المستمدة الشبكية الظهارة الصبغية (RPE) من المستحثة متعددة القدرات الجذعية (آي بي إس) الخلايا عن طريق أحجام مختلفة من الهيئات مضغي

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

والهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات لاستخلاص الظهارة الشبكية الصباغ (RPE) من الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا باستخدام أحجام مختلفة من الهيئات مضغي الشكل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا التي يسببها هي نوع من الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة عن طريق إعادة برمجة خلايا بالغة مع العوامل الخارجية 1. في المقابل، الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، ونوع آخر من الخلايا الجذعية المحفزة، يتم إنشاء من الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة 2-3. وعلى الرغم من أصولها المختلفة، خلايا الجذع والمجالس الاقتصادية والاجتماعية قابلة للمقارنة في قدرة غير محدودة لتكرار في التجارب المختبرية وقدرتها على التمايز إلى أي نوع من الخلايا 4-5. هذه الخصائص من خلايا الجذع جعلها المرشحين مثالية لتطبيقات في شخصية الطب التجديدي. وتتركز الجهود البحثية الأخيرة على تطوير بروتوكولات التمايز قوية لإنتاج خلايا بالغة متخصصة بما في ذلك الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) 6-11.

لالتطبيقات السريرية المحتملة للخلايا الجذع المشتقة، والتمايز الموجهة لهذا النوع من خلية معينة أمر ضروري. وهناك طرق مختلفةنشرت للتمايز موجهة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية والجذع خلايا كلا في RPE التي تختلف اختلافا كبيرا في كفاءتها 6-7، 12-16. ونحن ما زلنا لا نعرف الكثير من الأحداث الجزيئية التي تتحكم في مصير خلية / الأنسجة أثناء تطوير أو التمايز. في السنوات الأخيرة، بذلت جهود لتطوير بروتوكول التمايز التي يمكن أن تحاكي التطور الجنينى قدر الإمكان. خلال مرحلة الكيسة الأريمية، والسكان غير الملتزم به والخلايا الجذعية هي معا في المكروية ثلاثية الأبعاد. لذلك، طبقت استراتيجيات مختلفة لجعل خلايا ESC / IPS تجميعها معا وتنمو لهم في ثلاثة أبعاد. وتسمى هذه المجاميع الخلايا الجذعية الهيئات مضغي الشكل (EBS). وقد أظهرت الدراسات أن EB تمايز الخلايا الجذعية تحاكي المرحلة المبكرة من تطور الجنين ويمكن أن تعطي بشكل عفوي أدى إلى الأديم الباطن البدائي على سطحه الخارجي. وفي وقت لاحق، كما تقدم EB التنمية، الظواهر خلية متمايزة من كل الأنساب الجرثومية الثلاث تظهر 17-18. عشرerefore، جذبت EBS بروتوكولات التمايز القائم على الكثير من الاهتمام لفي المختبر تمايز الخلايا ESC / الجذع وتكون مرشحا جيدا لتوليد RPE من الخلايا الجذعية المحفزة (13).

EBS يمكن أن يتم باستخدام عدة أساليب من خلايا ESC / IPS. في البداية، أدلى EBS عن طريق كشط قبالة المستعمرات ملتصقة والحفاظ عليها في الثقافة تعليق غير ملتصقة. ومع ذلك، فإن هذا النهج غلة السكان غير متجانسة من EBS الذي يسبب انخفاض التكاثر. شنقا انخفاض زراعة الخلايا وmicrowell تشكيل EBS المعتمدة على تقنيات الشعبية الأخرى لتشكيل EBS التي تسفر EBS متجانسة من الأحجام المحددة التي هي تكرار للغاية. وعلاوة على ذلك، يمكن للتقنية microwell تسفر عن عدد كبير من المجاميع مع أقل جهد.

وينظم تمايز الخلايا داخل EBS من متعدد من العظة morphogenic من المكروية خارج الخلية والخلايا. وعلى النقيض من التمايز في مونشكل olayer، EBS توفير منصة لتجميع معقدة من الخلايا والإشارات بين الخلايا أن تحدث 17. ومن المثير للاهتمام، لوحظ عدد من الخلايا الجذعية المحفزة التي استخدمت لصنع EBS الفردية للتأثير على مصير الخلايا. على سبيل المثال، في دراسة التمايز المكونة للدم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان، لوحظ أن 500 خلية EB الترويج التمايز نحو الأنساب النخاعي في حين دفعت 1،000 خلية EB نحو محمر النسب 20. وفي دراسة أخرى، فضلت EBS أصغر الأديم الباطن التمايز في حين EBS أكبر روجت نحو العصبية الأديم الظاهر التمايز 11، 17.

هذه الدراسات السابقة تشير بقوة إلى أن عدد الخلايا ESC / IPS المستخدمة لجعل EBS الفردية تؤثر على EBS التمايز القائم على أي من أنواع الخلايا. ومع ذلك، على حد علمنا، لا توجد دراسات الحالية التي توضيح تأثير حجم EBS في نزوعها إلى التفريق نحو RPE. والهدف من هذه الدراسة هو لتوصيف تأثيرحجم EB على يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) خلايا - الظهارة الصبغية الشبكية (IPS-RPE) التمايز وتحديد عدد الخلايا الأمثل لجعل EBS للتمايز الموجهة نحو RPE النسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف الثقافة ومركبات الثقافة

  1. إعداد خالية من تغذية الخلايا الجذعية مستنبت بإضافة 100 مل من 5X المصل خالية ملحق إلى 400 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة القاعدية. المتوسط ​​مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع وعند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  2. إضافة 10 ميكرومتر حل المرتبط رو، ملفوف لفائف تحتوي على بروتين كيناز (روك) المانع (Y-27362) لمتاحة تجاريا الجسم مضغي الشكل (EB) تشكيل المتوسطة.
  3. إعداد التمايز المتوسطة بإضافة 0.1 ملم β المركابتويثانول، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 مم L-الجلوتامين، و 10٪ استبدال المصل خروج المغلوب (KSR) و 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لDulbecco لتعديل النسر متوسطة / المغذيات خليط F-12 (DMEM / F12).
  4. إعداد IPS-RPE المتوسطة عن طريق إضافة 1X N1 ملحق، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 250 ميكروغرام / مل التورين، 13 نانوغرام / مل triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم، / مل الهيدروكورتيزون 20 نانوغرام، 5 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) <سوب> 21 إلى الحد الأدنى الضروري المتوسطة النسر (MEM). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
  5. إعداد triiodo-L-ثيرونين حل الصوديوم الأسهم الملح. حل 1 ملغ من triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم في 1 N هيدروكسيد الصوديوم من قبل يحوم بلطف. إضافة 49 مل من MEM لجعل 50 مل من 20 ميكروغرام / مل من triiodo-L-ثيرونين ملح الصوديوم. إعداد مأخوذة وتجميد في -20 ° C لحين الحاجة إليها. استخدام حجم مناسب لتحقيق التركيز المطلوب في مستنبت النهائي.
  6. إعداد الهيدروكورتيزون حل الأسهم. ذوبان 1 ملغ من الهيدروكورتيزون في 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ عن طريق الإثارة لطيف. إضافة 19 مل من MEM لجعل 20 مل من 50 ميكروغرام / مل حل الأسهم الهيدروكورتيزون. قسامة والتجميد في -20 ° C لحين الحاجة إليها. استخدام حجم مناسب لتحقيق التركيز المطلوب في مستنبت النهائي.
  7. يعد حل عمل dispase من 1 ملغ / مل في DMEM / F12.
  8. إعداد مصفوفة المغلفة لوحات
    1. إعداد مصفوفة البروتين المستخرج من Engelbreth-هولم-سرب (EHS) مذكرة التفاهمخلايا ساركوما حد ذاتها في DMEM / F12 إلى 0.08 ملغ / مل. معطف كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 1 مل من محلول المصفوفة. احتضان لوحات مغلفة في RT لمدة 1 ساعة.
    2. بعد حضانة 1 ساعة، نضح الزائد DMEM / F12. إضافة 0.5 مل من خالية من تغذية الجذعية خلية ثقافة المتوسط ​​لمنع جفاف الآبار. لوحات مصفوفة المغلفة جاهزة للاستخدام.
  9. إعداد لوحات microwell، وذلك بدهن كل جيدا مع 2 مل من DMEM / F12. إزالة DMEM / F12 وإضافة 0.5 مل من تشكيل EB المتوسطة تستكمل مع روك المانع إلى كل بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2،000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة أي فقاعات الهواء.
  10. إعداد FACS العازلة تلطيخ عن طريق خلط 2٪ FBS، وبنسبة 0.09٪ أزيد الصوديوم في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضبط العازلة لدرجة الحموضة 7.4.
  11. إعداد التربسين حل تحييد بإضافة 10٪ FBS لDMEM / F12.

2. الجذع الثقافة

  1. قبل الجذع البذر الخلية، دافئة خالية من تغذية الجذعية خلية ثقافة المتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية، ويكون أماهتريكس المغلفة لوحات جاهزة.
  2. ذوبان الجليد بسرعة الخلايا IMR90-1 الجذع في 37 ° C حمام الماء. ثم إزالة القارورة-البرد من حمام الماء ومسح القارورة مع الايثانول 70٪. نقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي باستخدام ماصة 2 مل لتقليل كسر كتل الخلية.
  3. إضافة 5 مل باب الحارة خالية من تغذية الخلايا الجذعية مستنبت للخلايا قطرة قطرة وتخلط بلطف. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة طاف.
  4. و resuspend بعناية كتل الخلايا في 2 مل من خالية من تغذية الخلايا الجذعية مستنبت والبذور كتل الخلايا في الآبار لوحة المغلفة المصفوفة. وضع لوحة في حاضنة C 37 درجة مع 5٪ CO 95٪ الرطوبة.
  5. تغيير الجذع خلية ثقافة المتوسط ​​يوميا. مراقبة مستعمرات غير متمايزة خمسة إلى سبعة أيام بعد البذر. التحقق من وجود مستعمرات غير متمايزة التي هي على استعداد للمرور (المستعمرات مع مركز كثيف) تحت المجهر الضوئي.

3. الركض من خلايا الجذع

  1. لمرور الخلايا المحفزة قبل البداية، تدفئة حل dispase، DMEM / F12 وخالية من وحدة التغذية الجذعية خلية ثقافة المتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. قبل الركض الخلايا الجذع، وإزالة أي مجالات التمايز عن طريق كشط المنطقة والشفط والمتوسطة. شطف بعناية خلايا الجذع مع 2 مل DMEM / F12.
  3. إضافة 1 مل من 1 ملغ / مل dispase إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. نضح dispase وشطف بلطف المستعمرات الخلية مع 2 مل من DMEM / F12 مرتين. بعد الشطف، إضافة 2 مل من خالية من تغذية ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة إلى كل بئر.
  4. باستخدام ماصة 5 مل كشط بلطف المستعمرات من لوحة لتشكيل كتل الخلية. نقل كتل خلية منفصلة لأنبوب مخروطي 15 مل. إضافة كافية خالية من تغذية ثقافة الخلية الجذعية متوسطة إلى البذور مرور القادم من الخلايا.

4. توليد EBS عن طريق Microwell لوحات

  1. إعداد تعليق خلية واحدة من خلايا الجذع
    1. إزالة جامعة المدينة العالميةمتر من خلايا الجذع وشطف خلايا الجذع مع 2 مل من DMEM / F12. إضافة 750 ميكرولتر من accutase إلى خلايا الجذع في كل بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للخلايا لفصل من لوحة (حوالي 5-10 دقيقة).
    2. استخدام ماصة لفصل بلطف أي الخلايا المتبقية وفصل أي الخلايا المتبقية على سطح اللوحة. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. شطف لوحة مع 5 مل من DMEM / F12 والجمع بين تشطف DMEM / F12 مع الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة أي كتل الخلايا المتبقية ممكنة.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT لإزالة accutase. resuspend الكرية خلية في EB تشكيل المتوسطة بحيث تركيز الخلية حوالي 0.5-1.0 × 10 7 خلية / مل.
    4. تحديد عدد خلايا قابلة للحياة عن طريق عد الخلايا مع التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
  2. Adjustinز كثافة الخلايا في microwells لتشكيل EBS التي تسيطر عليها حجم
    1. ضبط عدد من الخلايا لكل بئر من لوحة microwell لتوليد أحجام EB المطلوب. إضافة الخلايا إلى microwells من لوحات أعدت في الخطوة 1.9، بالتساوي توزيع الخلايا عن طريق pipetting بلطف الخلايا عدة مرات.
      ملاحظة: عدد الخلايا المطلوبة لكل بئر = المرجوة عدد الخلايا في EB × عدد microwells لكل بئر.
    2. ضبط تشكيل المتوسطة EB تستكمل مع روك المانع في الآبار إلى الحجم النهائي من 2.0 مل. إعادة توزيع الخلايا عن طريق pipetting بلطف كل بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحات microwell في 100 x ج لمدة 3 دقائق. وضع لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة.
  3. EBS الحصاد من لوحات microwell
    1. حصاد EBS من microwells من قبل pipetting المتوسطة في البئر صعودا وهبوطا مع 1 مل micropipettor لإزالة معظم EBS. تمرير تعليق EB من خلال خلية 40 ميكرون مقلوبمصفاة على رأس أنبوب مخروطي 50 مل لإزالة الخلايا واحد.
    2. غسل لوحة microwell 5 مرات مع 1 مل من DMEM / F12 لإزالة كافة EBS. جمع يغسل وتمر عبر مصفاة خلية مقلوب. تحويل مصفاة الخلية من الناحية اليمنى تصل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. جمع EBS بغسل مع EB تشكيل المتوسطة. عدد EBS لتحديد العائد.

5. تصفيح EBS وبدء التمايز

  1. لوحة للEBS على مصفوفة البروتين المغلفة ست لوحات جيدة (كما في الخطوة 1.8.1) في كثافة <1،000 EBS / جيد في EB تشكيل المتوسطة بالإضافة إلى 10 ميكرومتر روك المانع. احتضان EBS عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة.
  2. 24 ساعة بعد EB الطلاء، مع استبدال التمايز المتوسطة لبدء التمايز. تغيير نصف المتوسط ​​التمايز كل يوم حتى يتم جمع الخلايا لمزيد من التحليل.
  3. جمع العينات في يوم 6، 17، 29 و 60 لإجراء RT-PCR، IMMunocytochemistry وFACS للتحقق من صحة التعبير عن الجينات RPE مميزة والبروتينات.

6. استخراج الحمض النووي الريبي وPCR

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من عينات EB وفقا لتعليمات المنصوص عليها في عدة متاحة تجاريا. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام معمل.
  2. أداء النسخ العكسي على 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لRNA المتاحة تجاريا ل[كدنا عدة نسخة عكسي.
  3. أداء PCR مع 10 نانوغرام من [كدنا] باستخدام بادئات التالية (الجدول 1) بتركيز 10 ميكرومول / 10 نانوغرام من [كدنا]. تعيين PCR على النحو التالي: تفسد الحمض النووي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع تضخيم 35 دورات على 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها دورة النهائية في 72 ° C لمدة 10 دقيقة. تشغيل المنتج PCR على 1٪ الاغاروز هلام.

7. كيمياء سيتولوجية مناعية

  1. غسل EBS مع برنامج تلفزيوني مرتين في RT. إصلاح EBS في RT في 4٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقيقة. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في RT. مخزن العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى استخدامها لتلطيخ.
  2. في يوم تلطيخ، وعلاج الخلايا ثابتة مع تثبيت وpermeabilization الكواشف. احتضان هذه العينات مع عرقلة الحل (10٪ مصل الماعز في حل permeabilization) لمدة 1 ساعة على RT.
  3. أداء كيمياء المناعة في 10٪ مصل الماعز في حل permeabilization باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية في التخفيفات المبين: مكافحة Pax6 (01:10)، ومكافحة RX (1: 200)، ومكافحة MITF (01:30)، ومكافحة ZO1 (1: 100). احتضان عينات مع الأجسام المضادة O / N المقابلة في 4 درجات مئوية.
  4. اليوم التالي، وإزالة الأجسام المضادة الأولية من الخلايا وشطف العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان عينات مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق لمدة 1 ساعة على RT.
  5. إزالة الأجسام المضادة الثانوية من الخلايا وشطف العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. تركيب غطاء ينزلق على الشرائح الزجاجية مع دابي تحتوي على تصاعد المتوسطة والسماح عينات لضبط O / N في غرفة مظلمة.استخدام المجهر مضان لتصور تلطيخ.

8. تلطيخ لتحليل FACS

  1. غسل EBS مثقف في برنامج تلفزيوني مرتين. احتضان EBS مع 0.5 مل من 0.25٪ التربسين لمدة 5-10 دقائق لجعل تعليق خلية واحدة. تحييد التربسين مع الحل التربسين تحييد (1 مل / جيد).
  2. نقل تعليق خلية واحدة إلى 15 مل أنبوب مخروطي وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. تجاهل طاف وإضافة 10 مل من DMEM / F12 إلى الخلايا في الأنبوب. عكس بلطف لمزج الخلايا. الطرد المركزي في 600 × ز. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend الخلايا في FACS العازلة تلطيخ.
  4. عد العدد الكلي للخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. بعد الطرد المركزي تجاهل طاف. إصلاح الخلايا على الفور بإضافة 0.5 مل من 4٪ امتصاص العرق. مزيج جيد من قبل vortexing لطيف. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالةطاف. دوامة برفق لتعطيل بيليه الخلية. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول permeabilization المبردة. دوامة برفق لخلط واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالة طاف. إضافة 3 مل من FACS العازلة تلطيخ و resuspend. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. resuspend الخلايا في FACS العازلة تلطيخ بتركيز نهائي من 5 × 10 6 خلية / مل.
  7. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية (0.5 × 10 6 خلايا) لكل أنابيب microfuge وإضافة حجم الموصى بها من الأجسام المضادة الأولية. لPax6، إضافة 5 ميكرولتر من PE مكافحة Pax6 في 100 ميكرولتر من التعليق الخلية. لMITF، إضافة 5 ميكرولتر من مكافحة MITF في 100 ميكرولتر من التعليق الخلية.
  8. خلط واحتضان عند RT لمدة 60 دقيقة. إضافة 3 مل من FACS العازلة تلطيخ. خلط وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف وتكرار 8.16 لمرتين إضافية.
  9. لMITF تلطيخ، واحتضان الخلايا في antibo الثانويدى والماعز لمكافحة فأر اليكسا فلور 488 في التخفيف من 1: 2،000 لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. لPax6 تلطيخ، وتجنب هذه الخطوة.
  10. غسل الخلايا مع 5 مل من FACS العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر العملية مرتين أخريين.
  11. resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من FACS العازلة تلطيخ ودوامة بلطف لعرقلة بيليه الخلية. عينات جاهزة للتحليل تدفق cytometric.

9. IPS-RPE العزلة والثقافة

  1. في يوم 29، وقطع بعناية حول المستعمرات المصطبغة مختارة من لوحة الثقافة باستخدام ماصة غيض 200 ميكرولتر. نقل المستعمرات العائمة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي المستعمرات في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في RT وإزالة طاف.
  2. Resuspend والمستعمرات خلية في 10 مل من DMEM / F12 وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف.
  3. إعداد تعليق خلية واحدة التي يحتضنها المستعمرات مع 2 مل من 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 7-10 دقيقة. دوامة بلطف تعليق خلية لفصل المستعمرات.
  4. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من IPS-RPE المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة وتجاهل طاف. resuspend الخلايا وحيدة في 2 مل من IPS-RPE المتوسطة. نقل الخلايا في مصفوفة البروتين المغلفة لوحة 6 جيدا ومكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه التجربة، كانت خلايا الجذع مثقف ومتميزا في النسب RPE من EBS. وتم تشكيل EBS من الأحجام التحكم باستخدام لوحات microwell. كما رأينا في الشكل 1 EB تشكيل كانت متجانسة في لوحات microwell. وكانت هذه EBS ثم جمعها ومطلي على 6 لوحات جيدا (الشكل 2).

RPE يمكن تحديدها من قبل الكلاسيكيه سداسية التشكل، وتصبغ، والتعبير عن علامات RPE. بعد 12 أسبوعا من الثقافة، وكانت 200 خلية EBS المتقدمة نجمية ومورفولوجيا الخلايا الليفية. ولم يلاحظ أي تصبغ في هذه الخلايا (الشكل 3A). وضعت EBS أكبر أحادي الطبقة من الكلاسيكية التشكل RPE وتصبغ (الشكل 3B وC) كيمياء سيتولوجية مناعية للكشف عن علامات RPE، MITF وZO1 كشف شارك تعبير عن هذه البروتينات التي استمدت من 500 خلية و 3،000 خلية EBS (الشكل 4) .

Eتم رصد xpressions حقل العين والجينات RPE بواسطة PCR ويبين الشكل 5 الملف الشخصى التعبير الجيني من الأديم الظاهر العصبي، السلائف الحقل العين، وعلامات RPE في أحجام مختلفة من EBS. الأهم من ذلك، تم الكشف عن علامة RPE محددة، RPE65 ابتداء من يوم 17.

لقياس العائد من الخلايا التي كانت متباينة في RPE النسب، تم إجراء تحليل FACS للكشف عن الأديم الظاهر العصبي وRPE السلائف علامات، PAX6 وMITF على التوالي. ويبين الشكل 6A PAX6 الأديم الظاهر العصبي علامة في أحجام مختلفة من EBS في نقاط زمنية مختلفة. وكانت حوالي 50٪ من الخلايا تحليل إيجابية لPax6 في يوم 6 من الثقافة في EBS 3،000 خلية. بالإضافة إلى ذلك، كشف تحليل FACS من علامة RPE، MITF على أحجام متنوعة EB أن 20٪ من الخلايا أعربت MITF من قبل يوم 60 من التمايز.

وتتميز مثقف RPE أيضا من خلال قدرتها على فقدان الصباغ ومورفولوجيا المضلع والحصول علىالليفية النمط الظاهري على الركض. لذلك، لتحديد ما إذا كان اشتقاق الجذع RPE تمتلك هذه الخصائص، ونحن معزولة ميكانيكيا وpassaged الخلايا. ويبين الشكل 7A فقدت الخلايا passaged حديثا الصباغ واكتسبت الخلايا الليفية مورفولوجيا. بالإضافة إلى ذلك، انتشرت هذه الخلايا واستعادت التشكل مضلع الكلاسيكية على التقاء (الشكل 7B). في غضون بضعة أسابيع، استعادت هذه الخلايا تصبغ بها (الشكل 7C).

TATTTTGC
جينة إشارة NICB تسلسل (5'-3 ') حجم (بي بي)
Pax6 NM_001258465.1 F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
R
RPE65 NM_000329.2 F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
R AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
R CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
R TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
R TCCACCACCCTGTTG
CTGTA

الجدول 1. تسلسل PCR التمهيدي لPax6، RPE65، RX، MITF وGAPDH الجينات.

الشكل (1)
الشكل 1. تشكيل EBS مع لوحات microwell. ويحتوي كل microwell (A) 100 خلية، (ب) 200 خلية، (C) 500 الخلايا، و (D) 3،000 الخلايا. وحضنت الخلايا 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لتشكيل EBS. (التكبير 100X، على نطاق وبار = 400 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. EBS تحصد من لوحات microwell. (A) 200 خلية EB، (ب) 500 خلية EB، (C) 3،000 خلية EB، و (D) 15،000 خلية EB. (التكبير 200X، على نطاق وبار = 200 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
كانت الشكل 3. الجذع المستمدة RPE من أحجام مختلفة من EBS. EBS مثقف لمدة 12 أسبوعا. وكان (A) 200 خلية EBS وضعت فقط نجمية والخلايا الليفية مورفولوجيا دون تصبغ. في حين أن 80٪ - وضعت 90٪ من الخلايا في EBS 500 خلية (B و C) أحادي الطبقة من الخلايا الصباغية متعدد الأضلاع. (A & B: التكبير 100X، شريط النطاق= 400 ميكرون. (C): التكبير 200X، على نطاق وبار = 200 ميكرون) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. المشارك التعبير عن MITF وZO1. 500- و 3،000 خلية EBS أعرب MITF وZO1 بعد 17 يوما من التمايز. (التكبير 400X، ومقياس شريط = 20 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. جين الملف الشخصي التعبير من أحجام مختلفة من EBS في نقاط زمنية مختلفة من التمايز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. تحليل FACS من حجم متنوعة EB لRPE التمايز. (A) FACS البيانات من PAX6 الأديم الظاهر العصبي علامة في أحجام مختلفة من EBS خلال التمايز. (ب) تحليل FACS من RPE علامة MITF على أحجام EB متنوعة في يوم 60 من التمايز. كما بلغ أعلى مستوى MITF 20٪ والمستمر بين EB حجم 500، 3،000، و 15،000 الخلايا.

الرقم 7
الرقم 7. تابع ثقافة RPE معزولة يدويا. كان subcultured (A) RPE والحصول على الخلايا الليفية morpholoغراي بعد مرور. (B & C) خلايا ضعت مورفولوجيا المضلع وتصبغ على مر الزمن. (التكبير 100X، على نطاق وبار = 400 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتحقيق الوعد الكامل للخلايا الجذعية المحفزة لعلاج الخلايا، فمن الضروري لتنظيم التمايز بهم بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. ويصف هذا التقرير بروتوكولات لتشكيل EBS التي تسيطر عليها حجم استخدام التكنولوجيا لوحة microwell، والشروع في التمايز نحو RPE وتحديد البروتين والجينات علامات RPE. لمزامنة التمايز في المختبر، وتم تشكيل الأحجام متجانسة من EBS بواسطة أرقام معروفة من خلايا الجذع طرد في لوحات microwell طريق التجميع القسري. وتستخدم مناعية وعكس النسخ تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR) لمراقبة البروتينات تعبيرات RPE وجينات أوضح. وأخيرا، تم تحليل كفاءة التمايز في أحجام مختلفة من EBS عن طريق تحليل FACS. ويمكن لهذه التقنيات تسهيل تمايز الخلايا المحفزة في RPE للتطبيقات المستقبلية.

هناك عدة نقاط حاسمة في هذه الطريقة التي يجب أن يتم تنفيذها بعناية إلى البريدnsure نجاح هذا البروتوكول والتحصيل بيانات دقيقة. وتحدث هذه خطوة رئيسية الأولى خلال زراعة الخلايا المحفزة. يجب الحفاظ على خلايا الجذع في حالة المحفزة للحفاظ على stemness بهم. يجب أن يكون لدى خلايا المتوسطة يتغير يوميا من أجل الحفاظ على مستويات مناسبة من bFGF ويتم تفتيشها بدقة يوميا بحثا عن علامات التمايز. خلايا الجذع غير متمايزة تنمو كما مستعمرات متعددة الخلايا المدمجة. يجب أن يكون خلايا النووية إلى ارتفاع نسبة السيتوبلازم والأنوية بارزة. وتتميز المستعمرات الجذع من الحدود متميز، مع عدة طبقات من الخلايا في المركز. وتشمل علامات التمايز فقدان حدود مستعمرة محددة، مورفولوجيا الخلايا غير موحد، وظهور أنواع الخلايا واضحة، مثل الخلايا العصبية والخلايا الليفية. الخلايا واحد التي متباينة يمكن إزالتها عن طريق dispase والشطف، ومع ذلك، المستعمرات مع هذه الخصائص يجب إزالة يدويا من ثقافة 22. إعداد تعليق خلية الجذع واحد FOص تشكيل EBS هو خطوة حاسمة المقبلة. من المهم إعداد تعليق بدون المجاميع خلية من أجل تقديم بدقة العدد المطلوب من الخلايا إلى لوحة microwell وإعداد الحجم المطلوب EB. الاستعدادات لتحليل PCR RNA مهمة أيضا. جودة RNA تتعارض هي مصدر كبير من التباين في البيانات PCR. استخراج الحمض النووي الريبي ينبغي أن تسفر تدهور الحد الأدنى RNA حصول على أفضل النتائج. سوف استخراج الحمض النووي الريبي نجاح المحصول الكلي RNA مع الحد الأدنى من تدهور وخالية من أي تلوث RNases. بعد تحديد تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق القياس الطيفي في 260 نانومتر، ينبغي تحديد نقاء العينة في 230 و 280 نانومتر للكشف عن التلوث مع السكريات أو البروتينات. 230: 260: 280 نسبة للRNA يجب أن تكون 1: 2: 1 للإشارة RNA ذات جودة عالية مع عدم وجود تلوث 23. وأخيرا، من المهم على نحو كاف لإصلاح الخلايا لمدة FACS تلطيخ. خلال هذه الخطوة التثبيت، يجب فصل الخلايا لمنع تراكمها. Insufficسوف إعادة تعليق خلية ient قبل permeabilization يؤدي إلى تراكمها الخلية وتلطيخ غير دقيقة.

ونحن نوصي أن البروتوكول يجب اتباعها كما هو موضح، ولكن بعض التعديلات يمكن إجراء إذا لزم الأمر. خلال جيل من EBS هو موضح في الخطوة 4، وعدد الخلايا في EB يمكن أن تتراوح ما بين 500 إلى 3،000 لتحقيق عائد مرتفع من الخلايا المتمايزة في RPE. وإذا كان عدد خلايا الجذع محدودة، سوف EBS 500 خلية تنتج RPE يضاهي EBS 3،000 خلية. يجب أن يؤخذ الحذر أثناء عملية استخراج الحمض النووي الريبي هو موضح في الخطوة يجب تشغيل 6. عينات في ثلاث نسخ للتأكد من أن RNA ذات جودة عالية يمكن الحصول عليها. خلال مناعية كما هو موضح في الخطوة 7، وتركيزات الضد الابتدائي والثانوي يمكن تعديلها عند الضرورة لتحسين كثافة إشارة والحد من الخلفية. يجب تضمين الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة في الفحص. خلال الخطوة 8، تحليل FACS، إذا كانت النتائج المتوقعة لا ACQuired بعد تلطيخ، ويمكن أن توضع عينة صغيرة من الخلايا الملون على شريحة وعرضها مع المجهر لتصور تلطيخ. يجب تضمين الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة في الفحص. إذا لم يتم ملطخة الخلايا كما هو متوقع، وتركيزات الأجسام المضادة يمكن أن يزيد أو ينقص حسب الحاجة.

وهذه التقنية المبينة في هذا التقرير يؤدي إلى عائدات أعلى من RPE من التمايز عفوية، من دون استخدام المواد الكيميائية المضافة. ومع ذلك، فإن القيد الرئيسي لهذا النهج هو أنه سيكون هناك أيضا عدد كبير من الخلايا غير RPE المولدة. ولذلك، يجب تحديد RPE بعناية وإثراء كما هو موضح في الخطوة 9 لضمان وجود السكان متجانسة.

وتكمن أهمية هذا النهج هو أن عائدات أعلى من RPE يمكن أن تستمد من خلايا الجذع من تقنيات التمايز العفوية. كما تم الإبلاغ عن استخدام الجزيئات الصغيرة لاستخلاص RPE من الجذع لإعطاء عالية الغلة منخلايا متباينة، مع ذلك، أن الأسلوب هو أكثر تعقيدا وتتطلب توقيت وتركيز الجزيئات الصغيرة ليكون الأمثل لتحقيق النتائج المرجوة 7،10. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجزيئات الصغيرة المستخدمة في هذه الأساليب لها آثار تعدد التأثير الجيني الذي يمكن أن يتغلب على النتائج.

الطريقة الموصوفة يمكن استخدامها لجعل EBS من الأحجام المطلوبة مع استنساخ عالية. هذه التقنية لدت EBS من أحجام موحدة والتي كانت تستخدم لتحسين تمايز الخلايا المحفزة نحو النسب RPE من دون استخدام مواد كيميائية إضافية. خلايا الجذع-RPE المستمدة من EBS ومن ثم يمكن استخدامها في مزيد من الدراسات لتأكيد زرع اندماجها في شبكية العين في التنظيم الوظيفي. هذه الخلايا يمكن أن توفر أيضا نموذجا البحوث الجيدة لدراسة التسبب في الأمراض RPE مختلفة في المختبر. فائدة هذا النهج يمكن تطبيقها لتمايز الموجهة إلى العديد من أنواع الخلايا الأخرى، تبعاحجم EBS والأصل في الجسم الحي للخلية في الكيسة. سوف خلايا الأديم الظاهر أن تؤدي إلى الخلايا العصبية، البشرة والشعر وخلايا الغدة الثديية. سوف الأديم الباطن تؤدي إلى المعدة والقولون والرئتين والخلايا المعوية. سوف الأديم المتوسط ​​تؤدي إلى الهيكل العظمي والعضلات والقلب والكلى، وخلايا النسيج الضام 3،11،19. مرة واحدة وقد تم تحديد حجم الصحيح EB، وخلايا متباينة تحتاج فقط ليتم تحليلها من قبل مناعية أو FACS للتعبير الصحيح من البروتينات علامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1, (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26, (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (12), e8152 (2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25, (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics