Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison
* These authors contributed equally
Bioengineering

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

La capacità delle superfici PEG-innestate per visualizzare leganti biochimici un legame covalente al tempo stesso mantenendo intrinseche proprietà non-fouling li rendono la scelta ideale per gli ambienti di microscala ingegneria personalizzate su substrati di coltura 1,2,3 fare. Le interazioni biospecifici mediate da ligando coniugata spazzole PEG consente l'analisi riduzionistica degli effetti di segnali biochimici si trovano all'interno del complesso in microambienti tessuto vivo su fenotipi di cellule singole. Inoltre, chimiche "click" bio-ortogonale possono essere utilizzati per facilitare l'immobilizzazione direzionale di ligandi in modo che siano presentati in conformazioni native 4-6. Così, microscala patterning spaziale di PEG spazzole è uno strumento versatile per creare design in nicchie in vitro per studiare la segnalazione cellulare indotta da stimoli biochimici immobilizzati 6,7.

Un metodo comune per la generazione di modelli spaziali di cu biochimicaes comporta stampa microcontact (μCP) substrati d'oro rivestite con modelli di PEG alkanethiols coniugati. Poi, i monostrati auto-assemblati micropatterned (SAM) di alkanethiols PEG-ylated limita adsorbimento fisico di molecole biochimiche, ad esempio, le proteine, solo per le regioni non fantasia del substrato 8,9. Tuttavia, i SAM generati da questa tecnica sono sensibili all'ossidazione a lungo termine mezzi di coltura cellulare. Così, μCP'd alkanethiol SAM sono spesso ulteriormente innestate con PEG spazzole polimero con trasferimento atomo-superficie avviato polimerizzazione radicalica (SI-ATRP) per aumentare non sporcare la stabilità della regione 10. In particolare, μCP della iniziatore di polimerizzazione alkanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutirrato, su superfici d'oro rivestite seguite da SI-ATRP di poli (etilene glicole) metacrilato metil etere (PEGMEMA) monomeri genera superfici con micropatterned a lungo termine, stabile, e non fouling PEG spazzole. Inoltre, questi sono in grado di essere ulteriormente modificato per presentare frazioni chimiche diverse 11.

Approfittando di questa proprietà, Sha et. al. messo a punto un metodo per progettare substrati di coltura con spazzole PEGMEMA più componenti presentano ortogonali chimiche "clic". In questo metodo, si avvalgono di una serie di passaggi μCP / SI-ATRP intervallati da sodio azide sequenziale, etanolammina, e propargylamine sostituzioni nucleofile per creare substrati di coltura che presentano modelli di microscala di più ligandi immobilizzati 6. Mentre la prospettiva di utilizzare tali sostanze chimiche in collegamento con μCP manuale per progettare nuovi substrati di coltura è immenso, è limitata dalla precisione e accuratezza con cui più passaggi μCP possono essere allineate su un unico substrato. Un alto livello di precisione e accuratezza sarebbe necessario per la fabbricazione riproducibile complesso in nicchie vitro utilizzando queste tecniche versatili.

e_content "> Per affrontare questa limitazione, sono stati generati diversi sistemi μCP automatici e semi-automatici. Chakra et. al., messo a punto un sistema di μCP in cui timbri personalizzati sono posti su un sistema ferroviario e messi in contatto conforme con scivoli d'oro rivestite con un attuatore pneumatico controllato da computer. Tuttavia, questo metodo richiede la realizzazione precisa dei disegni provvisorie personalizzati e riporta una precisione di 10 micron con nessuna relazione della precisione ottenuta durante l'esecuzione multipla μCP passaggi 12. Più recentemente, un metodo che utilizza un sistema di accoppiamento cinematico integrato precisione sotto riportato 1 micron utilizzando un singolo modello, ma non erano in grado di allineare con precisione più pattern a causa della mancanza di un controllo preciso delle caratteristiche provvisorie da stampo per stampo 13. Inoltre, entrambi i metodi precedenti richiedono il substrato a rimanere fisso tra passi patterning , con ciò limitando sensibilmente la diversità dei chimici la modifica della superficie che possono essereutilizzata. Qui, descriviamo un sistema R-μCP automatizzato in grado di allineamento accurato e preciso di molteplici passaggi μCP pur consentendo la massima flessibilità nella progettazione e fabbricazione di bollo. Inoltre, i substrati modellati possono essere ripetutamente rimossi dal sistema tra frantumi, permettendo così l'uso di diverse sostanze chimiche modifica substrato, incluse sostituzioni nucleofile sequenziali. Substrati ingegnerizzati l'utilizzo di tali sostanze chimiche sono state utilizzate per colture cellulari in precedenza sia da noi 6,14 e altri 7. Così, abbiamo unito R-μCP e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali per sviluppare un metodo per la produzione scalabile di substrati di coltura con segnali biochimici complessi e micropatterned.

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Protocol

1. Generazione elastomerici Francobolli

  1. Per generare padroni di silicio del timbro PDMS, di design dispongono di modelli del fotomaschere utilizzando il software computer-aided design.
    1. Progettare il primo modello come 20 x 20 serie di corone circolari con 300 micron di diametro interno (ID) e 600 micron OD con 1.200 micron da centro a centro spaziatura.
    2. Progettare il secondo pattern come 20 x 20 serie di corone circolari con ID 600 micron e 900 micron OD con 1.200 micron da centro a centro di spaziatura.
    3. Inoltre, mettere 1 x 1 mm 2 tacche di riferimento quadrati a tutti i quattro angoli di ogni disegno di matrice distanziati 1.200 micron da centro a centro del modello di angolo in un angolo di 45 °.
    4. Realizzare i maestri di silicio per l'uso in questo esperimento con 1: 1 proporzioni, correlando ad una profondità di 300 micron funzione utilizzando tecniche di litografia norme definite altrove 15 o in collaborazione con una fonderia microfluidica.
      NOTA: Caratteristica Profondità inferiore a 100 micron possono portare a deformazioni anormali di francobolli prima del contatto con le superfici del substrato.
      NOTA: Questo protocollo inizia con avere maestri di silicio già ottenuti con i modelli descritti di fotoresist, che richiede attrezzature specializzate e camere pulite per creare. E 'meglio consultare un costruttore o nucleo possibilità di creare questi maestri fantasia.
  2. Maestri di silicio silanizzare O / N mediante incubazione con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapore triclorosilano.
    NOTA: silano vapore è altamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa.
  3. Creare repliche inversa dei maestri silicio curando un rapporto 10: 1 di PDMS pre-polimero e PDMS induritore in cima maestri silicio silanizzato in una capsula di Petri O / N a 60 ° C.
  4. Rimuovere le PDMS francobolli dai maestri di silicio, e legare i timbri acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) supporti o qualsiasi altro materiale rigidos utilizzo di colla.
    NOTA: il materiale di scelta non deve essere trasparente o biocompatibile. Tuttavia, si deve fornire una superficie piana per l'interfaccia con l'attrezzatura robotizzata e maggiore rigidità rispetto PDMS.

2. Coprioggetto Preparazione

  1. Coprioggetto microscopio risciacquo (24 x 50 mm # 1) in toluene, metanolo e ultrasuoni in acetone per 1 min prima del risciacquo con etanolo ed essiccamento sotto lieve corrente di azoto.
    NOTA: Maneggiare toluene e acetone solo in una cappa.
  2. Coprioggetto cappotto con ~ 3.5 nm titanio (Ti), seguita da 18,0 nm oro (Au) con un mirato evaporatore a fascio elettronico.
    NOTA: Questa procedura è compatibile con una varietà di substrati oro rivestite compreso silicio e polistirene. Mentre è possibile generare questi in loco, substrati oro rivestite sono disponibili tramite fornitori commerciali anche.
    NOTA: i livelli di Ti deve essere di almeno 3 nm di spessore, mentre Au strati su supporti dovrebbe essere unt almeno 5 nm di spessore e può variare fino a 1 mm di spessore a seconda delle proprietà ottiche ideali del substrato finale 16,17. Substrati non sono tenuti ad essere otticamente trasparente per la fabbricazione; tuttavia, facilita l'analisi microscopica di substrati fabbricati.
  3. Risciacquare Coprioggetto oro rivestite con etanolo e secco sotto azoto delicato immediatamente prima dell'uso.

3. R-μCP di anello esterno

  1. Prima di R-μCP con il sistema selettivo conforme braccio del robot articolato (SCARA), calibrare gli effettori degli strumenti robotici e sistemi dual telecamere di accompagnamento utilizzando il software del sistema.
    NOTA: Questi strumenti sono raffigurati nella figura 1.

Figura 1
Figura 1. R- μCP sistema e Braccio robotico Tooling. (A) vista su larga scala del sistema di R-μCP con tutte le attrezzature e arredi, (a) mandrino a vuoto, (b) bagno reagente, (c) fotocamera rivolta verso il basso, (d) apparecchio timbro nidificazione, (e) robotica utensile. (B) Attrezzature per robotica braccio raffigurante (f), strumento di incisione a punta di diamante e (g) strumento pneumatiche aspiranti in possesso di un (h) ABS-backed PDMS bollo.

  1. Inserire manualmente un timbro PDMS con 600 ID micron e 900 micron OD sporgente annuli a faccia in giù nel dispositivo timbro di nidificazione. Inserire manualmente un coverslide oro rivestite appena pulita sopra il mandrino a depressione, mostrata in Figura 1A, e immobilizzarlo con il laboratorio vuoto collegata.
  2. Utilizzando i controlli robot, allineare la fotocamera rivolta verso il basso sopra il punto centrale della coverslide rivestita d'oro, come in Figura 2A.
    NOTA: Questo punto può essere inizialmente definita mediante ispezione visiva e non richiede grande precisione, come il timbro PDMS è molto larger quanto la slitta rivestita d'oro.
  3. Istruire il braccio robotico per incidere quattro riferimento "X" marchi di cui i vertici di un quadrato di dimensioni 3,8 millimetri di 3,8 millimetri centrati sul coverslide oro rivestite utilizzando lo strumento di incisione a punta di diamante attaccato al braccio robotico. (Illustrato nella figura 2B; processo automatizzato)
    NOTA: In questo modo tutti e quattro i punti di riferimento sono all'interno di un quadro visivo della telecamera rivolta verso il basso.
  4. Utilizzando i robot attrezzature pneumatiche aspiranti, pick-up e tenere premuto il PDMS Timbro 1 mm sopra il dispositivo timbro nidificazione come in Figura 2C. (Processo automatizzato)
  5. Utilizzando la fotocamera rivolta verso l'alto e l'anello illuminazione a LED nella Figura 2D ed E, visualizza indici di riferimento quadrata del timbro e identificarli con il software della fotocamera 10 volte per determinare X medio del timbro, Y e offset angolare dal centro della asse robot utensili. (Processo automatizzato)
  6. Come in NOTA: un calcolo interno è svolto dal software del sistema robotico per allineare con precisione la X del coprioggetto, Y località del centro e offset angolari nelle future fasi R-μCP di timbro e.
  7. 3.8) Posizionare il timbro in un bagno di alkanethiol iniziatore ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutirrato (2 mM in etanolo), come illustrato nella Figura 2F. (Processo automatizzato)
  8. Rimuovere il timbro dalla soluzione alkanethiol e porlo sul flusso di azoto pressurizzato a 0,48 bar (5 psi) per far evaporare l'etanolo come in Figura 2G. Dopo 1 min aumentare la pressione del flusso di azoto è di 1,03 bar (15 psi) per garantire la secchezza uniforme. (Processo automatizzato)
    NOTA: asciugatura incompleta comporterà la perdita totale o parziale del modello di fedeltà.
  9. Dopo l'essiccazione, spostare il timbro sulla posizione centro calcolato della slitta rivestita d'oro e abbassarlo a 100 micron incrementi monitorando forza motore asse Z come illustrato nella Figura 2H.
    NOTA: Questo viene comunicato come torsione subita dal motore asse Z e visualizzato nel software guida robot. (Processo automatizzato)
  10. Arrestare abbassando il timbro una volta raggiunta la pressione prestabilita di 79,2 kPa, e mantenere il contatto con la slitta rivestita d'oro per 15 sec. (Processo automatizzato)
    NOTA: I valori di pressione qui sono ottimizzati per la progettazione timbro e funzionalità altezza corrente. Se il disegno di bollo viene modificato, in particolare per alto rapporto di aspetto francobolli, sintonizzare questi di conseguenza un processo di tentativi ed errori.
  11. Rimuovere lentamente il timbro dalla diapositiva oro rivestite e mettere il timbro di nuovo nel dispositivo timbro di nidificazione. (Processo automatizzato)
  12. 4. SI-ATRP di PEGMEMA su micropatterned Coprioggetto

    1. Rilasciare la pressione di vuoto tenendo il coverslide micropatterned, e trasferirla in un pallone da 50 ml Schlenk. Seal e Degas la Schlenk pallone di utilizzare una pompa a vuoto.
    2. Aggiungere 5,5 ml di miscela di reazione contenente la ATRP macromonomero PEGMEMA (208.75 mmoli), acqua (34,4 ml), metanolo (43,8 ml), rame (II) bromuro (1 mmol), e 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) di la beuta Schlenk.
    3. Aggiungere 0,5 ml di ascorbato di sodio L-(454,3 mM) in acqua per iniziare l'attacco, e lasciarlo proseguire per 16 ore a temperatura ambiente sotto gas inerte.
      NOTA: Dopo l'aggiunta di L-ascorbato di sodio, colore reazione si sposterà dal verde chiaro al marrone scuro, come mostrato nella Figura 3A-B.
      NOTA: La reazione può continuare oltre 16 ore, ma non aumenta significativamente la lunghezza delle spazzole PEG.

    Figura 3. Apertura di SI-ATRP. (A) Avvio di reazione e (B) dopo il cambiamento di colore in seguito all'aggiunta di ascorbato di sodio L-. (C) Microscopio immagine di micropatterned superficie coverslide seguente procedura SI-ATRP. Bar Scala 1 mm.

    1. Rimuovere il coverslide micropatterned dal pallone Schenk e risciacquare con etanolo, acqua e etanolo e secco sotto flusso di azoto dolce.
      NOTA: A seguito di SI-ATRP, modificazioni della superficie dovrebbe essere visibile a occhio e può essere ripreso e analizzato al microscopio come in figura 3C.
      NOTA: Questo è il metodo più semplice per testare la precisione del processo in quanto evita la necessità di immunostain substrati.

    5. Funzionalizzazione azide delle Catene micropatterned PEGMEMA

    1. Posizionare il coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro.
    2. Aggiungere 6 ml di N, N -dimethylformamide (DMF) contenente 100 mM sodio azide nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 37 ° C per 24 ore.
      NOTA: Maneggiare DMF solo in una cappa. Fare attenzione durante la pesatura fuori sodio azide.
    3. Al termine, rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto.

    6. passivazione delle Catene bromo funzionalizzati PEGMEMA

    1. Mettere coverslide micropatterned in 20 ml fiale di vetro.
    2. Aggiungere 6 ml di dimetilsolfossido (DMSO) contenenti etanolamina 100 mM e 300 mM trietilamina nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 40 ° C per 24 ore.
      NOTA: Maneggiare DMSO, etanolammina, e trietilammina solo in una cappa.
    3. Al termine rimuovere il coversl micropatternedide dal flaconcino di reazione, lavare con etanolo poi acqua e asciugare in corrente di azoto.

    7. R-μCP di Annulus interne e SI-ATRP di PEGMEMA

    1. Eseguire i punti R-μCP come precedentemente descritto nei passaggi 3,2 e 3,6-3,12, sostituendo un timbro PDMS con 300 micron e 600 micron ID annuli OD sporgenti, in modo che il annuli con le caratteristiche più piccole sono collocati all'interno delle corone circolari in precedenza micropatterned.
      NOTA: La soglia di pressione per questo francobollo è 132,0 kPa. Come accennato in precedenza, queste impostazioni di pressione sono ottimizzate per le caratteristiche provvisorie utilizzati in questo esperimento.
    2. Eseguire i punti SI-ATRP come precedentemente descritto nei punti 4,1-4,4.

    8. L'acetilene Funzionalizzazione di Catene micropatterned PEGMEMA

    1. Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro.
    2. Aggiungere 6 ml di DMSO contenente 100 mMpropargylamine nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a temperatura ambiente per 24 ore.
      NOTA: Maneggiare DMSO e propargylamine solo in una cappa.
    3. Al termine rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto.

    9. rame-catalizzata "Click" biotinilazione di acetilene terminato Catene PEGMEMA

    1. Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro.
    2. Aggiungere 6 ml di solfato di rame (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H -1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v di acqua / DMF) contenente 562 mM azide-PEG 4 -Biotin coniugato nel flaconcino di reazione. Aggiungere 1,2 ml di acido L-ascorbico (0,15 mM) in acqua alla miscela per inizializzare la reazione.
    3. Bubble azoto attraverso la soluzione di reazione per 10 sec, sigillare la fiala con Parafilm e reagire per 24 ore a temperatura ambiente.
    4. Su completion rimuovere coverslide micropatterned dal flaconcino di reazione, sciacquare con acqua e metterla in un piatto di polistirolo 12-bene.

    10. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated acetilene Gruppi

    1. Bloccare coverslide micropatterned in DPBS (3% Donkey Siero) per 1 ora a temperatura ambiente. Colorazione per gruppi acetilene biotinilati con streptavidina-546 coniugato (2 mg / ml) in DBPs (3% asino siero in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente.
    2. Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela.
      NOTA: Figura 4B illustra una immagine della diapositiva dopo questo passaggio è completato.

    11. Rame esente "Click" biotinilazione di azoturo terminato Catene PEGMEMA

    NOTA: Se lo si desidera, questa operazione modifica substrato può essere eseguita in situ durante la coltura cellulare.

    1. Lascia coverslide micropatterned in 12 pozzetti ppiatto olystyrene seguente DBPs risciacqua.
    2. Aggiungere 2 ml di DBPs (o cella di coltura) contenenti 20 mM DBCO-PEG 4 -Biotin, e lasciare questa reazione di continuare per 24 ore a temperatura ambiente (o a 37 ° C in un incubatore).
    3. Al termine, lavare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS (o semplicemente eseguire un cambiamento media).

    12. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated azide Gruppi

    1. Colorazione per gruppi azide biotinilati con streptavidina-488 coniugato (2 mg / ml) in 2 ml DPBS (3% asino siero) per 2 ore a temperatura ambiente.
    2. Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte in DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela.
    3. Immagine micropatterned coverslide con microscopio confocale a fluorescenza. Figura 4A-C raffigura immagini della diapositiva dopo questo passaggio è completato.
      NOTA: Quando si utilizzano supporti per tessuti saggi di cultura, ignorare le sezioni 10 e 12 del presente protocollo. Dopo il degre desideratoe di funzionalizzazione, sterilizzare il coverslide ingegnerizzato risciacquando entrambi i lati con 100% di etanolo ed essiccamento in corrente di azoto. Trasferire i vetrini in una cappa di sicurezza biologica sterile e sciacquare il vetrino con PBS cinque volte prima di procedere con la semina e coltura cellulare.

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Representative Results

L'uso di tecniche di allineamento μCP manuali per ingegnere substrati di coltura con array di spazzole PEG-innestate funzionalizzati con ortogonali "click" chimiche è stata dimostrata in precedenti lavori 6. Tuttavia, questo consente un controllo minimo dell'orientamento del modello e si traduce spesso in sovrapposizione delle aree funzionalizzati. Qui, un nuovo sistema R-μCP viene utilizzato per superare questa limitazione, e la sua capacità di precisione modello una serie di PEG pennello corone circolari con 300 micron e 600 micron ID OD presentando gruppi alchini terminali all'interno di un array separato di PEG pennello corone circolari con 600 micron ID e 900 micron OD presentando gruppi azide terminali è dimostrato 14. Dopo la reazione di alchino presentare PEG con spazzole con azide-PEG 3 -Biotin e la reazione di azide presentare PEG con spazzole con DBCO-PEG 4 -Biotin, il substrato è stato immunostained con sonde fluorescenti e ripreso con un microscopio confocale (FIGURA 4). L'analisi di queste immagini utilizzando un programma MATLAB personalizzato calcolato che le due matrici pennello PEG sono state allineate con precisione sub-10 micron, cioè, X ~ 6,4 micron, Y ~ 1,7 micron, e θ ~ 0,02 °, che è il produttore del citato limite del nostro modello SCARA (cioè ~ 10 micron) e indicativa della prima prestazioni del sistema R-μCP 14. Pertanto, si ritiene che l'uso di SCARA fascia alta in questo sistema fornirebbe ancora inferiore, risoluzione sub-micron. Questi risultati dimostrano la versatilità capacità di progettazione substrato abilitati per l'uso combinato del sistema R-μCP e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali. Il cross-reattività minima dimostra marcatura fluorescente dei chimiche superficiali ortogonali serve ad illustrare le potenzialità di questo sistema per l'immobilizzazione precisa di segnali biochimici per generare substrati di coltura complessi per applicazioni di ingegneria tissutale. </ P>

Figura 2
Figura 2. Schema di R- μCP processo. (A) verso il basso di fronte fotocamera visualizzando immobilizzato scorrevole rivestito in oro, d'impresa (B) di riferimento incisione su coverslide oro rivestite, (c) l'abolizione PDMS timbro di fissaggio timbro di nidificazione, (D - E) visualizzando i riferimenti PDMS bollo con la fotocamera rivolta verso l'alto , (F) mettendo PDMS bollo in alkanethiol bagno iniziatore, (G) essiccazione alkanethiol iniziatore solvente su flussi di azoto, e (H) timbratura alkanethiol rivestito timbro PDMS su coverslide oro rivestite.

Figura 4
Figura 4. immunostained Immagini di micropatterned diapositiva. (A) azide e (B) gruppi alchini, biotinilate usando senza rame e rame-mediata click chemistry, e rilevato con rispettivamente streptavidina-488 e -546. (C) Sovrapposizione di entrambi i canali fluorescenti. Tutte scala bar 500 micron.

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Discussion

Substrati ideali per l'ingegneria tissutale sarebbero bioispirati e quindi ricapitolano la distribuzione spaziale dei leganti critici bioattivi presenti all'interno dei tessuti nativi. Avrebbero anche possedere proprietà dinamiche che consentono regolazioni temporali dei leganti e dei modelli spaziali in cui sono presentati per consentire la morfogenesi dei tessuti diretto e spazialmente limitate induzione del destino cellulare. Fabbricazione di tali substrati richiede l'immobilizzazione di molteplici segnali biochimici in orientamenti complessi e altamente ordinate su substrati. Mentre simulando tutti i fattori endogeni di nicchia di un cellulare in vitro è irragionevole, il sistema R-μCP qui descritto consente per l'immobilizzazione di più regioni di sostanze chimiche bioattive ortogonali con il controllo microscala di orientamento spaziale.

L'utilità di questi substrati aumenta ulteriormente se si considera che, mentre gli array pennello PEG legate con leganti immobilizzatipuò suscitare interazioni biospecifici, non legati spazzole PEG rimangono resistenti a delle proteine ​​e, quindi, possono servire a controllare l'adesione cellulare e la migrazione. Sebbene passiva, adsorbimento micropatterned della matrice extracellulare (ECM) proteine ​​o coniugati polimero-PEG è un metodo semplice per controllare l'adesione cellulare e la migrazione, queste tecniche prevedono solo controllo transitoria poiché adsorbimento è un processo reversibile 11. Inoltre, molecole di aderire a superfici di orientamenti imprevedibili ea concentrazioni casuali limitando così la fedeltà e il controllo delle interazioni biospecifici. Inoltre, i composti in genere utilizzato per creare regioni non incrostanti, come l'albumina di siero bovino o Pluronic F127, non possiedono siti reattivi designati per l'ulteriore funzionalizzazione limitazione post-assorbimento in situ modifiche. SAM di alkanethiols può essere generato con questi gruppi reattivi per la modifica della superficie, ma anche loro hanno una durata limitata nel tessuto culturale Conditioni a causa della mancanza di ossidativo schermatura offerta dalla innestato PEG spazzole 10,11. Al contrario, la fusione delle nostre piattaforme R-μCP con PEG-pennello innesto e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali offre la possibilità di progettare substrati con il bene durevole regioni cytophobic microscala, che possono essere modificate a priori o in situ con funzionalità bio-ortogonale. Questo permetterà un maggiore controllo delle interazioni biospecifici che possono regolare nella morfologia dei tessuti in vitro e la crescita.

Un punto di forza di R-μCP rispetto ad altri sistemi di allineamento stampe microcontact sequenziali è la possibilità di rimuovere il substrato dal sistema tra frantumi utilizzate pur mantenendo un'elevata precisione di allineamento 12,13. Questo consente una maggiore diversità nei tipi di chimiche superficiali che possono essere applicati, e la durata degli effetti collaterali con modifica della superficie può essere variata per regolare la densità di seguito imligandi mobilitati 6. Così, R-μCP può essere utilizzato per stabilire gradienti di concentrazione focali nei segnali biochimici che mediano le interazioni biospecifici 14. Con la capacità di controllare con precisione sia la posizione e il grado di interazioni biospecifici, il sistema R-μCP offre un metodo unico per studiare il ruolo di ligandi bioattivi nella morfogenesi dei tessuti e stabilisce un sistema robusto per generare substrati di coltura che simulano la presentazione di segnali biologici la nicchia in vivo.

Un aspetto critico di nicchie cellulari, in particolare nell'ambito dello sviluppo, è la modulazione spazio-temporale della segnalazione fattori 18. Sebbene segnali biochimici solubili possono essere aggiunti a coltura in modo temporalmente definito, non è limitato controllo spaziale su cui cellule incontrano questi segnali. Con il sistema R-μCP qui descritto, è possibile costruire substrati di coltura micropatterned con functionaliz terminalied PEG spazzole presentare gruppi funzionali azide che non hanno effetti sul destino delle cellule in coltura. Mentre gruppi azide sono capaci di subire reazioni rame catalizzate "click" con molecole che presentano alchini, questo non può essere eseguita in presenza di cellule in coltura data la tossicità del rame. Tuttavia, le molecole ad alta deformazione, come dibenzocyclooctyne (DBCO) subiscono un esente da rame azide-alchino reazione di cicloaddizione altamente selettivo e biocompatibile 19,20. Attraverso la coniugazione del linker-DBCO contenente, substrati di coltura micropatterned possono essere modificati in situ con nuovi leganti biologici 21. Con la capacità di rendere le regioni cytophobic cytophilic o aggiungere diversi segnali biochimici per l'uso in procedure di segnalazione multi-step, substrati di coltura generate con questo metodo hanno nuove capacità di adattamento e, quindi, fornire un sistema più robusto per istruire morfogenesi dei tessuti in vitro.

Nonostante l'immensa pentolaziale e l'utilità della piattaforma R-μCP, comporta anche alcuni svantaggi. L'uso di numerosi passaggi SI-ATRP per generare substrati PEG-innestate aumenta notevolmente il tempo di montaggio rispetto ai metodi che comportano la stampa a getto d'inchiostro o microdroplet deposizione di proteine ​​ECM. Mentre la precisione delle tecniche di stampa a getto d'inchiostro competizione con quella della attuale sistema R-μCP, l'adsorbimento di proteine ​​ECM è reversibile fornendo così un minor controllo delle interazioni cellula-proteina. Inoltre, i substrati generati tramite tecniche di stampa a getto d'inchiostro non possono essere rimossi durante la fabbricazione, impedendo in tal modo l'uso di diverse sostanze chimiche di modifica substrato che permettono, per esempio, nello spazio ristretto nel substrato situ modifiche 22. A causa di queste limitazioni tecniche a getto d'inchiostro sono più adatti per una rapida produzione di substrati di coltura principalmente interessati con breve durata, le modalità statiche di biomolecole e 23 tipi di cellule, mentre il sistema R-μCP è molto better adatto verso la generazione di supporti multi-sfaccettati progettati per esporre a lungo termine, il controllo dinamico su entrambe le interazioni cellulari spaziali e temporali in 2D con diversi ligandi biologici.

Stampa microcontact consente una rapida deposizione di nano-to-microscala 'ink' dispone su grandi superfici, ma c'è sempre stata una significativa eterogeneità della concentrazione di sostanze depositate 'inchiostro. Questo è anche una limitazione di corrente della piattaforma R-μCP come si osserva nella figura 4. Ipotizziamo che l'eterogeneità modifica fluorescente del PEG spazzole è dovuto all'applicazione del robot di una forza normale non uniforme su tutta timbro PDMS, che è anche probabile che non perfettamente piani. Ciò comporta non uniforme della pressione di contatto tra tutte le regioni del timbro e il substrato provocando il deposito irregolare dell'iniziatore alkanethiol e successiva spessore del pennello PEG innestato. InPer fabbricare substrati PEG-innestate con ancora deposizione di alkanethiols e quindi la funzionalità di superficie, il disegno dell'utensile stampaggio dovrà essere ottimizzata per applicare una forza normale distribuito e uniforme su tutta timbro PDMS. Questo faciliterà il contatto uniforme con le diapositive ricoperte d'oro in tutta l'intera interfaccia indipendente di imperfezioni di bollo. Inoltre, nella Figura 4B, si può osservare lieve contaminazione incrociata dei gruppi acetilene sulla azide terminato spazzola PEG. Mentre la densità superficiale di ligandi immobilizzati a causa di contaminazione incrociata è minimo rispetto a quella sulla destinazione PEG-spazzola, questo può essere ridotta quasi a zero aumentando la durata della reazione etanolamina passivazione (vedere Sezione 6) come dimostrato in precedenza 6.

L'applicazione principale del sistema R-μCP qui descritto è per la produzione di substrati di coltura di tessuti complessi che potrebbero essere utilizzati per esercitare spaziale e temporale di controllo oil destino della cellula f. Tuttavia, l'elevata precisione e l'accuratezza della piattaforma R-μCP rende un metodo attraente per altre applicazioni. La capacità di modello aree cytophilic con leganti chimici differenziali seguita da in situ modifiche precedentemente inerti, regioni cytophobic permette di co-coltura di linee cellulari multiple, con uno stretto controllo sul loro orientamento spaziale. Questa accoppiata con l'intrinseca high-throughput natura micropatterning presentare una alternativa agli attuali metodi di high-throughput screening delle due celle singole e combinazioni multi-cella 24. Mentre il sistema R-μCP ha un grande potenziale nel campo della biologia, potrebbe anche essere applicato al campo dei sistemi microelettromeccanici (MEMS). In MEMS fabbricazione, è desiderabile trasferire componenti MEMS con elevata precisione e accuratezza per la produzione di massa. Con nuove tecniche di stampaggio cinetiche, il sistema R-μCP qui descritto potrebbe essere adattato per stampare in modo efficace COMPONEnti di silicio o nitruro di gallio su wafer di silicio da utilizzare nella creazione di MEMS 25. Così, la piattaforma R-μCP potrebbe essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni potenziali.

In conclusione, l'uso del sistema R-μCP per generare PEG-innestato substrati di coltura ortogonalmente funzionalizzati utilizzando reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali presenta non solo una piattaforma ideale per potenzialmente controllare la morfologia dei tessuti e la crescita in vitro, ma un sistema eccellente per indagare i ruoli di multipli ligandi bioattivi sul destino delle cellule. La capacità di modello più segnali biochimici in modelli distinti e altamente ordinate stabilisce le basi per la costruzione di substrati di coltura in grado di istruire la formazione delle strutture dei tessuti con più tipi di cellule organizzate su scala micron. Questo, insieme con la capacità di modificare substrati micropatterned in situ, potrebbe consentire un controllo senza precedenti della morfogenesi dei tessuti e cell destino nella cultura. Le tecniche di patterning qui descritte forniscono un sistema versatile per la produzione di substrati di coltura che un giorno potrebbero agevolare produzione razionale e riproducibile di strutture tissutali organotipici in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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