterer vi en protokol for at bruge plusTipTracker til analyse af fluorescens-mærket + TIP kometer i dyrkede Xenopus laevis vækstkegler. Imidlertid kan denne software også bruges til at karakterisere MT dynamikken i forskellige celletyper 6-8.

Introduction

Målet med denne metode er at få kvantitative oplysninger om mikrotubuli (MT) plus-end-sporing protein (+ tip) dynamik i levende vækstkegler. MT + Drikkepenge er en gruppe af proteiner, der lokaliserer til plus-ender MTS 9,10. De udfører en række funktioner til at regulere parametre for MT dynamisk ustabilitet 11, herunder satserne for polymerisation, katastrofe, og redning. En godt brugt metode til at analysere MT dynamik er at spore opførsel + TIP EB1, som binder specifikt til voksende MT plus-ender 1,12. EB1 er kendt for at rekruttere flere andre proteiner til voksende MT plus-ender 13,14, og er for nylig blevet etableret som en MT modning faktor 15, fremme både MT vækst og katastrofe frekvens 15,16.

Mange studier af MT dynamik inden vækstkegler har udnyttet hånd-tracking metoder til at måle ændringer i EB1-GFP-dynamik over tid 1-3, som EB1 localizatipå MT plus-ender kan anvendes som en markør for MT polymerisation. En vigtig fordel for behandlingen EB1-GFP-kometer som en proxy for MT vækst er, at der kan måles MT dynamik selv i områder af væsentlig MT overlapning. Mens metoden af hånd-tracking EB1-GFP-kometer har givet en nyttig indsigt i MT adfærdsmønstre 1-3, det er tidskrævende og kan være tendentiøst. Derudover, som afvigende vækst kegle adfærd er sandsynligvis et resultat af meget små forskydninger i cytoskeletale dynamik, analysere kun en lille delmængde af MTS (normalt nødvendigt, når hånd-sporing) kan gå glip af vigtige oplysninger.

Således måler vi globale MT dynamics parametre ved hjælp af softwarepakken, plusTipTracker 4, efter opkøbet af høj opløsning, levende billeder af tagget EB1 i dyrkede embryonale vækstkegler 5. Denne software er udviklet i Danuser Lab, har været anvendt i flere studier, der kendetegner MT dynamik i forskellige celletyper 6-8. Det er en open-source, osER børn, MATLAB-baserede pakke, der inkluderer automatiseret detektion, sporing, visualisering og analyse for film af fluorescens-mærket + tips. En lang liste af specifikke parametre for MT dynamik beregnes ved denne software (se reference 4 for detaljer), men til analyse af MT dynamik i vækstkegler, de mest nyttige parametre er MT vækstsporet hastighed (i mikron / minut), vækstsporet levetid (i sekunder), og væksten banelængde (i mikrometer). Softwaren kan downloades direkte fra Danuser Lab hjemmeside (under "Software"). Mens Danuser Lab understøtter i øjeblikket en nyere interface til + TIP sporing analyse, som er indarbejdet i en software-pakke kaldet U-bane 2.0, den oprindelige, stand-alone-software vil forblive tilgængelige. De underliggende algoritmer mellem de to programmer er de samme (i det mindste fra 2014), med kun en forskel på grænsefladen og analyse udgange. For nybegynderen med lidt Matlab og / eller beregningsmæssige analyse erfaning, plusTipTracker har flere brugervenlige funktioner, herunder automatiserede statistiske parameter udgange.

Her beskriver vi de skridt til at analysere billeder af EB1-GFP-dynamik i dyrkede Xenopus laevis vækstkegler. Denne protokol blev udnyttet i et nyligt papir undersøger MT dynamik 17. Se også Lowery et al. 2012 5 for detaljerede anvisninger vedrørende dyrkning vækstkegler udtrykker EB1-GFP. Mens dette dokument primært fokuseret på at undersøge EB1-GFP-dynamik i vækstkegler, kan den samme protokol bruges til andre celletyper 17. For alle celletyper, skal tidsintervallet mellem frames være mellem 0,5-2 sek til optimal + TIP sporing. Et tidsinterval på op til 4 sekunder mellem rammer er muligt, men denne øgede interval tid resulterer i yderligere sporingsfejl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol og video er beregnet til at tjene som en følgesvend til den oprindelige papir, der beskriver softwarepakken nærmere 4, samt den tekniske rapport, der kommer med software download på Danuser Labs websted. Læserne opfordres til at gennemgå disse dokumenter omhyggeligt, hvis der er yderligere spørgsmål vedrørende brugen af ​​softwaren.

