Floral-Dip Transformation af hør (
1Department of Biology, Case Western Reserve University

Biology
 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at omdanne hør hjælp Agrobacterium-medieret plantetransformation via blomster-dip. Denne protokol er enkel at udføre og billig, men giver en højere transformation end de nuværende tilgængelige metoder til hør transformation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bastaki, N. K., Cullis, C. A. Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate. J. Vis. Exp. (94), e52189, doi:10.3791/52189 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Agrobacterium-medieret plantetransformation via Floral dip er en almindeligt anvendt teknik inden for plantetransformation og er blevet rapporteret at være en succes for mange plantearter. Imidlertid har hør (Linum usitatissimum) transformation af blomster-dip ikke blevet rapporteret. Målet med denne protokol er at fastslå, at Agrobacterium og blomster-dip metode kan bruges til at generere transgene hør. Vi viser, at denne teknik er enkel, billig, effektiv, og endnu vigtigere, giver en højere omdannelse end de nuværende tilgængelige metoder hør transformation.

Sammenfattende blev blomsterstande af hør dyppet i en opløsning af Agrobacterium bærer en binær vektor plasmid (T-DNA-fragment plus Linum insertionssekvensen, LIS-1) til 1 - 2 min. Planterne blev lagt fladt på deres side i 24 timer. Derefter blev planterne holdt under normale vækstbetingelser, indtil den næste behandling. De process af dypning blev gentaget 2 - 3 gange, med cirka 10-14 dages interval mellem dypning. T1 frø blev indsamlet og spiret på jord. Efter cirka to uger, blev behandlet afkom testet ved direkte PCR; 2 - 3 blade blev anvendt per plante plus de passende T-DNA-primere. Positive transformanter blev udvalgt og dyrket til modenhed. Forvandlingen sats var uventet høj, idet 50 - 60% af frøene fra behandlede planter være positiv transformanter. Det er en højere transformation end dem, der rapporteres for Arabidopsis thaliana og andre plantearter, der bruger floral-dip transformation. Det er også den højeste, der er rapporteret hidtil, for hør transformation ved hjælp af andre metoder til transformation.

Introduction

Hør (Linum usitatissimum) er en vigtig afgrøde dyrkes bredt for sine fibre og olier. Transformation af hør genomet er muligt med teknikker såsom sårdannelse, Agrobacterium infektion og samdyrkning i vævskultur under anvendelse biolistiske partikler eller ultralyd sonikering efterfulgt af regenerering. Men disse teknikker har mange ulemper, herunder tilbøjelighed til mange mutationsbegivenheder og en længere tid til opnåelse af de transgene linjer. Nogle af disse metoder kan også være dyrt og kræver dygtige og effektiv manipulation af instrumenterne, hvilket resulterer i lave recovery frøplanter. Vigtigst disse teknik resulterer ofte i lave Omsætningshastighederne 2,6.

Agrobacterium-medieret plantetransformation via Floral dip er en enkel og effektiv metode til at generere transgene planter. Det er blevet rutinemæssigt og med held anvendes til mange plantearter såsom Arabidopsis Thalianen 1,4, Medicago truncatula 11, tomat 12, hvede 13 og majs 10. Det har imidlertid ikke været tænkt på som en levedygtig teknik til hør transformation på grund af flere faktorer, såsom det lave antal af blomster fremstillet ved hør, begrænset antal af frø opnået fra hver blomst, den store frø størrelse og tyk pels, som også kan være problematisk for en sådan genetisk transformationsproces. Derudover udvælgelse segment af blomster-dip teknik kræver spire transformerede frø på en plante medier indeholdende et antibiotikum, med transformerede afkom skelnes baseret på deres evne til at spire og blive grøn, mens ikke-transformerede afkom enten ikke spire eller spire men blegemiddel hurtigt og dø. I den nuværende litteratur er det blevet bemærket, at vildtype-hør tendens til at undslippe høj koncentration af antibiotika valg, der producerer falske positive resultater, og at udvælgelsen af ​​T1 afkom baseretom antibiotikaresistens sværere 6,14. Også, når en høj koncentration af antibiotikum blev tilsat til selektionsmedium, hastigheden af observerede transformation faldt dramatisk 9.

I denne protokol, vi brugte Agrobacterium og blomster-dip metode til at omdanne en linje af spindhør, Stormont cirrus (lydhør og plast), som har vist sig at reagere på spændinger i miljøet ved at ændre dets genom 3,5. For at overvinde den antibiotiske escape problem har vi valgt at gøre direkte PCR-analyse af DNA fra T1 blade i stedet for valget ved at tilsætte antibiotika til anlægget medier. Vi benyttede sig af den simple anatomi hør til at spore specifikke blomster på tidspunktet for behandlingen. Denne tracking system tillod udvælgelse af frø fra bestemte blomster og spiring på jorden uden at tilføje antibiotikum. Positive transformanter blev simpelthen identificeres ved at teste DNA opnået fra blade ved hjælp af en hurtig og effektiv metode of direkte PCR. Vores resultater viser, at blomster-dip metoden virker meget godt i denne linje af hør og overraskende resulterede i en meget høj transformation rate (50 - 60%), højere end dem, der tidligere er observeret for Arabidopsis thaliana, som blev rapporteret til at være 0,1-1 % 1, og også højere end andre plantearter 10,12. Vi testede også en anden sort af hørfrø (oliehør), Bethune (stabil og ikke-responderende), og vores foreløbige data tyder på, at blomster-dip arbejder også for denne sort af hør.

Målet med denne protokol er at vise, at Agrobacterium og blomster-dip kan bruges til at generere transgene hør. Vi viser, at denne teknik er enkel, billig og hurtigere end andre metoder til hør transformation. Vigtigere det resulterer i en meget højere transformation end de andre metoder til hør transformation 2,6. Anatomi Arabidopsis thaliana, som har mange grene og blomster, makes det vanskeligt at skelne dyppet og ikke-dyppet blomster på samme plante. Derfor stort antal frø, ca. 20.000 frø pr plante, skal screenes for at identificere positive transformanter 8. Hør, på den anden side, har færre grene (én vigtigste gren og et par side filialer) og færre blomster, der producerer ca. 100 frø pr planter, hvilket gør det muligt at spore enkelte blomster og til at vælge særlige frø under screening proces.

Vi foreslår, at blomster-dip er en anvendelig metode til at omdanne eventuelle relaterede arter af hør, en slægt af omkring 200 arter. Denne metode giver meget højere transformation end andre metoder til hør transformation. Vi foreslår også, at den direkte PCR screening af T1 blad DNA er en effektiv måde at løse problemet med antibiotikaresistens flugt, der ofte producerer mange falske positiver. Direkte PCR-screening kan anvendes til alle andre plantearter og er ikke begrænset to hør. Den enkle sporing frø teknik anvendes i denne protokol kan anvendes til alle andre plantearter med forgrening anatomi ligner hør.

Protocol

1. Dyrkning af Planter

  1. 6 uger før dypning, fylde 5 tommer potter med jord og sår hør frø ¼ tommer dybt i jorden (4 frø pr pot). Vær sikker på at opstramme den jord over frøene. Vand planterne regelmæssigt og vedligeholde dem i lang dagslys (14 timers lys og 10 timers mørke).
  2. Tjek planter regelmæssigt for primære blomsterstande (klynger af blomster 'organer). Planterne er klar til transformation, når knopperne er synlige og har netop dannet i blomsterstanden (figur 1 og 2). For at se knopper, klippe bladene omkring den om nødvendigt.
    BEMÆRK: Brug den bedste blomst fase er kritisk og er nærmere beskrevet i diskussionen.
    1. Brug den vigtigste gren af ​​anlægget til den eksperimentelle behandling som den producerer flere blomster end siden afdelingerne. Brug sidegrene enten som kontroller (ikke at blive dyppet) eller til andre eksperimentelle behandlinger.
    2. Alternativt kan du bruge de vigtigste og sidegrene afsamme anlæg til eksperimentel behandling og bruge en anden plante som en kontrol eller til andre eksperimentelle behandlinger. Brug etiketter til at markere de enkelte afdelinger og de enkelte blomster med dato og type behandling.

2. Kloning og transformation i Escherichia coli (E. coli) celler

  1. Klon fragmentet / gen af ​​interesse i kloningsstedet af en plante binære vektor, der huser T-DNA multiple.
    1. Udfør kloning i et trin eller to trin.
      1. Direkte klone små indsatser i denne protokol (~ 500 bp) i planten binære vektor. I denne protokol, bruge planten binære vektor (PRI909). Ellers bruge andre vegetabilske binære vektorer i en lignende strategi.
      2. Alternativt klone store indsatser (≥6.5 kb) i to trin: først med en almindelig kommerciel kloning kit (ikke plante specifik), så subklone i planten binære vektor.
  2. Opret en PCR reakning til at amplificere genet af interesse. Design primerne med restriktionssteder ved 5'-enden (ifølge kloningsstedet af anlægget binære vektor i brug multiple).
    1. Udfør en standard-PCR under anvendelse af genomisk hør DNA med de følgende cykliseringsbetingelser: en indledende hold på 24 ° C og derefter 2 minutter ved 94 ° C, efterfulgt af 30 cyklusser af 98 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 15 sek, og 72 ° C i 2 min. Udfør en endelig ekstension ved 72 ° C i 5 minutter efterfulgt af en ubestemt hold ved 4 ° C.
    2. Separate PCR-produkter på 1% Tris / borat / EDTA (TBE) agarosegel køre gelen ved 100 V i 1 time. Rense produkter fra gelen og kvantificere via NanoDrop.
  3. Opsætning af ligeringsblandingen til at klone PCR-produktet i den kommercielle kloningsvektor. Følg producentens protokol.
  4. Omdan Ligeringsblandingen i kemisk kompetente E. coli-celler som følger.
    1. Tilsæt 2 pi af ligeringsblandingen ind i et hætteglas med lmemically kompetente E. coli-celler. Inkuber på is i 30 minutter.
    2. Varmechok cellerne i 30 sek ved 42 ° C (Heat shock tid og temperatur afhænger af den type af celler).
    3. Inkuber på is, og der tilsættes 250 pi RT super optimal bouillon med katabolitrepression (SOC) medium.
    4. Cap røret og inkuber i en orbitalryster ved 200 rpm ved 37 ° C i en time.
    5. Spred 10-50 pi fra hver transformation på en forvarmet LB plade (forvarmet ved 37 ° C) + passende selektivt antibiotikum (bestemme den selektive antibiotikum baseret på den type af kommercielle kloningsvektor anvendes). Pladerne inkuberes ved 37 ° CO / N.
  5. Pick ~ 10 kolonier for mini prep plasmid oprensning, anvendelse af et kommercielt kit. Mini prep plasmid oprensning udføres generelt som følger.
    BEMÆRK: Buffer navne er specifikke for den kommercielt kit anvendes, men deres generelle funktioner er ens.
    1. Podes de enkelte kolonier i 2- 5 ml LB-medium indeholdende den passende selektive antibiotika (bestemt baseret på den type af kommerciel vektor, der anvendes).
    2. Inkuber i ca. 8 timer ved 37 ° C under kraftig omrystning (~ 300 rpm).
    3. Cellerne høstes ved centrifugering ved 6.000 x g i 10 min.
    4. Pelleten resuspenderes i 250 pi resuspensionsbuffer. Bland og vortex til helt dispergere bundfaldet.
    5. Lyse de bakterielle celler ved at tilsætte 250 pi af lysisbuffer, blandes omhyggeligt ved at vende rørene 4 - 6 gange.
    6. Neutraliseres lysatet i neutraliseringsbuffer og vend 4 - 6 gange for at blande. Centrifuger i 10 minutter ved ~ 17.900 xg på en bordplade mikrocentrifuge.
    7. Overfør supernatanterne fra foregående trin til et spin-søjle. Centrifugeres igen ved ~ 17.900 xg i 30 til 60 sek.
    8. Vask spinkolonne ved tilsætning 0,75 ml vaskebuffer og centrifugeres i 30-60 sek. Kassér gennemstrømning.
    9. Centrifugeres i yderligere 1 min til Remove resterende vaskebuffer. Placer spinkolonne i et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør. At eluere DNA, tilsættes 50 pi vand til centrum af hver kolonne. Lad det stå i 1 min og centrifugeres i 1 min.

3. Analyser Renset Plasmider for tilstedeværelsen af ​​Insert

  1. Restriktionsfordøjelse:
    1. Opsætning af en restriktionsspaltning for at bestemme tilstedeværelsen af ​​insertet ved spaltning af plasmidet med restriktionsenzymer anvendt til at klone insertet. En typisk dobbelt restriktionsfordøjelse reaktion som følger: 1 ug oprenset plasmid, 1 pi af hver restriktionsenzymer, 2 pi 10x restriktionsfordøjelse buffer + 2 pi BSA (hvis relevant), X pi vand (til i alt 20 pi)
    2. Bland forsigtigt og inkuberes ved anbefalet temperatur (varierer fra enzym til en anden).
    3. Analyser begrænsningen fordøje reaktion på 1% TBE agarosegel kørt ved 100 V i 1 time og se efter frafald af passende størrelse.
  2. PCR-analyse:
    1. Opsætning af en PCR med det oprensede plasmid, under anvendelse af primere fra den kommercielle vektor region at forstærke inde i indsatsen eller forbindelsen mellem vektor og insert. Fælles primere er M13 frem og bak og T3 / T7 primere.
    2. I denne protokol, skal du bruge følgende PCR cykling betingelser: en indledende hold på 24 ° C og derefter på 2 minutter ved 94 ° C efterfulgt af 18 cykler ved 98 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 15 sek og 72 ° C for 2 min. Udfør en endelig ekstension ved 72 ° C i 5 minutter efterfulgt af en ubestemt hold ved 4 ° C.
    3. Load PCR-produkter på en 1% TBE agarosegel og kørt i 100-120 V i 1 time.
  3. Sequencing:
    1. Send oprenset plasmid til en kommerciel sekventering facilitet til at analysere og bekræfte tilstedeværelsen af ​​indsatsen.
    2. Når den korrekte konstruktion er opnået, bruger det til det andet trin af kloning (i planten binære vektor).
      BEMÆRK: Trin 2,3-3,3kan fjernes, såfremt kloning er afsluttet i et trin.

4. Kloning i planten binære vektor (PRI909) og E. coli Transformation

  1. Opsætning af en dobbelt restriktionsfordøjelse reaktioner at linearisere planten binære vektor og isolere den tidligere klonede insert anvendelse af de samme restriktionsenzymsteder, der blev tilføjet til primerne (trin 2.2).
  2. Analyser restriktionsfordøjelser under anvendelse af gelelektroforese, kørt ved 100 V til 1 - 2 timer. Skær indsatsen og det lineariserede plante binære vektor fra gelen.
  3. Brug et kommercielt kit til at rense gel produkter. Se producentens manual.
  4. Opsætning af en ligeringsreaktion at ligere indsatsen i planten binære vektor. Indsatsen vektor forholdet afhænger af størrelsen af ​​indsatsen, og planten binære vektor. I denne protokol for LIS1 indsatsen var 6,5 kb og anlægget binære vektor var 9 kb. Derfor skal du bruge en 1: 2 insert vektor forholdet.
  5. trin 2,4-3 for bakteriel transformation, plasmid oprensning og analyse. Når den korrekte konstruktion (indsæt + plante binære vektor) opnås, fortsætte til elektroporation i trin 5.

5. Elektroporation i Agrobacterium tumefaciens elektrisk Competent Cells

  1. Optø et hætteglas med Agrobacterium tumefaciens elektrisk kompetente celler på is.
  2. Tilsæt 1 ng binære vektor plasmid-DNA til 20 pi kompetente celler på is, og blandes forsigtigt.
  3. Chill en 0,1 cm elektroporeringskuvette på is.
  4. Overfør den kompetente celle / DNA mix til elektroporation kuvetter, og tryk på for at samle blandingen i bunden. Sæt kuvetten i elektroporator maskine og impuls (spænding og tidsmæssige betingelser afhænger af størrelsen af ​​kuvetten og elektroporator anvendes).
  5. Der tilsættes 1 ml SOC medier og overføre cellerne til et 15 ml rør.
  6. Der inkuberes i 1 time ved 28-30° C, omrystning ved 100 rpm. Plate 50-100 pi celler på LB agar + passende selektiv antibiotika (afhænger af planten binære plasmid og stammen af Agrobacterium i denne protokol anvendelse 50 ug / ml kanamycin og 100 pg / ml streptomycin.).
  7. Inkubér pladerne op til 48 timer ved 28-30 ° C.
  8. Gentag trin 2.5 til koloni udvælgelse og plasmidoprensning.
  9. Gentag trin 3 for at analysere plasmidet og at kontrollere integriteten af indsatsen og T-DNA før brug konstruktionen blomsterrelaterede dypning. Gentag trin 3.2 ved hjælp af multiple PCR-primere i hele indsatsen region og på tværs af T-DNA-regioner og ved sekventering som i trin 3.3.
    BEMÆRK: I denne protokol 4 forskellige primere blev udformet på tværs af T-DNA og 10 primere i hele indsatsen.
  10. Når tilstedeværelsen af anlægget binære plasmid i den valgte Agrobacterium koloni er bekræftet, sted celler In 50% glycerol og opbevares ved -80 ° C. Store resterende kolonier på pladen ved 4 ° C, hvis de skal anvendes inden for en uge 7.

6. Floral-Dipping

BEMÆRK: 2 dage inden floral-dypning:

  1. Grow Agrobacterium-celler til stationær fase (OD600 mellem 0,5-1 er acceptabel) i LB + passende antibiotika i flydende medier.
    Bemærk: Disse er de samme antibiotikum som i trin 5.6, baseret på planten binære vektor og typen af Agrobacterium stamme.
  2. Start kultur med 1: 100 fortyndinger af en mættet (5 ml) O / N-kulturen og vokse i 24-48 timer ved 28-30 ° C under omrystning ved 150 rpm. Kulturen skal have nået den midlogarithmic fase og mere sandsynligt vil nærme eller stationær fase 1. OD på ca. 0,8 (igen OD mellem 0,5 til 1, er alle acceptable) 8. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 5.000 xg ved stuetemperatur.
  3. Resuspender cellerne i infiltration medium (5,0% saccharose + 0,05-0,003% Silwet L-77). For første runde af dypning, bruge 0,05% Silwet-77. For det andet og tredje runde, reducere koncentrationen til 0,03% (detaljeret i Discussion).
  4. Fortsæt med blomster-dip trin. Læg anlægget på sin side og dyppe kun de synlige knopper i infiltration medium for 1-2 min. Lad planten på sin side og dæk den med plastfolie for at opretholde en høj luftfugtighed i kuplen (figur 3).
  5. Den næste dag, planten placeres i opretstående stilling og opretholde normalt.
  6. Når opløbet vokser større (som regel efter ca. 10-14 dage) Gentag trin 6,1-6,4. Reducer dypning tid til 30-60 sek og Silwet-77 koncentration til 0,003%.
  7. Vedligehold planterne normalt indtil deres frø er modne og klar til at blive indsamlet (figur 4).

7. Valg af Positive Transformants med direkte PCR

  1. Soen T1 frø på jorden som i trin 1.1.
    1. Alternativt gør Murashige og Skoog basal salt medium (MS-medium) ved tilsætning af 2,2 g MS-medium + 4 g agar i 500 ml vand. Autoklave og hældes i små urtepotter. Opbevares i 4 ° C indtil anvendelse.
    2. Sow frøene ved at placere dem på den størknede MS-medium. Opbevares under lange dagslys (14 timers lys og 10 timers mørke). Frø vil spire i omkring 4 - 6 dage (figur 5).
    3. Brug en frø fra hver blomst som udgangspunkt. Hvis der opnås nogen positiv transformant, gentage dette trin ved at vælge en anden frø fra blomsten.
      BEMÆRK: Test forskellige frø fra de samme blomster, for i nogle tilfælde ikke alle frø fra en blomst vil blive omdannet. Valg af yderligere frø fra eksperimentelle blomster er undertiden nødvendig.
  2. Tjek på de planter regelmæssigt. I cirka 10-14 dage efter spiring, når sandtblade udvikle, afprøve planterne med direkte PCR.
  3. Forbered bladet dna-ekstrakt ved at skære 2 - 3 blade (5 - 10 mg i vægt) fra hver frøplante og placere dem i et mikrocentrifugerør.
  4. Tilføj 180 pi 50 mM NaOH til hvert rør, og der inkuberes i 10 minutter ved 95 ° C.
  5. Neutraliseres ekstrakten ved tilsætning af 20 pi 1 M Tris-HCI (pH 8,0).
  6. Brug 1 pi af ekstrakten i den direkte PCR-reaktion under anvendelse af primere udformet over T-DNA eller indsatsen (figur 7), for at selektere for positive transformanter.
    1. I denne protokol, bruge direkte PCR med en indledende hold på 24 ° C og derefter 2 minutter ved 98 ° C, efterfulgt af 40 cykler af (98 ° C i 10 sek, annealing trin i 15 sekunder og et forlængelsestrin ved 68 ° C). Udfør en endelig udvidelsestrin ved 68 ° C i 5 minutter efterfulgt af en ubestemt hold ved 4 ° C. (Se tabel 1 for yderligere oplysninger om primere, annealing temperaturer og forlængelsestider for cykler).
  7. Identificer positive transformanter og dyrke dem til udløb. Hvis frøene blev spiret i MS-medium, transplantation til jorden i en større potte (figur 5).

Representative Results

Figur 1 - 4 viser nogle af trinnene i protokollen. I figur 1 og 2, bladene omkring blomsterstanden knopper skæres at udsætte dem for Agrobacterium-cellerne og de ​​forskellige bud faser, der blev anvendt til at udvikle protokollen. Figur 3 viser processen med hør floral-dip. Figur 4, viser en eksempel på, hvordan de vigtigste og sidegrene kan mærkes, og hvordan de enkelte blomster kan spores og identificeres. figur 5 viser, hvordan T1 afkom kan spiret på MS plante medier og derefter transplanteres til jord til modenhed. Figur 6 illustrerer, hvordan Wild- typen hør kan undslippe høje koncentrationer af kanamycin, bekræfter tidligere fund i litteraturen 6,9,14.

Figur 7 viser et eksempel på direkte PCR-amplifikation fra positive T1 transformanter. T1 blomster blev indsamlet fra main og sideskud af en enkelt T0 plante. Som det kan ses fra den direkte PCR, 8/12 T1-planter testet positive ved hjælp af PCR og forstærket de forskellige regioner i T-DNA'et. Vores primere blev også designet mellem LIS-1 Indsæt og de ​​multiple kloningssteder (Figur 7B og C). Vi brugte yderligere primere fra planten binære vektor til at forstærke forskellige segmenter af T-DNA, såsom den venstre grænse og NOS-terminatoren (data ikke vist) eller den højre kant og det multiple kloningssted (figur 7D). Primere specifikke for LIS-1 insert blev også anvendt i denne protokol (data ikke vist). En liste over primere er tilvejebragt i tabel 1. Imidlertid sekvenserne af disse primere afhænger sekvensen af T-DNA plante binære vektor og insert anvendes til blomster-dip. Vi bemærkede også, at der ikke var nogen signifikant forskel i omdannelsen på mellem blomster indsamlet fra de vigtigste og sidegrene.


Figur 1. Skæring bladene omkring de primære blomsterstand knopper at udsætte dem for de Agrobacterim celler. (A) Knopperne er dækket af blade. (B) Blade er blevet skåret omkring knopperne at afsløre dem. (C) Forstørret billede fra plante i (A) efter opskæring at afsløre knopper. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. De forskellige bud etaper, der blev brugt i denne protokol til at bestemme den bedste scene bruge til blomster dip. (A) Scenen opløbet tidligt er op på ca tely 2 mm. (B) Den midterste fase opløbet er ca. 5 mm. (C) The Late etape opløbet er ca. 1 cm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Processen med hør floral-dypning. (A) De primære blomsterstande dyppes i infiltration medier indeholdende Agrobacterium-cellerne. (B) Forstørret fra (A). (C) De dyppede planter lagt fladt til næste dag, og de ​​dyppet grene er dækket med plastik for at opretholde høj luftfugtighed. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

jove_content "FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 4
. Figur 4. Processen med blomst sporing og frø samlinger, fra T0 behandlede planter (A) Et eksempel på hele planten med de vigtigste gren (den højeste gren i midten) og sidegrene (B - D). En . eksempel på de blomster fra de forskellige grene (E) Et eksempel på frøene er indsamlet fra individuelle blomster (mærket A - K). fra de vigtigste gren Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. De T1 kimplanterne dyrket uden antibiotisk selektion. (A) T1 frø erspiret på MS plante medier. (B) Positive transformanter, som bestemmes ved direkte PCR, transplanteres til jord og dyrket til modenhed. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Antibiotisk flugt, et problem for T1 udvælgelse, overvindes ved direkte PCR-screening. (A) Wild-type hør frø spiret på MS plante medier uden antibiotika. (B) Wild-type hør frø spiret på MS plante medier + stigende koncentrationer kanamycin (200 pg / ml, 600 ug / ml, 1 mg / ml). (C) Wild-type hør frø spiret på MS plante medier med 2 mg / ml kanamycin. (D) PCR fra vildtype-hør og T1 kimplante hjælp kanamycin primere alle AMPLceret de kanamycin gen (legender: EZ1: DNA-markør, FlaxS, vildtype flaxS, C: eksportkontrol på ikke-dyppet gren, Ma: T1 afkom fra blomst "a" indsamlet fra de vigtigste gren, Sc, Sd, Se, Sf: T1 afkom af forskellige blomster "c, d, e, f" indsamlet fra sidegren, W:. no-DNA) Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Et eksempel på vellykket PCR-amplifikationer af T1 afkom under anvendelse af direkte PCR-metode. (A) Diagram over Plant binære vektor + klonet LIS-1 insert. Blå pile angiver positionen af PCR-primere, der anvendes i den direkte PCR-screening (modificeret fra Takara). (B) PCR med primere M13F + 3 '(C) PCR med primere M13R + 18a Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Forward primer sekvens kilde 5'-3 ' Reverse primer sekvens kilde 5'-3 ' Annealing Temprature (° C) Udvidelse Time (Sec) Forventet størrelse (bp)
M13F (T-DNA) CTGCAAGGCG
ATTAAGTTGG
3 '(LIS-1 insert) GAGGATGGAA
GATGAAGAAGG
57 40 450
18a (LIS-1 insert) TATTTTAACCC
M13R (T-DNA) ATTAGGCACC
CCAGGCTTTA
57 40 520
MCS (T-DNA) TGGTCATAGC
TGTTTCCTGTG
RB (T-DNA) TTTAAACTGA
AGGCGGGAAA
60 20 200
LB (T-DNA) TTTGATGGTG
GTTCCGAAAT
NOS (T-DNA) GAATCCTGTT
GCCGGTCTT
60 30 380
NPTII (T-DNA) GCGATACCGT
AAAGCACGAG
NTPII (T-DNA) GCTCGACGTT
GTCACTGAAG
65 45 502

Tabel 1. Nogle af de primere, der anvendes til direkte PCR-analyse.

Discussion

I nogle plantearter, såsom hør (Linum usitatissimum), har vellykket plantetransformation været begrænset. Tidligere har transformation i hør kræves en Agrobacterium infektion ved såret og co-dyrkning, anvendelse biolistiske partikler eller ved hjælp af ultralyd lydbehandling, efterfulgt af regenerering; en proces, der er både lange og tilbøjelige til at blive ledsaget af mange mutationsbegivenheder. Desuden udvælgelsesprocessen af ​​disse teknikker kræver anvendelse af antibiotiske selekterbare markører, såsom kanamycin. Imidlertid er det blevet bemærket i litteraturen, at denne metode til udvælgelse producerer mange falske positiver, som hør har tendens til at undslippe høje koncentrationer af antibiotika 6,9,14. En anden ulempe ved de tidligere teknikker i hør transformation har været de lave Omsætningshastighederne 2,6.

I protokollen beskrevet her, blev Agrobacterium-medieret plantetransformation via blomster-dypning vistat resultere i en høj transformation rate for hør (50 - 60%). Transformanter blev opnået fra blomster dyppet og indsamlet fra de vigtigste og sidegrene. Udvælgelse af positive transformanter blev simpelthen gjort ved dyrkning T1 planter på jord og screening deres blade kort efter de spirede, at omgå anvendelsen af ​​antibiotika udvælgelse, der tidligere et skridt bruges som normen i blomstret-dip til andre plantearter. Ved at udføre direkte PCR-analyse af blade, og anvendelse af de egnede T-DNA-primere kan positive transformanter hurtigt valgt. Denne teknik er enkel, billig og let at udføre, men resulterer i en meget højere transformation end dem, der tidligere er rapporteret for Arabidopsis og andre plantearter ved hjælp af denne metode 1,10,12. Det er også den højeste rapporterede transformation sats for hør.

Men der er kritiske trin i procedurerne, herunder udvælgelse af de bedste blomst scenen og den bedste koncentration overfladeaktive såAgrobacterium kan trænge ind i planteceller uden at dræbe blomsten organer. Hvis et tidligt knopstadiet anvendes (figur 2A) med høj Silwet-77 koncentration på mere end 0,05%, vil blomsten ikke udvikle eller indføre frø. Hvis sent knopstadiet bruges (figur 2C), selv om omdannelsen kan arbejde, vil det ske på et langt lavere sats. Lignende resultater blev opnået med Arabidopsis floral dip transformation 1,4. Til denne protokol blev alle floral faser testet med forskellige Silwet-77 koncentrationer og den bedste fase blev bestemt til at være den midterste knopstadiet (figur 2C) med Silwet-77 på 0,05% for den første dypning, efterfulgt af en anden dypning ved den sene knopstadiet (figur 2C) med en lidt reduceret Silwet-77 koncentration på 0,03%. Omdannelsen fungerede også godt ved hjælp af den tidlige knopstadiet (figur 2A) med en lav Silwet-77 koncentration på 0,003%, efterfulgt afen anden dypning med midterste knopstadiet (figur 2B) ved højere Silwet-77 koncentration på 0,05%.

I denne protokol, blev nogle andre parametre forsøgt at optimere omdannelsen sats, men fundet at have nogen effekt på det endelige resultat. Som eksempler kan nævnes udvidelse af tid efter dypning, at planterne lå på deres side og dækket i plast fra den ene dag til to dage; ved hjælp af en OD på mere end 1 for Agrobacterium kultur, i stedet for 0,5-1; øge dypning tid til 5 - 15 min i stedet for 1-2 min. Igen har vi ikke bemærket nogen effekt på transformation sats at bruge disse strategier. De mest effektive faktorer imidlertid viste sig at være ved hjælp af sunde planter på de korrekte blomst etaper, og ved hjælp af den bedste Silwet-77 koncentration. Vi bemærkede, at to dypning intervaller, arbejder eller anden måde bedre end en gang, selv om en gang dypning også fungerer.

Ændring af denne protokol kan opnås ved reducing den Silwet-77-koncentration til så lidt som 0,003% i det andet eller tredje dypning. Da Silwet-77 er giftigt, for høj koncentration resulterer i blomsterne udvikler dårligt, hvilket resulterer i ingen frøudbytte. Den dypning frekvens kan reduceres til én, med den anden eller tredje begivenheder fjernes, hvis planterne ikke ser sundt og knopperne ikke udvikler godt.

En væsentlig begrænsning ved denne teknik er det lave antal af blomster fremstillet af hør, det begrænsede antal af frø opnået fra hver blomst, og den lange levetid af hør. Det tager 6 - 8 uger frø såning til at have de primære knopper klar til den første dypning og yderligere 8-10 uger efter dypning for at komme til T1 generation. I alt en række af 5 - der er behov for 6 måneder til opnåelse af T1 generation. I modsætning til andre plantearter, der blomstrer helst tidspunkt af året, nogle hørsorter blomst bedre på bestemte tidspunkter af året. Så tankevækkende planlægning for denne teknik er vigtig.

Agrobacterium - medieret plantetransformation via Floral dip er en anvendelig og effektiv metode til hør transformation og kan anvendes til at erstatte de tidligere anvendte teknikker for hør transformation. De ændringer af blomster-dip metoden i denne protokol finder anvendelse til brug med andre plantearter, og ikke begrænset til hør.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)
5" pots
Potting soil
Greenhouse with appropriate light setting
Thermocycler
Agarose gel electropheresis equipment
Digital imaging setup
Silwet-77 LEHLE SEEDS VIS-01 Toxic, wear gloves
GoTaq Green Master Mix Promega Part# 9PIM712
Terra PCR Direct Polymerase Mix Clontech 639270
Binary vector PRI 909 Takara 3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E Takara 9115
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4595-01
Sucrose Fisher Scientific
Electroporator and cuvettes Bio-Rad 165-2092
Shaker
Spinner
Plastic wrap and aluminum foil wrap
speedSTAR DNA polymerase Takara RR070A/B
QlAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAGEN plasmid mini kit Qiagen 12123
SalI-HF enzyme NEB R3138S
SacI-HF enzyme NEB R3156S
T4 DNA ligation kit NEB M0202
Murashige Skoog Sigma M5524
Agar Fisher Scientific A360-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
  2. Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
  3. Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
  4. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (6), 735-743 (1998).
  5. Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
  6. Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
  7. Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2, (16), (2006).
  8. Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
  9. Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
  10. Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11, (3), 178-183 (2012).
  11. Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22, (6), 531-541 (2000).
  12. Yasmeen, A., et al. In Planta transformation of tomato. Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).
  13. Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
  14. Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics