원격 사지 허혈 양상 : 설치류에 신경 기술

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Published 6/02/2015
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Medicine

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Summary

원격 허혈 (RIP)의 손상 스트레스에 대한 조절 조직의 방법이다. 우리는 5-10 분간 혈압계 커프를 팽창하여, 뒷다리에서 원격 허혈 방법을 확립했다. RIP의 신경 보호 기능은 설치류에서 망막 변성의 모델에서 입증되고있다.

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Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (100), e52213, doi:10.3791/52213 (2015).

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Abstract

치사 허혈는 영향을받는 조직의 내생 적 메커니즘의 상향 조절을 통해 이후, 더 심한 허혈에 대한 조직을 보호합니다. 치사 허혈은 원격 조직에서 보호 메커니즘을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 포유 동물의 뒷다리에 허혈 (5 ~ 10 분)의 짧은 기간은 뇌, 폐, 심장, 망막의 자기 보호 반응을 유도한다. 효과는 원격 허혈 (RIP)로 알려져있다. 이는 생명 유지 기관을 보호 유망한 치료 방법이며, 심장 및 뇌 손상에 대한 임상 실험하에 이미. 쥐의 특히 뒷다리 - - 허혈이 책은 사지를 만드는 제어, 최소 침습적 방법을 보여줍니다. 인간 신생아에서 사용하기 위해 개발 혈압계는 혈압 설명서에 접속 뒷다리의 상부 주위에 160 mmHg의 압력을 적용하기 위해 사용된다. 피부 온도를 검출하기위한 프로브는 ischemi을 확인하는 데 사용되는레그 동맥 압력 유도 폐색에 의한 피부 온도의 저하와 커프스의 방출을 따르는 온도 상승을 기록하여. RIP의이 방법은 밝은 빛에 의한 손상과 변성에 대한 쥐의 망막에 대한 보호를 제공한다.

Introduction

대부분의 생존, 아마도 모든 대사 스트레스에 직면 조직 치사 허혈 1,2- 주기로 사전 조절함으로써 개선 될 수있다. 실용적인 측면에서 허혈 (IP)은 조직의 경험 등 후속 허혈성 모욕으로 더 심한 스트레스, 전 치사 허혈 조직의 노출이다. 동물 모델에서 IP는 뇌, 망막, 심장과 폐 3-6에 눈에 띄는 보호 기능을 제공합니다. 대응하여, 뇌졸중 환자에서 관찰은 이전 일과성 허혈 발작과 임상 결과 더 -7,8- 사이의 링크를 보였다. IP는 또한 비 허혈성 손상 (9)에서 망막 광 수용체를 보호합니다.

다양한 조직 및 부상의 IP의 효과는 모든 조직에 존재하는 세포 생존의 타고난 메커니즘을 활성화하는 것을 의미한다. 심근 허혈은 상향 조절을 통해 보호 효과가 제안되었다아데노신의 방출을 통해 또는 미토콘드리아 ATP 10,11 칼륨 채널의 개구를 통해 다수의 대사 경로를 조절하는 것으로 알려져 저산소증 유도 성 인자 (HIF)의. 아데노신 릴리스와 ATP의 칼륨 채널은 현재까지 허혈성 조절의 신경 메커니즘에 대한 연구가 안티 흥분 독성 (excitotoxicity), 항 세포 사멸 및 항 염증 경로 (12, 13)에 대한 수정에 초점을 맞추고있다, 뇌허혈에 연루되어 있지만. 전반적으로, 신경 세포를 보호하는 허혈성 컨디셔닝 분자 프로세스 이해가 제한된다.

원격 허혈 양상 시도는 덜 중요한 조직에 허혈을 생성하여 먼 매우 중요한 장기 (심장, 뇌, 폐)를 상태로. 뒷다리를 사용하여 원격 허혈 (RIP)은 뇌졸중 14-17의 설치류 모델에서 신경 것으로 입증되었다. 우리에 의해 기술 된 방법은 간단하고 신뢰할 수있는 비 침습적 PROT를 제공RIP를 유도 ocol.

RIP 프로토콜의 대부분은 상부 뒷다리에 위치한 대퇴 동맥을 용이하게 식별 및 수술 클램핑 지혈대 애플리케이션에 액세스 할 수있는 것으로 추정하기 때문에, 뒷다리를 포함한다. 뇌 및 피부 보호의 연구 침습 사지 허혈 연구에서 허혈 사타구니 인대에서 대퇴 동맥을 분리하고 대퇴 동맥 2,15,18 클램핑에 의해 유도된다.

사지 중있는 절삭이나 대퇴 동맥 클램핑으로 인한 허혈은 펄스의 감소, 감소 산소화 및 피부 온도의 저하를 포함 사지에서의 변화에​​ 의해 확인되었다. 원격 허혈은 레이저 도플러 또는 도플러 초음파 17-19을 사용하여 펄스의 손실에 의해 확인 될 수있다. 피부 온도는 관계 20,21 비선형이지만 도플러 대안으로 사용될 수있다. 정확한 온도 기록은 실험실과 캔의 흔한쉽게 원격 허혈성 연구에 혼입 될 수있다.

수술을 클램핑하는 대퇴 대안 지혈대를 사용하여 허혈의 유도이다. 지혈대 응용 프로그램은 선박 클램핑 달성에 필적 허혈을 생산; Kutchner 등. 비 침습적 지혈대에 클램핑 침습 대퇴 동맥을 비교하고 두 방법 피변 허혈 (18)의 성형 모델 사지 혈류 감소 피부 손상을 중지하였습니다. 다리 또는 팔 하나를있는 절삭 및 수축기 혈압 위의 커프 압력을 제기하는 돼지와 인간 17,19,22 허혈성 손상에 대한 보호 것으로 밝혀졌다.

다른 지혈대는 허혈성 혈압 커프 또는 탄성 밴드 17,22,23의 사용을 포함 원격 유도에 접근한다. 그러나, 허혈을 유도하는 탄성 밴드를 사용하는 방법은 안전하지 않은, 압력의 비 조절 양에 잠재적으로 상승시켜주는500 mmHg의 이상 압력 상승과 사지는 인간 (24)에 기록된다. 또한, 탄성 밴드를 사용하지 허혈은 에반스 블루 염료, 근섬유 투과성 (25)의 생체 마커에 의해 평가로, 밴드 (23)의 제거 다음 쥐의 근육 손상으로 이어집니다. 대조적으로, 지혈대에 제어 압력의 전달은 혈압계 17,19,22,26 접속 혈압계를 사용하여 달성 될 수있다.

본 연구에서는, 감광체 변성 광 손상 모델은 원격 허혈의 신경 보호 효능을 입증하기 위해 사용되었다. 원격 허혈 가벼운 부상 직전 유도, 망막 기능 검사에 의해 확인으로 후속 광 수용체의 변성을 방지했다. 첨부 된 동영상은 비 침습 원격 허혈의 적용을 설명한다.

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Protocol

윤리 문 : 프로토콜은 5657 # AEC 시드니 대학의 동물 관리 가이드 라인을 따른다. 마취 동물 윤리위원회 (시드니 대학, AEC # 5657)에 의해 승인되었다.

1. 장비 준비

  1. 실시간 피부 온도 추적을 사용합니다. 컴퓨터에 스위치, 데이터 수집 하드웨어.
  2. 열기 온도 레코딩 소프트웨어 및 온도 ° 30 ~ 35 사이의 C로 설정하고 매 100 밀리 초에 샘플링 주파수를 조정합니다.
  3. 옵션 : 코어 온도를 보장하기 위해 삽입 직장 온도계가 37.5 ° C에서 안정적으로 유지.

수동 혈압계 2. 교정

  1. 250~550그램 쥐에 대한 크기 2 커프를 sphygmomanometer.Use하는 신생아 팔 커프를 연결합니다. 어댑터는 혈압계 커프에 튜브를 연결하는 것이 필요할 수있다.
  2. 하나의 공기 방출 밸브를 느슨하게하거나 적응로부터 커프 튜브를 분리하여 커프를 수축나. 더 압력을 확인하지하면 튜브에 남아 및 압력계의 바늘은 타원형 / 사각형 안에 제로에 달려있다.
  3. 배관, 압력계와 팔목 사이의 압력을 확인합니다. 이 압력계 100 mmHg로 표시 될 때까지 인플레이션 전구의 부드러운 펌프 커프를 부풀려. 압력이 일정하게 유지 확인. 천천히 공기 방출 값을 개방함으로써 커프를 수축.

3. 동물 준비

참고 : 어두운 적응을 필요로 빛 부상을 받아야하는 원격 허혈 전날 밤입니다 동물. 가벼운 손상을받은 동물은 어두운 양육 (12 시간 빛을 : 어두운주기 (5 룩스)) 필요

  1. 깨어 또는 anesthetised 설치류 중 하나에서 원격 허혈을 수행합니다. 동물이 건강한 근육이 있는지 확인합니다. 적절한 근육의 존재가 확인하기 위해 위 뒷다리를 곤란하여이를 확인합니다. 가벼운 부상에 대한 RIP에 의한 보호는 생후 6 개월까지 앉아있는 쥐에서 테스트되었습니다.
  2. R에 대한 Anesthetised 준비IP
    1. 60 ㎎ / ㎏ 케타민 5 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 쥐를 주입한다. 다리 연장하고 다리의 하부에 피부를 집어 마취 깊이를 확인한다. 이 깊이 anesthetised 경우 동물은 더 반사가 없습니다. 마취 동안 각막 건조를 방지하기 위해 인공 눈물을 적용합니다.
    2. 열 패드 또는 37.5 ° C의 일정 체온을 유지하기 위해 온수 배관을 순환하는 하나의 래트를 놓는다. 낮은 사지 '발 패드면이 위를 향하도록하여 발생하기 쉬운 위치에 쥐를 놓습니다. 어느 쪽의 오른쪽 또는 왼쪽 사지 원격 허혈을 거칠 수있다.
  3. RIP 깨어 준비
    참고 : 동물 실험 두 사람이 필요합니다 잠에서 깨어. 한 사람이 동물을 억제하고, 두 번째 사람은 수동 혈압계를 운영하고 있습니다. 실험자는 구속 핸들러에 부상의 위험을 증가함에 따라 절차를 수행 할 자신감이 있어야합니다. 원격 허혈을받은 쥐들은 T를 조절해야합니다O 설명서를 구속. 직관적 인 가이드 라인에 따라 수동 구속은 주에 걸쳐 5 분에서 최대 30 초에서 진행을해야합니다. 수동 구속에 순응하지 못하는 겁 많은 동물이 깨어 실험에서 제외되어야한다. 마지막으로, 수동 구속 정확하게 RIP 연구 결과를 해석하는 데 사용해야합니다 동물에게 스트레스 (잠재적으로 연구에 교란을 소개)와 가짜 코호트 (염증없이 커프의 배치)을 일으킬 가능성이있다.
    1. 15cm X 30-50cm의 조각으로 수건을 잘라 뒷다리의 상단에 머리를 커버, 쥐의 척추에 수직 짧은 가장자리를 놓습니다.
    2. 쥐의 몸통 아래의 짧은 쪽을 단단히 감싸과 수건의 나머지 긴 가장자리 쥐를 포장하기 시작합니다. 앙와위에서 팔 아래 포장 동물을 고정합니다. 쥐가 왼쪽 팔에서 개최되는 경우, 수건에서 쥐의 오른쪽 다리를 무료로 제공됩니다.

4. 응용 프로그램 OF 피부 온도 프로브

  1. 허혈를 받아야하고, 발바닥의 피부 프로브를 배치하는 것입니다 쥐의 다리를 확장 할 수 있습니다. 온도 프로브와 피부 사이의 접촉을 극대화하기 위해 피부 프로브를 배치합니다. 단단히 발바닥에 프로브를 밀어 종이 테이프와 프로브를 부착합니다.
  2. 온도 레코딩 소프트웨어에 온도를 추적하여 피부 프로브 위치를 확인하십시오. 피부 온도는 30-34 ° C의 사이이며 안정적으로 유지 있는지 확인하십시오. 1-2 분 동안 피부 온도를 추적. 온도가 불안정하거나 30 ° C 이하이면 피부 프로브를 조정한다.

5. 원격 허혈

  1. 커프를 수축 및 공기압 밸브가 폐쇄되어 있는지. 다리를 확장하고 느슨하게 상단 뒷다리에 커프를 둘러싸. 위치에 느슨하게 커프를 유지하기 위해 다리와 낮은 숫자를 확장하는 집게 손가락과 엄지 손가락을 사용합니다.
  2. 깨어 동물 incre 160 mmHg로, 그리고에 anesthetised 동물의 커프 압력을 올립니다180 mmHg로에 커프 압력 ASE.
    주 : 래트 anesthetised 혈압 120-140 mmHg의 범위 때 의식 160 mmHg로 상승한다. 정확한 압력에 도달하면 타이머와 발 온도 녹음을 시작.
    참고 : 발 온도가 일정한 압력의 5 분 후 2 ° C에 의해 드롭해야한다.
  3. 허혈에 걸쳐 동물의 "무릎"위의 커프의 위치를​​ 유지합니다. 커프 압력은 몇 분 후 드롭을 시작합니다, 또는 쥐의 사지는 이동합니다.
  4. 반복적으로 펌핑의 원하는 커프 압력 반복적 인 짧은 버스트를 유지하기 위해 짧은 버스트로 인플레이션 전구 펌프
  5. 원격 허혈 5 분 내지 15 일 동안 연속적으로 전달 될 수있다. 허혈 재관류 프로토콜은 중간에 5 분 재관류 5 분 허혈이 기간을 포함한다.
  6. 공기압 밸브를 풀어 커프 압을 수축. 허혈 프로 걸쳐 온도 변화를 확인로토콜. 커프를 놓습니다.
  7. 부상 실험을 계속합니다. 마취의 영향 하에서 동물을 열 패드 상에 배치 될 필요가있다. 외래까지 동물을 모니터링하기 위해 계속합니다. 동물 산책 할 때까지 하우징에 반환 할 수 없습니다.

6. 가벼운 부상 - 망막 변성 모델

  1. 다크 동물 하룻밤 (12 ~ 15 시간)을 적용. 즉시 원격 허혈 조절 또는 가짜 원격 허혈 (동물의 구속) 음식과 물과 방풍 하우징 장소 동물을 다음과 같습니다.
  2. 24 시간 동안 오전 9시에 방풍 하우징 위에있는 형광등 (1,000 LUX)에 전환합니다. 빛 노출 후 7 일 동안 순환 조명을 어둡게하는 동물을 반환합니다.

7. 후 원격 허혈 절차

  1. 전위도 (ERG)와 비전의 평가 :
    참고 : ERG 설정 및 플래시 프로토콜은 Brandli 스톤 (26)을 따랐다.
    1. 다크 하룻밤 동물을 적용 (12 ~ 15 시간). 아래의붉은 조명이 케타민과 자일 라진의 복강 내 주사 (60 ㎎ / ㎏, 5 ㎎ / ㎏, 각각)에 의해 동물을 마취 차단하여주십시오. 동형 (아트로핀 황산염 1.0 %), 각막 마취 (proxymetacaine 0.5 %).
    2. 각막 수화를 적용 (카보 머 폴리머) 눈은 각막 즉시 삭제합니다. 각막 수화를 유지하기 위해 20 분 간격으로 눈 겔을 적용한다.
    3. 안정적인 에르그 녹음을 돕기 위해 안구 주위에 느슨하게 묶여 스레드를 그립니다. 직장 프로브를 사용하여 온도를 모니터링 및 37-37.5 ℃에서 동물의 체온을 유지한다.
    4. Ganzfeld 적분 구 내부의 머리를 놓습니다.
      참고 : Ganzfeld가 눈에 LED가에서 균일 한 오순절 깜박을 제공하는 완전히 프로그램 빛 자극이다.
    5. 가볍게 각막 감동 주문품 4mm 백금 양극과 입에 삽입 2mm 직경 AG / AgCl을 펠릿 전극을 사용하여 전위도를 기록한다. 스테인리스 바늘에 양전극을 참조엉덩이에 피하 삽입.
    6. 2 kHz의 수집 속도 0.3-1,000 Hz에서 (-3 dB)의 대역 통과 설정으로 녹음 신호 (AD 악기). 안정적인 에르그 녹음 녹음을 시작하기 전에 대상에게 10 분 어두운 적응에 동물을 설립 한 후.
    7. 앞서 Brandli 스톤 (26)에 의해 설명 된 플래시 프로토콜을 따르십시오.
      1. 플래시 지속 시간을 프로그램 (우리는 깜박 기간이 1 ~ 2 밀리 초를 사용), 그리고 -4.4 로그 스코틀랜드 cd.sm -2 2.0에 자사의 강도를 설정합니다. 망막 기능을 측정하기 위해 밝은 플래시 (2.0 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2, 1 MS)를 사용합니다. 본 연구에서는 제어, 빛 부상 RIP 빛 부상 사이의 비교입니다.

8. TUNEL 분석

  1. 페노바르비탈 과다 복용 (100 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사하여 동물을 안락사. 명백히하다 눈을 4 % 파라 포름 알데히드에 고정한다.
  2. cyroprotecting 전에 PBS에 눈을 씻으십시오눈 하룻밤 자당 30 %에서 (W / V). 10월 화합물의 눈을 포함하고 저온 ​​유지 장치를 사용하여 20 μm의 시상 부분으로 잘라.
  3. Maslim 등의 프로토콜 다음 DAPI 염색과 망막 섹션에 TUNEL 분석을 수행합니다. (27)
  4. 망막의 TUNEL 카운트에 대한 형광 현미경을 사용합니다. TUNEL 세포는 외부 핵 층 (ONL)에서 기록되었다; 감광체 핵을 포함하는 망막의 최 외층. 본 연구에서는 TUNEL 수는 각 치료 그룹 (5) 눈으로, 각각의 눈에 대한 중으로 하였다.
  5. 비교 통계 그룹에 일원 분산 분석을 사용하여 제어, 가벼운 부상, 가벼운 부상 + RIP 쥐의 의미합니다.

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Representative Results

160 mmHg의 위까지 상승 혈압 커프는도 1b에 명확히 본 뒷다리 혈액의 흐름을 정지. 조직의 산소의 부족은 허혈 재관류 프로토콜 (도 2)에 대한 동물의 발 온도를 감소시키는 결과. 발 온도 (33 ° C)는 커프 (32 ° C) 수축 할 때 상승 커프 압력 상승 (31 ℃)시 코어 온도보다 낮은 안정적으로 감소했다. 단일 1,000 룩스 빛 부상은 또는 원격 허혈없이 흰둥이 쥐를 제기 어두워 전달했다. 망막 함수는 기록 전위도 (ERG)를 사용하여 평가 하였다.

Light 미사용 후도 3에 도시 된 바와 같이 ERG 광 자극에 대한 망막의 내부 및 외부로부터 발생하는 신경 세포의 전기 응답의 합이다. ERG 파형 phototransduction 인한 초기 네거티브 피크를 갖는 (최소 약 10 밀리T 플래시) 약 빛 플래시 후 80 밀리 초)이 B 파를 라 파 및 내부 망막 (최대에서 큰 긍정적 인 피크라고합니다. 일반 희미한에서 어두운 적응 에르그는 쥐가 밝은 2.0 로그 cd.sm -2 플래시 (그림 3A)에 큰 광 수용체 및 내부 망막 반응을 보였다 올렸다. 에르그 녹음 광 수용체의 손실을 반영 컨트롤 진폭 상대의 심각한 감소했다 빛 부상 다음 한 주; 그림 (b)를 참조하십시오. 허혈을 허혈 빛 부상 감광체를 보호하기 직전에 2 × 5 분의 재관류 프로토콜을 사용하여 함께 뒷다리 사전 조정. RIP 망막 전위도의 진폭은 파를 참조하십시오 (그림 3C)에 약간의 감소, 혼자 가벼운 부상보다 더 큰했다. 망막의 동결 보존 부에 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석은 RIP 확인해 수광 손상 동물에서 세포 자멸의 감소를 확인하는 의안 가짜 처리 등 부상 동물 (그림 4).

그림 1에서와 같이 뒷다리에 허혈의 유도가, 커프의 올바른 위치에 의존한다. "무릎"아래에 배치 커프 빛 부상에서 광 수용체를 보호하지 않습니다 감소 망막 전위도의 진폭에 반영된 그림 3D 참조하십시오.

결론적으로 투여 할 때 제대로 뒷다리 허혈 빛 부상에서 망막 신경 세포를 보호 할 수 있었다.

그림 1
그림 1 :. 커프 배치 및 160 mmHg로 위의 커프 압력의 효과는 (A) 커프 압력이 상승하기 전에 뒷다리와 발을 보여줍니다. (B)는 160 mmHg로 위의 커프 압력 상승하는 동안 발을 보여줍니다. "K 이상 커프스의 위치를​​ 참고 "니. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 허혈 동안 피부 온도를 감소 160 mmHg로에서 2 × 5 분의 뒷다리에 커프의 발 온도는 커프 팽창하는 동안 감소 인플레이션. (A) 2 × 5 분 RIP 발 온도 변화에 대한 그룹의 평균을 표시합니다. (B)는 2 × 5 분 허혈에 대한 추적 (° C) 대표 발 온도를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :. 24 시간 손해 망막의 광 수용체에 대한 밝은 빛에 RIP 빛 손상 쥐에 비해 망막 전위에서 입증 된 바와 같이 망막 기능을 보존 노출. 망막은 빛 자극에 전기 반응 (마이크로 볼트 [μV])로 내부 및 외부 망막의 상태를 측정합니다. 2.0 로그 cd.sm에 응답하여 정상 망막 -2 (A)에서 본 광 자극. 작은 에르그 진폭 (B)에 밝은 빛이 결과에서 광 수용체의 손상. RIP는 가벼운 부상 (C) 다음의 광 수용체를 구출 할 수 있었다. 부상 (D)에서 광 수용체를 보호하지 않습니다 RIP 동안 잘못된 커프 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4 : TUNEL + 세포 수가. 가벼운 부상, 부상 + RIP에 대한 그룹 결과를 비교하는 막대 그래프는 망막 (8,000 μm의)의 전체 범위에 걸쳐 계산 된 RIP. TUNEL + 세포와 세포 사멸의 감소를 보여줍니다. 상단 패널 : TUNEL + 세포의 그룹 평균은 RIP 처리 쥐에 대한 낮았다 (210 ± 4.9, N = 5) 혼자 빛 부상에 비해 (255 ± 10, N = 5), P <0.01, 일원 분산 분석. 손상되지 않은 망막 (표시 등 부상) 매우 낮은했다 (3.0 ± 1.4, N = 5) 사멸 세포. 우수한 가벼운 부상 망막의 (A) 대표 이미지입니다. (B) 우수한 RIP-빛 부상 망막의 대표 이미지입니다. (C) 열등한 빛 부상 망막의 대표 이미지입니다. (D) 열등 RIP-빛 부상 망막의 대표 이미지입니다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.

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Discussion

설치류 뒷다리 허혈 성공적 수동 혈압계로 유도하고 망막 광 수용체에 신경 전달 커프 하였다. 가벼운 부상 9,28에서 광 수용체의 허혈성 조절에 의한 보호와 일치 발견.

기본적으로 원격 허혈 조직에 대한 간단한 산소 부족이 발생합니다. 따라서, 원격 허혈 양상은 허혈성 조절 또는 대안이라고 허혈 내성, 저산소 전처리, 어느 정도, 무산소 운동에 많은 유사점이있다. 세포 하나가 직접 신경을 제공 또는 후속 대사 스트레스 (13)의 허용이 될 세포에 영향을 미치는 단백질, 뉴 클레오 사이드 및 전사 인자의 큰 다양성을 해제하여 허혈성 도전에 응답합니다.

문헌에서, 원격 프로토콜 허혈 기간 및 주파수 범위를 포함했다. 우리 연구실은, 10, 5 테스트했습니다정상 망막 기능 (26)에 2 × 5 분 허혈 프로토콜. 이러한 프로토콜 중 2 × 5 분 정상 쥐에서 가장 큰 에르그 진폭 변화를 생산 빛 부상의 모델에서 테스트하기 위해 선정되었다. 짧은 반복 5 분 허혈성 사건은 또한 인간에서 스트로크 재발 예방 적으로 돼지 17, 22의 실험 행정에서 경색 크기를 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 허혈의 최적 지속 시간은 사용 된 동물 모델에 의존 할 가능성이 높다. 예를 들어, 국소 허혈에 대해 경색 크기의 감소는 이상 2 × 15 분, 3 × 15 분에서 관찰 프로토콜 아니지만 5 × 3 분 프로토콜 래트 15되었다.

IP 및 허혈 손상 사이의 시간은 또한 신경 보호 효과가 고려 될 필요가있다. 두 시간 창은 IP에 의한 심장 보호로 분류되고있다. 다음은 IP와 후 0-12 시간을 발생하는 "클래식 조절"창이다IP 29 후 3~4일 발생 "두 번째 창". 초점 뇌졸중 모델에서, RIP는 고전 윈도우 및 제 2 윈도우 (15) 외부를 포함한 여러 시점에서 보호 인 것으로 밝혀졌다. 그러나, RIP 및 IP에서 신경의 기간을 비교 한 몇몇 연구가 있었다.

원격 허혈 보호를위한 또 다른 고려 사항은 부상 (전처리) 전에 적용 부상 (postconditioning) 후 여부를 포함한 에어컨의 타이밍이다. 원격 허혈 시험의 대부분의 연구가 최근 모두 대뇌 망막 신경 세포의 보호 30,31 것으로 발견 된 postconditioning에도 컨디셔닝을 사용하고있다.

요약하면, 허혈성 뒷다리에서 신경 조절의 유도 질환 모델 동물 종, 허혈의 지속 기간, 및 허혈의 타이밍에 특정한. Kaniora 등의 등의 검토. 피원격 종을 포함하여 허혈 프로토콜, RIP 프로토콜, RIP 사이트, 부상 모델 부상의 결과와 제안 된 보호 메커니즘 (32)의 다양성에 관한 추가 정보를 rovides.

뒷다리에 최소 침습 커프스 모두 깨어 RIP 가능하며 동물 체온 유지를 제공한다. 마취 된 실험에서, 동물의 체온 저체온증 않도록 유지되어야한다. 내부 온도 모니터링은 저체온증 또는 고열을받은 동물을 방지 할 수 있습니다. 저체온증과 고열 뇌졸중 모델과 가벼운 부상 33-36 모두에서 잘 알려진 프리 컨디셔닝 자극이다. 제시된 방법 조브함으로써 체온 교란을 방지 웨이크 동물에서 수행 될 수있다.

마취제는 RIP 실험에서 교란의 다른 세트를 소개 할 수 있습니다. 이소 플루 란은 ATP에 민감한 칼륨 채널 개방을 통해 심근 보호에 참여할 수 있습니다annels, 허혈성 에어컨 (37)에보고 된 유사한 보호기구. 뇌졸중 모델에서의 경색 크기를 이소 플루 란 주어진 모의 - 처리 된 동물에서 큰 상태 그대로지만, 분자 메커니즘 기본 원격 조절은 허혈성 마취제의 영향에 의해 마스크 될 수있다. 케타민, NMDA 길항제, mTOR의 경로를 활성화시키고 혈청 39-41에 BDNF 해제, 흥분 독성 뉴런을 방지 할 수있는 잠재력을 포함한 생체 내에서 보호 효과 (38)의 다수를 갖는다. 케타민은 인간의 뇌 외상 다음 신경 세포의 생존을 향상시키고 설치류 광 수용체 42,43 빛 부상을 줄이기 위해보고되었다. 웨이크 혈압있는 절삭 원격 허혈성 컨디셔닝기구에 조사 마취 교란을 방지한다.

효과적인 뒷다리 허혈은 커프의 올바른 위치에 의존, 커프 압력과 systo 위의 커프 압력 상승의 일관성감소 된 전위도 (ERG) 진폭에 반영 그림 1에서 볼 수 있듯이 LIC 혈압. "무릎"아래에 배치 커프 빛 부상에서 광 수용체를 보호하지 않습니다. 커프스의 위치에 따라 조절의 차이는 대퇴 동맥에 근육량 및 근접 다르기 쉽다. 또한, 동물의 나이, 체중, 신체 온도 및 성별에 대해 표준화되어야한다.

요약하면, 원격 근육 허혈 손상을 방지하고 깨어 마취 또는 실험을위한가요 성을 갖는 비 침습적 혈압 커프에 의해 유도 될 수있다. 원격 허혈 양상은 신흥 신경 전략이며,이 프로토콜은 메커니즘과 응용 프로그램에 추가 연구를 가능하게 할 것이다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer Welch Allyn DS56 Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack Welch Allyn 5082-102-1 Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor Welch Allyn 5082-178 Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod AD Instruments ML 309 skin tempertature unit
Skin temperture probe AD Instruments MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Towel optional: awake remote ischemia
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) Abbot Animal Health 05260-05 optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia

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References

  1. Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4, (1), 40-50 (2013).
  2. Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32, (5), 851-859 (2012).
  3. Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35, (6), 1264-1273 (2002).
  4. Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74, (5), 1124-1136 (1986).
  5. Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29, (9), 1937-1950 (1998).
  6. Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39, (5), 777-785 (1998).
  7. Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35, (3), 616-621 (2004).
  8. Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30, (9), 1851-1854 (1999).
  9. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  10. Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890, (1), 118-129 (2001).
  11. Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70, (2), 212-221 (2006).
  12. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (10), 4666-4670 (1995).
  13. Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26, (5), 248-254 (2003).
  14. Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33, (5), 514-519 (2011).
  15. Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151, (4), 1099-1103 (2008).
  16. Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
  17. Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123, (7), 714-721 (2011).
  18. Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109, (7), 2398-2404 (2002).
  19. Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106, (23), 2881-2883 (2002).
  20. Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5, (2), 211-230 (1965).
  21. Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94, (10), L78-L80 (2008).
  22. Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79, (18), 1853-1861 (2012).
  23. Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42, (10), 921-929 (2009).
  24. Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A, (6), 865-868 (1986).
  25. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200, (1), 69-79 (2002).
  26. Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55, (4), (2014).
  27. Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38, (9), 1667-1677 (1997).
  28. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  29. Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16, (3-4), 251-254 (2011).
  30. Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42, (2), 439-444 (2011).
  31. Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50, (1), 63-74 (2006).
  32. Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84, (4), 445-458 (2007).
  33. Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29, (10), 2171-2180 (1998).
  34. Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347, (8999), 422-425 (1996).
  35. Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241, (4874), 1817-1820 (1988).
  36. Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24, (7), 730-735 (2002).
  37. Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283, (1), H61-H68 (2002).
  38. Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
  39. Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18, (4), 479-483 (1993).
  40. Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11, (10), 666 (2010).
  41. Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (1), 140-144 (2008).
  42. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5, (10), 747-757 (2004).
  43. Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).

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