1. Forud for billedanalyse

  1. Konverter hver time-lapse film til en sekvens af TIFF (Tagged Image File Format) billedfiler. Hvis der er flere vækstkegler / celler i en given film til første afgrøde hver vækst kegle / celle skabe sit eget billede sekvens.
    Bemærk: Dette er ikke nødvendigt, da der kan vælges enkelte regioner-af-interesse (ROI) inden plusTipTracker. Men ved hjælp af mindre billedets dimensioner øger hastigheden af ​​den beregningsmæssige behandling, så dette trin anbefales, hvis der er en betydelig blank plads i billedet.
  2. Gem hvert TIFF serie i sin egenmappe kaldet "Billeder" i en sti, Matlab er indstillet til adgang (bemærk, at "billeder" er case-sensitive). For at tilføje en ny sti, navigere til den relevante fil mappe i "Aktuel mappe" vinduet, skal du højreklikke på ikonet biblioteket, og vælg "Føj til Path - valgte mapper og undermapper". Det er vigtigt, at plusTipTracker softwaren mappen føjes til stien, så godt.

2. plusTipGetTracks

Bemærk: Det første skridt i billede analyse er at registrere de EB1-GFP kometer, knytte de kometer i spor, og fastlægge de parametre af mikrotubuli dynamik. Dette opnås med kommandoen "plusTipGetTracks" 4.

  1. Til at begynde, offentlig MATLAB programmet og skrive "plusTipGetTracks" i kommando-vinduet. Dette vil medføre et nyt dialogboks vises.
  2. Klik på "Set Up Nye projekter" og vælg en (eller more) i forrige TIFF-billede serie ved at vælge de passende "billeder" mappe (eller mapper, der indeholder "billeder" mapper). Ved afslutningen af ​​dette trin, en fil mappe (roi_1) vil blive oprettet (i samme mappe, der indeholder "billeder"), som vil indeholde de fremtidige datafiler. Bemærk: "Opsætning Nye projekter" skridt kan være afsluttet i god tid, i løbet af en separat session.
  3. Et nyt vindue vises: "Vælg en polygon, skal du højreklikke på sidste punkt, og klik på 'Opret Mask«. Klik på "OK". Det første billede af det valgte billede serien vil blive vist. Brug musen til at klikke og oprette en polygon, der omfatter hele den kegle vækst. Dobbeltklik på musen for at lukke polygonen.
  4. Når polygonen er blevet lukket, vil en dialogboks vises: "Ønsker du at vælge en anden ROI?" Hvis billedet har en anden vækst kegle til at analysere, vælge "Ja"; ellers sudvalgte "Nej".
  5. Vælg de projekter, der omgående vil blive analyseret. Klik på "Vælg Projekter", og vælg mappen (roi_X) at analysere.
  6. En listSelectGUI vises. Vælg (r) fra venstre side af skærmen projektet og flytte dem over til højre side af skærmen. Klik på "OK". Vælg en placering for at gemme listen projektet, og klik på "Gem".
  7. Vælg "Detection", "Tracking" og "Post-Processing". Når disse valg er foretaget, vil den højre side af dialogboksen bliver konfigureres. Konfigurere hver indstilling.
    1. Disse parametre anvendes til at forbinde detekterede kometer i MT spor. Informationer for valget af disse kontrolparametre til sporing er medtaget på side 9-10 af den tekniske rapport PDF som følger med softwarepakken downloades; Læs denne rapport forsigtigt, hvis der opstår problemer. Med henblik på at spore EB1-GFP-kometer i Xenopos laevis vækstkegler Brug følgende Tracking-indstillinger: Søgeradius Range (pixels) 5-12, Minimum Sub-banelængde (rammer) 3; Max Gap Længde (rammer) 8; Max krympningsfaktoren 0.8, Max vinkel Fremad 50, Max vinkel Baglæns 10 Svingninger Radius 2.5. Disse indstillinger er vist i figur 1.

    Bemærk: Max Svind Factor er indstillet på at reducere antallet af "tilbagestående huller" opdaget, som "tilbagestående huller" ikke er nyttigt at analysere i forbindelse med vækstkegler grund af de overfyldte betingelser og sandsynlige fejl i track bindinger. Derudover er både Max fremadrettet vinkel samt Udsving Radius sat forholdsvis højt, da væksten kegle MTS udviser små hyppige translokationer foruden vækster og shrinkages og øge disse kontrolforanstaltninger indstillinger giver mulighed for denne øgede bevægelse under sammenkædning trin.
    1. Udfyld efterbehandlingen indstillinger afhængigt af den ønskede specifikke indstillinger billede erhvervelse.
    </ Li>
  8. Når indstillingerne er konfigureret, skal du klikke på "Start". Softwaren vil køre alt efter indstillinger er blevet valgt. Dette kan tage minutter til timer, afhængigt af antallet af udvalgte projekter og deres størrelser. Kommandovinduet viser den forventede resterende tid for hver funktion. Når plusTipGetTracks trin er afsluttet, vil Kommando vinduesudstilling "Færdig!"
    Bemærk: En lang liste over specifikke parametre for MT dynamik er nu blevet beregnet af denne software (se reference 4 for detaljer), men til analyse af MT dynamik i vækstkegler, de mest nyttige parametre til at undersøge, er MT vækstsporet hastighed (i mikron / minut), vækstsporet levetid (i sekunder), og væksten banelængde (i mikrometer).

3. plusTipSeeTracks

Bemærk: Nu, er blevet defineret mikrotubuli spor, er funktionen "plustipSeeTracks" bruges til spor visualisering 4. Denne funktionkan give flere udgange til visualisering, herunder rumlige MT dynamik kort og hastighed film, men her er fokus udelukkende på at bruge "Spor film" for at vise MT spor oven på væksten kegle billeder. Mens plusTipGetTracks kan analysere flere film ad gangen, kan plusTipSeeTracks kun analysere én film ad gangen.

  1. Skriv "plusTipSeeTracks" i kommando-vinduet.
  2. Når dialogboksen belastninger, klik på "Select Project". Vælg den overordnede mappe, der indeholder projektet til at visualisere og klik på "Vælg mappe". Et nyt vindue vises: "Vælg det projekt, du ønsker at visualisere". Vælg den fil, der skal visualisere og klik på "OK".
  3. Næste, klik på "Vælg Gemt ROI". Naviger til den samme roi_X mappe som er valgt i det foregående trin, og vælg filen "roiYX".
  4. Klik på "Vælg Output Directory" til at betegne wher MATLAB vil gemme track visualiserings-filer. Bemærk: Vi anbefaler at bruge den samme mappe, der indeholder resten af ​​dataene.
  5. Vælg "Gør Track Movie", og en skærm vises viser alle sporene plusTipGetTracks beregnet ud fra + tip kometer. Dette trin sparer serie den sporede tid i en film format i filen "allTracks_X_X_X". Der er en mulighed for at gemme filmen som en AVI, ellers standardformatet er som en Quicktime.mov fil.

4. plusTipGroupAnalysis

Bemærk: Denne sidste funktion bruges til at oprette grupper af film til analyse og sammenligning af deres Sporparametre MT.

  1. Skriv "plusTipGroupAnalysis" i kommando-vinduet. At vælge de grupper, manuelt at sammenligne, første de-vælge "Auto gruppe fra hierarkiet". Klik derefter på "Vælg projekter". Gå til den overordnede biblioteker, der indeholder alle de roi_X mapperat analysere.
  2. En listSelectGUI vises. Marker alle de projekter, der skal medtages i de grupper, fra venstre side af skærmen og flytte dem over til højre side af skærmen. Klik på "OK". Vælg en placering for at gemme listen projektet, og klik på "Gem".
  3. Et vindue vises: "Vælg første gruppe fra listen". Klik på "OK". Den listSelectGUI vises vinduet igen. Denne gang skal du vælge kun de filer, der svarer til den første gruppe, der skal samles sammen. Klik på "OK".
  4. Derefter skal du indtaste gruppens navn, og klik på "OK". Et vindue vises: "Vælg en anden gruppe?" Svar overensstemmelse hermed og fortsætte vælge grupper. Et vindue vises: "Vælg en placering for at gemme din gruppe listen". Naviger til den placering, og klik på "Gem".
  5. Klik på "Vælg Output Directory" for at vælge, hvor output mapper vil væregemt.
  6. Vælg hvilken type gruppe analyse til at gennemføre - om MT sporene bør samles for hver gruppe eller per celle analyse skal udføres. De anbefalede statistiske test allerede angivet. Hvis du vil medtage alle spor i analysen, fravælg "Fjern spor i begyndelsen / slutningen af ​​filmen". Ellers har denne boks valgt fjerner MT vækst spor, der er i proces, da filmen begynder eller slutter.
  7. Efter gruppen Analyse valget er foretaget, skal du vælge "Sammenlign grupper".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af denne software, som beskrevet her, vil give flere filer af information, der kvantificerer + tip dynamik i levende celler.

De funktionelle plusTipGetTracks identificerer spor (ved hjælp af eksempler på forskellige indstillinger er vist i figur 1), og derefter giver parametre vedrørende + tip spor. Hvis du vil se de oplysninger, som softwaren har opnået, gå ind i roi_X bibliotek, der blev oprettet i trin 2.2. Mappen "feat" indeholder "overlayImages", som er en serie af billeder, der viser de fundne kometer. Undersøge disse billeder ved hjælp af billedanalyse software kan påvise rigtigheden af ​​komet detektion. Den "meta" mappe indeholder også detaljerede oplysninger om + tip komet statistik, herunder "projData" fil, såvel som den "statistik" fil. For at se "Stats" fil, skal du trække det ind i en åben regneark af et regnearksprogram. Denne fil indeholder Beregnd mikrotubuli parametre for hver film (Figur 2). Som nævnt ovenfor er en lang liste af specifikke parametre for MT dynamik beregnet af denne software (se reference 4 for detaljer), herunder MT vækstsporet hastighed (i mikron / minut), vækstsporet levetid (i sekunder), og væksten banelængde (i mikrometer).

De funktionelle plusTipSeeTracks gemmer en film af de sporede kometer, som kan efterprøves ved at åbne filen "allTracks_X_X_X" (Figur 3).

Funktionen plusTipGroupAnalysis kombinerer flere individuelle datasæt i grupper og skaber mapper (opkaldt Percell eller pooledData afhængigt af, hvilken analyse der er valgt), der indeholder gruppe parameterdata, herunder histogram plots og regneark til sammenligning af grupper og individuelle parametre inden for hver gruppe (figur 4).

Figur 1 Figur 1. PlusTipGetTracks indstillinger, der bruges til EB1-GFP-kometer i Xenopus laevis vækstkegler. Denne figur viser de specifikke indstillinger for "Detection", "Tracking" og "Post-Processing" skridt, der kan anvendes til analyse af EB1-GFP kometer i Xenopus laevis vækstkegler. Den plusTipParamSweepGUI værktøj til rådighed inden for plusTipTracker pakke, kan anvendes til at optimere sporing indstillinger for andre modelorganismer og / eller celletyper 7.

Figur 2
Figur 2. Skærmbillede af MT parametre opnået fra plusTipGetTracks analyse. Den "meta" mappe, der er skabt ved at køre plusTipGetTracks, indeholder oplysninger om + TIP COMET statistik. Ved at trække på "Stats" fil ind i et regneark, kan mikrotubuli dynamics parametre undersøges.

Figur 3
Figur 3. Skærmbillede af MT spor film opnået fra plusTipSeeTracks analyse. PlusTipSeeTracks ikke kun mulighed for mikrotubuli spor visualisering, men fungerer også som en verifikation værktøj ved at lade brugeren at se validiteten af de data, der er erhvervet fra plusTipGetTracks.

Figur 4
Figur 4. Skærmbillede af MT parametre opnået fra plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis giver brugeren en enkel metode til at sammenligne grupper og individuelle parametre between inden for hver gruppe ved at kombinere flere individuelle datasæt og generering af statistiske output, som kan undersøges i et regnearksprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PlusTipTracker giver en enkel, grafisk brugergrænseflade til hurtigt og automatisk at registrere næsten alle synlige EB1-GFP-kometer i en celle eller vækst kegle, knytte de kometer i spor, og beregne MT parametre. Andre publikationer har rapporteret design af lignende typer af software (for eksempel Marx et al. Også brugt kvantitativ analyse af taggede EB1 dynamik i vækstkegler 18). Men synes denne software til at være enestående i sin lette adgang, som det frit kan downloades fra hjemmesiden for Danuser Lab, som har specialiseret sig i at designe open source, turn-key software nyttigt at cellen biologiske samfund. Mens der kræves adgang til Matlab, man ikke behøver at være fuldt fortrolige med denne computer ansøgning for at udnytte softwaren. Men der er et par punkter, der skal løses for brugervenlighed.

Først og fremmest en af ​​de mest almindelige problemer, der opstår, når du bruger software og edb-applikation for første gang er relateret til stien. Hvis denne fejl opstår (med prompt "Fejl ved hjælp af cd -. Argumentet skal indeholde en streng Fejl i formatPath ..."), så er den nemmeste løsning at sikre, at plusTipTracker software samt den mappe med alle de "billeder" undermapper, er begge i den samme "Matlab" filsti. Det er bedst hvis disse ikke er i "Program Files" mappen, som det er blevet foreslået, at pladsen i "Program Files" navn kan være et problem. Relateret til dette, er det vigtigt at bemærke, at plusTipTracker gemmer filen sti, der blev anvendt, da først beregne plusTipGetTracks analyse, og som sådan skal denne fil sti opretholdes, når disse data tilgås og ansat af en anden komponent af softwaren. Funktionerne plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks og plusTipGroupAnalysis alle bruger den originale gemte fil sti, og dermed forsøger at Calle disse funktioner for en given film, efter at have flyttet filerne til en anden vej, vil resultere i en fejl.

En anden almindelig fejl at forekomme under analyse er, når sporing mislykkes under plusTipGetTracks trin. Dette vil ske, hvis en ramme i billedet indeholder ingen detekterbare kometer. Dette vil helt standse analyse og ingen efterbehandling vil forekomme. En nem løsning for at omgå dette problem og gøre det muligt for analyse for at gå videre, er at skabe en mock komet på billedet i et område, hvor det ikke vil være forkert knyttet til nogen konkrete spor. Dette vil ikke påvirke de endelige Sporparametre som enhver komet, der ikke findes i et minimum antal på hinanden følgende rammer vil blive filtreret ud af den endelige analyse.

Et andet problem, der kan opstå, er defekt komet detektion. Dette kan normalt fastsættes ved forbedring af områdets-of-interesse valg i trin 2.3. Det er vigtigt at trække regionen af ​​interesse tæt omkring cellen og ikke at drage awer nødvendigt Ider region end. Softwaren bruger denne region til at bestemme baggrunden anvendes under komet detektion. Hvis komet opdagelse er stadig ikke optimal med standardindstillingerne, kan indstillingerne justeres i plusTipGetTracks vinduet (under trin 2.7).

Efter enhver analyse, er det vigtigt at validere de automatiske spor bindinger ved øjet, hjælp plusTipSeeTracks. Skal måske ændres for at reducere antallet af falsk positive eller falsk negative komet bindinger Sporing indstillinger. Se den oprindelige plusTipTracker dokumentation 4, samt den tekniske rapport PDF, der følger med at downloade software for at få oplysninger om at optimere indstillingerne. Udførelsen af denne software i forhold til hånd-sporing er tidligere blevet testet i ikke-neuronale celler 4. Vækstkegler udgøre en lidt anden udfordring, men som vækst kegle MTS udviser hyppige translokationer i alle retninger 17, foruden MT vækst og krympning. En udstee, der ikke blev anset for at være et stort problem, er, om de tætpakkede MTS i vækstkegler udgøre sporing vanskeligheder 17. Da kun en delmængde af MT'er er i voksende fase med EB1-GFP på enderne, løse og sporing af individuelle EB1-GFP kometer ikke var problematisk. Det bør imidlertid bemærkes, at disse tidligere undersøgelser anvendt Xenopus laevis vækstkegler, som specifikt blev valgt på grund af deres relativt store vækst kegle størrelse (ca. 10 um), i forhold til andre hvirveldyr vækstkegler. Ved hjælp af disse større vækstkegler giver mulighed for mere præcis EB1-GFP komet analyse.

At vurdere anvendeligheden og nøjagtigheden af denne software til at analysere EB1-GFP-spor i Xenopus laevis vækstkegler sammenlignet vi erfaring med at bruge plusTipTracker med hånd-sporing af en identisk dataserier (data ikke vist). Den tid, det tog at hånd-track EB1-GFP-kometer i en gennemsnitlig vækst kegle af 39 komet spor (i en 1 minuts tid-lapse series, med 2 sekunder mellem hver ramme) var over to timer, i forhold til to minutter med softwaren. De parametre, der er opnået med de to metoder var ens for MT væksthastighed (7,4 mikrometer pr minut til automatiseret sporing versus 7,0 mikrometer i minuttet for hånd-sporing). Men for vækst levetid og længde, software analyse fører til betydeligt kortere spor (med omkring halvdelen af ​​den tid og afstand). Dette skyldes vækst spor bliver delt af softwaren, hvis en komet går ind og ud af fokus over tid. Mens det menneskelige øje kan let identificere, at det er den samme komet softwaren ikke. Dette spørgsmål er ikke problematisk men hvis man bruger software for at sammenligne flere forhold. Da identiske sporingsparametre bruges til alle forhold (og forudsat at kometer gå ind og ud af fokus i samme tempo i flere forhold), så de relative levetider og længder er stadig ret brugbare målinger til sammenligning. Med hensyn til automatiseret analyse fejl rottees, disse afhænger i høj grad af kvaliteten af ​​billederne. I høje signal-til-støj-film, procenten af ​​misjoined eller forkerte spor er i det indre cifre. Selv i lavere kvalitet film (hvor de enkelte kometer er stadig tydeligt med det blotte øje, men baggrundsstøjen er større), er stadig lav nok (5-15%), at den betydelige tid, der spares ved hjælp af softwaren er værd at fejlprocenten omkostninger i fejl. Dette er især tilfældet, når analyserer hundredvis af vækstkegler (60-8 vækstkegler pr betingelse blev analyseret i en tidligere undersøgelse 17).

Det er vigtigt at bemærke, at denne software er beregnet til detektion + tip kometer, der kun binder til voksende MT ender, såsom EB1-GFP. Da forbindelsesmekanismerne og sporingsalgoritmerne forventer, at kometer kun eksisterer på polymerisere MTS, ved hjælp af denne software til at analysere dynamikken i en fluorescens-mærket + tip, som binder til faldende MT ender i tillæg til voksende ender vil føre til urigtige oplysningerom beregnede MT vækst hastigheder.

Et af de unikke funktioner i denne software i forhold til andre single-partikel-tracking software, er, at det tager højde for kendte MT adfærd til at beregne ikke blot polymerisationsmetoder parametre, men også krympeegenskaber parametre. Det gør den ved at forbinde en EB1-GFP komet, der er forsvundet med én, der har nydannede direkte bag den i samme bane (dette kaldes en backgap eller bgap spor). Mens denne algoritme fungerer godt for nogle celletyper, såsom HeLa-celler 4, er det en mindre effektiv funktion, når analyse MT dynamik i vækstkegler. Dette skyldes, at MT spor ofte følger hinanden langs nøjagtig samme stier i vækstkegler (ofte følgende langs F-actin bundter), og så er det normalt umuligt at sige, om bgap bindinger er korrekte. Af denne grund, er det ikke anbefales at udnytte bgap dataudgangssignaler i vækst kegler.

Trods disse mindre advarsler og spørgsmålsom skal tages i betragtning, når du bruger plusTipTracker (og de fleste enhver automatiseret billedbehandling program), kan denne software være et meget nyttigt værktøj til at analysere tusindvis af EB1-GFP-kometer i en forholdsvis kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
plusTipTracker software Danuser Lab http://lccb.hms.harvard.edu/software.html This software may be hosted by another website in the future.  If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site.
MATLAB software Mathworks http://www.mathworks.com/products/matlab/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 913-926 (2004).
  3. Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
  4. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
  5. Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
  6. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
  7. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
  8. Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
  9. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
  10. Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
  11. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  12. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
  13. Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
  14. Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
  15. Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
  16. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
  17. Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
  18. Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics