Embryoid निकायों के विभिन्न आकारों से प्रेरित स्टेम से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) पाने (आईपीएस) प्रकोष्ठों

Developmental Biology

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Summary

इस रिपोर्ट का उद्देश्य embryoid निकायों के विभिन्न आकारों का उपयोग कर प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है।

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Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

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Abstract

Introduction

प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं बाह्य कारकों एक साथ वयस्क कोशिकाओं reprogramming द्वारा ली गई स्टेम सेल का एक प्रकार है। इसके विपरीत, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs), स्टेम सेल की एक अन्य प्रकार, ब्लास्टोसिस्ट 2-3 की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उत्पन्न कर रहे हैं। उनके अलग मूल के बावजूद, आईपीएस कोशिकाओं और ESCs इन विट्रो में और किसी भी प्रकार की कोशिका 4-5 में अंतर करने के लिए अपनी क्षमता में दोहराने के लिए उनके असीमित क्षमता में तुलना कर रहे हैं। आईपीएस कोशिकाओं की इन विशेषताओं उन्हें व्यक्तिगत पुनर्योजी चिकित्सा में अनुप्रयोगों के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं। हाल के शोध प्रयासों के रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के 6-11 सहित विशेष वयस्क कोशिकाओं के निर्माण के लिए मजबूत भेदभाव प्रोटोकॉल के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।

आईपीएस ली गई कोशिकाओं के संभावित नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए, कि विशेष सेल प्रकार के लिए एक निर्देशित भेदभाव आवश्यक है। विभिन्न तरीके हैंउनकी दक्षता 6-7, 12-16 में बहुत भिन्न होता है कि RPE में दोनों ESCs और आईपीएस कोशिकाओं का निर्देश दिया भेदभाव के लिए प्रकाशित किया। हम अभी भी विकास या भेदभाव के दौरान सेल / ऊतक भाग्य को नियंत्रित करने वाले आणविक घटनाओं के कई पता नहीं है। हाल के वर्षों में, के प्रयासों को जितना संभव हो उतना embryological विकास नकल कर सकते हैं कि भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए बनाया गया है। ब्लास्टोसिस्ट चरण के दौरान, स्टेम सेल के अवचनबद्ध जनसंख्या एक तीन आयामी microenvironment में एक साथ हैं। तो, विभिन्न रणनीतियों एक साथ इकट्ठे ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं को बनाने और तीन आयामों में उन्हें विकसित करने के लिए लागू किया गया। ये स्टेम सेल समुच्चय embryoid निकायों (ईबीएस) कहा जाता है। अध्ययनों से स्टेम कोशिकाओं के ईबी भेदभाव भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरण की नकल और अनायास अपने बाहरी सतह पर आदिम अन्तर्जनस्तर को जन्म दे सकते हैं कि पता चला है। ईबी विकास की प्रगति के रूप में बाद में, सभी तीन रोगाणु प्रजातियों की विभेदित सेल phenotypes 17-18 दिखाई देते हैं। गुerefore, ईबीएस आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव के लिए ध्यान की एक बहुत आकर्षित किया है और स्टेम सेल 13 से RPE पीढ़ी के लिए एक अच्छे उम्मीदवार हैं।

ईबीएस ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं से कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभ में, ईबीएस पक्षपाती कालोनियों बंद scraping और गैर-पक्षपाती निलंबन संस्कृति में उन्हें बनाए रखने के द्वारा किए गए थे। हालांकि, इस दृष्टिकोण कम reproducibility के कारण बनता है कि ईबीएस की विषम जनसंख्या पैदावार। फांसी ड्रॉप सेल संस्कृति और microwell आधारित ईबीएस गठन अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि परिभाषित आकार के समरूप ईबीएस उपज जो ईबीएस गठन के लिए अन्य लोकप्रिय तकनीक है। इसके अलावा, microwell तकनीक कम प्रयास के साथ समुच्चय के बड़ी संख्या में अर्जित कर सकते हैं।

ईबीएस के भीतर कोशिकाओं के भेदभाव बाह्य और intracellular microenvironment से morphogenic cues के एक मल्टीप्लेक्स के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। एक सोम में भेदभाव के विपरीतolayer प्रारूप, ईबीएस कोशिकाओं की जटिल विधानसभा और 17 के लिए होते हैं कहनेवाला संकेतन के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। दिलचस्प है, व्यक्तिगत ईबीएस बनाने के लिए इस्तेमाल स्टेम कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं के भाग्य को प्रभावित करने के लिए मनाया गया। 1000-सेल ईबी एर्य्थ्रोइद वंश 20 की ओर धकेल दिया है, जबकि उदाहरण के लिए, मानव ESCs के एक hematopoietic भेदभाव अध्ययन में यह 500-सेल ईबी माइलॉयड वंश के प्रति भेदभाव को बढ़ावा दिया है कि मनाया गया। एक अन्य अध्ययन में, छोटे ईबीएस न्यूरो बाहरी झिल्ली भेदभाव 11, 17 की दिशा में पदोन्नत बड़ा ईबीएस जबकि अन्तर्जनस्तर भेदभाव का समर्थन किया।

ये पिछले अध्ययनों दृढ़ता से व्यक्तिगत ईबीएस बनाने के लिए इस्तेमाल ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं की संख्या किसी भी प्रकार की कोशिकाओं को भेदभाव आधारित ईबीएस को प्रभावित करने वाले सुझाव देते हैं। हालांकि, हमारे ज्ञान करने के लिए, RPE की दिशा में अंतर करने के लिए अपनी प्रवृत्ति में ईबीएस आकार के प्रभाव को स्पष्ट कर दिया है कि कोई मौजूदा अध्ययन कर रहे हैं। इस अध्ययन के लक्ष्य के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए हैरेटिना वर्णक उपकला (आईपीएस) RPE भेदभाव और RPE वंश की ओर निर्देशित भेदभाव के लिए ईबीएस बनाने के लिए इष्टतम सेल नंबर की पहचान के लिए - प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं पर ईबी आकार।

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Protocol

संस्कृति अभिकर्मकों और संस्कृति प्लेट्स के 1. तैयारी

  1. स्टेम सेल बेसल मध्यम के 400 मिलीलीटर के लिए 5x सीरम मुक्त पूरक की 100 मिलीलीटर जोड़कर फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। मध्यम अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
  2. रो-जुड़े, कुंडलित-कुंडल युक्त प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोध करनेवाला (वाई-27,362) के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध embryoid शरीर (ईबी) के गठन के माध्यम के 10 माइक्रोन समाधान जोड़ें।
  3. (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 के लिए 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, 0.1 मिमी अनावश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी एल glutamine, 10% पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर) और 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन जोड़कर DMEM के भेदभाव मध्यम तैयार / F12)।
  4. 1x N1 के पूरक, 0.1 मिमी अनावश्यक अमीनो एसिड, 250 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / बैल की तरह, 13 एनजी / एमएल triiodo एल thyronine सोडियम नमक, 20 एनजी / एमएल hydrocortisone, 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन, और 15% जोड़कर आईपीएस RPE मध्यम तैयार भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) <समर्थन> न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (सदस्य) 21। 7.4 पीएच को समायोजित करें।
  5. Triiodo एल thyronine सोडियम नमक शेयर समाधान तैयार है। धीरे घूमता द्वारा 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड में triiodo एल thyronine सोडियम नमक के 1 मिलीग्राम भंग। सदस्य के 49 मिलीलीटर triiodo एल thyronine सोडियम नमक की 50 मिलीलीटर 20 की माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / बनाने के लिए जोड़ें। Aliquots के लिए तैयार है और जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज। अंतिम मध्यम संस्कृति में वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा का प्रयोग करें।
  6. Hydrocortisone शेयर समाधान तैयार है। कोमल आंदोलन के द्वारा 100% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में hydrocortisone की 1 मिलीग्राम solubilize। सदस्य के 19 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर hydrocortisone शेयर समाधान माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / 50 के बनाने के लिए जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और फ्रीज की जरूरत तक। अंतिम मध्यम संस्कृति में वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा का प्रयोग करें।
  7. DMEM / F12 में 1 मिलीग्राम / एमएल की dispase का काम कर समाधान तैयार है।
  8. मैट्रिक्स लेपित प्लेटों की तैयारी
    1. Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) से निकाले गए प्रोटीन मैट्रिक्स समझौता ज्ञापन तैयार करें0.08 मिलीग्राम / मिलीलीटर DMEM / F12 में एसई सार्कोमा कोशिकाओं। कोट मैट्रिक्स समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से। 1 घंटे के लिए आरटी पर लेपित प्लेटें सेते हैं।
    2. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, अतिरिक्त DMEM / F12 aspirate। कुओं के सूखने को रोकने के लिए फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। मैट्रिक्स लेपित प्लेट इस्तेमाल के लिए तैयार कर रहे हैं।
  9. DMEM / F12 के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक rinsing द्वारा, microwell प्लेटें तैयार करें। DMEM / F12 निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक ईबी गठन के माध्यम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट के किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 2000 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
  10. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में सोडियम azide 2% FBS के मिश्रण से FACS धुंधला बफर तैयार है, और 0.09%। 7.4 पीएच को बफर समायोजित करें।
  11. DMEM / F12 10% FBS जोड़कर trypsin निष्क्रिय समाधान तैयार है।

2. आईपीएस संस्कृति

  1. आईपीएस सेल बोने से पहले, गर्म फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मध्यम, और मा हैट्रिक्स प्लेटें तैयार लेपित।
  2. जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में IMR90-1 आईपीएस कोशिकाओं पिघलना। फिर पानी से स्नान क्रायो शीशी को हटाने और 70% इथेनॉल के साथ शीशी पोंछे। सेल clumps के टूटने कम करने के लिए एक 2 एमएल पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  3. Dropwise कोशिकाओं को गर्म फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण। आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  4. ध्यान से फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर में सेल clumps resuspend और मैट्रिक्स में लिपटे थाली के कुओं में सेल clumps बीज। 5% सीओ 2, 95% नमी के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस।
  5. दैनिक आईपीएस सेल संस्कृति के माध्यम से बदलें। बोने के बाद undifferentiated कालोनियों पांच से सात दिन का निरीक्षण करें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत बीतने (एक घने केंद्र के साथ कालोनियों) के लिए तैयार कर रहे हैं कि undifferentiated कालोनियों के लिए जाँच करें।

आईपीएस कोशिकाओं 3. Passaging

  1. शुरू करने से पहले पारित होने के लिए आईपीएस कोशिकाओं, नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए dispase समाधान, DMEM / F12 और फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से गर्म है।
  2. आईपीएस कोशिकाओं passaging पहले, क्षेत्र scraping और मध्यम aspirating द्वारा भेदभाव के किसी भी क्षेत्र को हटा दें। ध्यान से 2 मिलीलीटर DMEM / F12 के साथ आईपीएस कोशिकाओं कुल्ला।
  3. / एमएल dispase प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीग्राम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सात मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। Dispase Aspirate और धीरे DMEM / F12 दो बार के 2 मिलीलीटर के साथ सेल कालोनियों कुल्ला। Rinsing के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग धीरे सेल clumps फार्म करने के लिए थाली की कालोनियों परिमार्जन। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए अलग सेल clumps स्थानांतरण। कोशिकाओं के अगले बीतने के बीज के लिए पर्याप्त फीडर से मुक्त स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें।

Microwell प्लेट का उपयोग ईबीएस 4. जनरेशन

  1. आईपीएस कोशिकाओं की एक एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
    1. Mediu निकालेंआईपीएस कोशिकाओं से मी और DMEM / F12 के 2 मिलीलीटर के साथ आईपीएस कोशिकाओं कुल्ला। 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से आईपीएस कोशिकाओं को Accutase के 750 μl जोड़ें। कोशिकाओं प्लेट (लगभग 5-10 मिनट) से अलग करने के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. धीरे किसी भी शेष कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें और थाली की सतह पर किसी भी शेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण। DMEM / F12 के 5 मिलीलीटर के साथ थाली कुल्ला और शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं के साथ rinsed DMEM / F12 गठबंधन। किसी भी संभावित अवशिष्ट सेल clumps दूर करने के लिए एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं।
    3. Accutase दूर करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सेल एकाग्रता लगभग 0.5-1.0 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल इतना है कि ईबी गठन के मध्यम में सेल गोली Resuspend।
    4. Trypan ब्लू और एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं।
  2. Adjustinmicrowells में जी सेल घनत्व आकार नियंत्रित ईबीएस के लिए फार्म
    1. वांछित ईबी आकार उत्पन्न करने के लिए microwell थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या को समायोजित करें। समान रूप से धीरे कोशिकाओं कई बार pipetting द्वारा कोशिकाओं को वितरित, कदम 1.9 में तैयार प्लेटों के microwells कोशिकाओं जोड़ें।
      नोट: अच्छी तरह से प्रति microwells की ईबी एक्स संख्या प्रति कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्रति आवश्यक कोशिकाओं की संख्या = वांछित संख्या।
    2. 2.0 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए कुओं में रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक ईबी गठन मध्यम समायोजित करें। धीरे प्रत्येक pipetting अच्छी तरह से कोशिकाओं को फिर से विभाजित। 3 मिनट के लिए 100 XG पर microwell प्लेटें अपकेंद्रित्र। 5% सीओ 2 और 24 घंटे के लिए 95% नमी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में प्लेटें प्लेस।
  3. Microwell प्लेटों से फसल काटने ईबीएस
    1. अच्छी तरह से ईबीएस के सबसे दूर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर micropipettor साथ ऊपर और नीचे में मध्यम pipetting द्वारा microwells से फसल ईबीएस। एक औंधा 40 माइक्रोन सेल के माध्यम से ईबी निलंबन दर्राएक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर झरनी एकल कक्षों को हटाने के लिए।
    2. सभी ईबीएस दूर करने के लिए DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर के साथ microwell थाली 5 बार धोएं। Washes के लीजिए और उल्टे सेल झरनी के ऊपर से गुजरती हैं। एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब अप करने के लिए सेल झरनी दाईं ओर मुड़ें। ईबी गठन के माध्यम से धोने से ईबीएस लीजिए। उपज का निर्धारण करने के लिए ईबीएस गणना।

5. चढ़ाना ईबीएस और शुरुआत भेदभाव

  1. <1000 ईबीएस / के घनत्व पर कुएं में ईबी गठन मध्यम प्लस 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला (कदम 1.8.1 के रूप में) छह अच्छी तरह प्लेटें लेपित प्रोटीन मैट्रिक्स पर ईबीएस थाली। 5% सीओ 2 और 24 घंटे के लिए 95% नमी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ईबीएस सेते हैं।
  2. 24 घंटा ईबी चढ़ाना के बाद, भेदभाव आरंभ करने के लिए भेदभाव मध्यम के साथ बदलें। कोशिकाओं आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र कर रहे हैं जब तक हर दूसरे दिन भेदभाव मध्यम के आधे बदलें।
  3. आरटी पीसीआर संचालन करने के लिए दिन में 6, 17, 29 और 60 पर नमूने एकत्र, आई एम एमunocytochemistry और FACS विशेषता RPE के जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए।

6. शाही सेना निष्कर्षण और पीसीआर

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में दिए गए निर्देश के अनुसार ईबी नमूनों से शाही सेना निकालें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शाही सेना एकाग्रता का निर्धारण।
  2. सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेख किट के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शाही सेना के अनुसार कुल शाही सेना के 100 एनजी पर रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करते हैं।
  3. सीडीएनए के 10 μmol / 10 एनजी की एकाग्रता में सीडीएनए के 10 एनजी निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग (तालिका 1) के साथ पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। इस प्रकार के रूप पीसीआर सेट: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए denature, 72 डिग्री पर एक अंतिम चक्र द्वारा पीछा 30 सेकंड, एक मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, के लिए, 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 35 चक्र के साथ 60 डिग्री सेल्सियस बढ़ाना 10 मिनट के लिए सी। एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद चलाएँ।

7. Immunocytochemistry

  1. आरटी पर पीबीएस के साथ दो बार ईबीएस धो लें। 4% paraformald में आरटी पर ईबीएस फिक्स10 मिनट के लिए ehyde। आरटी पर एक बार पीबीएस के साथ कुल्ला। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर के नमूने धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक।
  2. धुंधला दिन, निर्धारण और permeabilization के अभिकर्मकों के साथ तय की कोशिकाओं का इलाज। आरटी पर 1 घंटे के लिए (permeabilization के समाधान में 10% बकरी सीरम) अवरुद्ध समाधान के साथ नमूने सेते हैं।
  3. संकेत दिया dilutions पर निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग permeabilization के समाधान में 10% बकरी सीरम में immunochemistry प्रदर्शन करना: विरोधी Pax6 (1:10), विरोधी RX (1: 200), विरोधी MITF (01:30), और विरोधी ZO1 (1: 100)। 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी हे / एन इसी के साथ नमूने सेते हैं।
  4. अगले दिन, कोशिकाओं से प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने और पीबीएस के साथ नमूनों में तीन बार कुल्ला। आरटी पर 1 घंटे के लिए फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने सेते हैं।
  5. कोशिकाओं से माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस में नमूने तीन बार कुल्ला। कवर बढ़ते मध्यम युक्त DAPI के साथ गिलास स्लाइड पर निकल जाता है माउंट और नमूने एक अंधेरे कक्ष में हे / एन स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं।धुंधला कल्पना करने के लिए एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें।

FACS विश्लेषण के लिए 8. धुंधला

  1. पीबीएस में दो बार सुसंस्कृत ईबीएस धो लें। एक एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए 5-10 मिनट के लिए 0.25% trypsin के 0.5 मिलीलीटर के साथ ईबीएस सेते हैं। ट्रिप्सिन निष्क्रिय समाधान के साथ trypsin (1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) बेअसर।
  2. 10 मिनट के लिए 600 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए एकल कक्ष निलंबन स्थानांतरण।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ट्यूब में कोशिकाओं को DMEM / F12 के 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए पलटना। 600 x जी पर अपकेंद्रित्र। Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और FACS धुंधला बफर में कोशिकाओं resuspend।
  4. कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना। 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र। Centrifugation के सतह पर तैरनेवाला त्यागें के बाद। तुरंत 4% paraformaldehyde के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। कोमल vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र और हटानेसतह पर तैरनेवाला। भंवर धीरे सेल गोली बाधित करने के लिए। ठंडा permeabilization के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं permeabilize। भंवर धीरे मिश्रण और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  6. 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। FACS धुंधला बफर और resuspend के 3 मिलीलीटर जोड़ें। एक और अधिक समय के लिए इस चरण को दोहराएँ। 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में FACS धुंधला बफर में कोशिकाओं Resuspend।
  7. प्रत्येक microfuge ट्यूबों के लिए सेल निलंबन (0.5 x 10 6 कोशिकाओं) के 100 μl स्थानांतरण और प्राथमिक एंटीबॉडी की सिफारिश की मात्रा जोड़ने। Pax6 के लिए, सेल निलंबन के 100 μl में पीई विरोधी Pax6 के 5 μl जोड़ें। MITF के लिए, सेल निलंबन के 100 μl में विरोधी MITF के 5 μl जोड़ें।
  8. मिक्स और 60 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। FACS धुंधला बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 10 मिनट के लिए 600 XG पर मिक्स और अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और दो अतिरिक्त समय के लिए 8.16 दोहराएँ।
  9. MITF धुंधला के लिए, माध्यमिक antibo में कोशिकाओं को सेतेडी वाई, एक की एक कमजोर पड़ने पर बकरी विरोधी माउस एलेक्सा Fluor 488: 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2,000। Pax6 धुंधला के लिए, इस कदम से बचें।
  10. 10 मिनट के लिए 600 XG पर FACS धुंधला बफर और अपकेंद्रित्र के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। दो से अधिक बार के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  11. सेल गोली बाधित करने के लिए धीरे FACS धुंधला बफर और भंवर के 500 μl में कोशिकाओं Resuspend। नमूने प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए तैयार हैं।

9. आईपीएस RPE के अलगाव और संस्कृति

  1. दिन में 29 से कम, ध्यान से एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग संस्कृति की थाली से चयनित पिगमेंटड कालोनियों के आसपास काटा। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए अस्थायी कालोनियों स्थानांतरण। आरटी पर 10 मिनट के लिए 600 XG पर कालोनियों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  2. 10 मिनट के लिए 600 XG पर DMEM / F12 और अपकेंद्रित्र के 10 एमएल में सेल कालोनियों Resuspend। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  3. 7-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ कालोनियों incubating द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। धीरे कालोनियों अलग कर देना करने के लिए सेल निलंबन भंवर।
  4. आईपीएस RPE के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर। 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। आईपीएस RPE के माध्यम से 2 मिलीलीटर में एकल कक्षों Resuspend। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% आर्द्रता पर एक मशीन में एक प्रोटीन मैट्रिक्स लेपित 6 अच्छी तरह से थाली और जगह में कोशिकाओं स्थानांतरण।

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Representative Results

इस प्रयोग में, आईपीएस कोशिकाओं सुसंस्कृत थे और ईबीएस से RPE के वंश में भेदभाव। नियंत्रित आकार के ईबीएस microwell प्लेट का उपयोग का गठन किया गया। चित्रा 1 ईबी गठन के रूप में देखा microwell प्लेटों में समरूप था। ये ईबीएस तो (चित्रा 2) एकत्र की है और 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाया गया।

RPE RPE के मार्कर के अपने शास्त्रीय हेक्सागोनल आकृति विज्ञान, रंजकता, और अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की जा सकती है। संस्कृति के 12 सप्ताह के बाद, 200-सेल ईबीएस अस्थिकणिका और fibroblast आकृति विज्ञान विकसित की थी। कोई रंजकता इन कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) में मनाया गया। बड़ा ईबीएस शास्त्रीय RPE आकृति विज्ञान और रंजकता की एक monolayer विकसित (चित्रा 3 बी और सी) Immunocytochemistry RPE के मार्कर का पता लगाने के लिए, MITF और ZO1 500-सेल और 3,000 सेल ईबीएस से प्राप्त किया गया था कि इन प्रोटीनों की सह अभिव्यक्ति का पता चला (चित्रा 4)

एआँख क्षेत्र और RPE जीन की xpressions पीसीआर द्वारा निगरानी की गई। 5 ईबीएस के विभिन्न आकारों में neuroectodermal, आंख क्षेत्र व्यापारियों, और RPE मार्करों के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पता चलता है। महत्वपूर्ण बात है, विशिष्ट RPE के मार्कर, आर पी ई 65 दिन में 17 से शुरू खोजा गया था।

RPE के वंश में भेदभाव किया था कि कोशिकाओं की उपज यों, FACS विश्लेषण neuroectodermal और RPE अग्रदूत मार्करों, क्रमशः Pax6 और MITF पता लगाने के लिए किया गया था। चित्रा 6A अलग समय बिंदुओं पर ईबीएस के विभिन्न आकारों में neuroectodermal मार्कर Pax6 पता चलता है। विश्लेषण किया कोशिकाओं के लगभग 50% 3000-सेल ईबीएस में संस्कृति के दिन 6 पर Pax6 के लिए सकारात्मक थे। इसके अतिरिक्त, विभिन्न ईबी आकार पर RPE के मार्कर, MITF की FACS विश्लेषण कोशिकाओं का 20% भेदभाव के दिन 60 से MITF व्यक्त की है कि पता चला।

संवर्धित RPE भी उनके रंग और बहुभुज आकृति विज्ञान कम है और एक प्राप्त करने के लिए अपनी क्षमता की विशेषता हैpassaging पर तंतुप्रसू फेनोटाइप। इसलिए, आईपीएस कोशिकाओं RPE हम यंत्रवत् अलग है, इन विशेषताओं के अधिकारी ली गई है और passaged अगर निर्धारित करने के लिए। चित्रा 7A नव passaged कोशिकाओं वर्णक खो दिया और fibroblast आकृति विज्ञान अर्जित किया है दिखाता है। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं proliferated और संगम पर शास्त्रीय बहुभुज आकृति विज्ञान (चित्रा 7B) आ गया। कुछ ही हफ्तों के भीतर, इन कोशिकाओं को उनके रंजकता (चित्रा 7C) आ गया।

TATTTTGC
जीन NICB संदर्भ अनुक्रम (5'-3 ') आकार (बीपी)
Pax6 NM_001258465.1 एफ CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
आर
RPE65 NM_000329.2 एफ GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
आर AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 एफ GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
आर CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 एफ TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
आर TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 एफ ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
आर TCCACCACCCTGTTG
CTGTA

Pax6, आर पी ई 65, RX है, MITF और GAPDH जीनों के लिए तालिका 1. पीसीआर प्राइमर दृश्यों।

चित्र 1
Microwell प्लेटों के साथ ईबीएस चित्रा 1. संरचना। प्रत्येक microwell (ए) 100 कोशिकाओं, (बी) 200 कोशिकाओं, (सी) 500 कोशिकाओं, और (डी) 3000 सेल शामिल हैं। प्रकोष्ठों ईबीएस के गठन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से कम 24 घंटा और 5% सीओ 2 incubated रहे थे। (बढ़ाई 100X, पैमाने बार = 400 माइक्रोन)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Microwell प्लेटों से काटा चित्रा 2. ईबीएस। (ए) 200-सेल ईबी, (बी) 500-सेल ईबी, (सी) 3000-सेल ईबी, और (डी) 15,000 सेल ईबी। (बढ़ाई 200X, पैमाने बार = 200 माइक्रोन)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. आईपीएस व्युत्पन्न ईबीएस। ईबीएस के विभिन्न आकारों से RPE के 12 हफ्तों के लिए सुसंस्कृत थे। (ए) 200-सेल ईबीएस केवल रंजकता बिना अस्थिकणिका और fibroblast आकृति विज्ञान विकसित की थी; 500-सेल ईबीएस (बी और सी) में कोशिकाओं के 90% बहुभुज pigmented कोशिकाओं की एक monolayer विकसित - 80% है। (ए एंड बी: आवर्धन 100X, पैमाने बार= 400 माइक्रोन; (सी):। बढ़ाई 200X, पैमाने बार = 200 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
MITF और ZO1। 500 और 3,000 सेल ईबीएस चित्रा 4. सह अभिव्यक्ति भेदभाव के 17 दिनों के बाद MITF और ZO1 व्यक्त किया। (बढ़ाई 400X, पैमाने बार = 20 माइक्रोन)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
भेदभाव के विभिन्न समय बिंदुओं पर ईबीएस के विभिन्न आकारों की चित्रा 5 जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
RPE के भेदभाव के लिए विभिन्न ईबी आकार की चित्रा 6 FACS विश्लेषण। भेदभाव के दौरान ईबीएस के विभिन्न आकारों में neuroectodermal मार्कर Pax6 (ए) FACS के डेटा। (बी) के भेदभाव के दिन 60 पर विभिन्न ईबी आकार पर RPE मार्कर MiTF की FACS विश्लेषण। MITF के उच्चतम स्तर 20% तक पहुँच गया और EB 500 के आकार, 3000, और 15,000 कोशिकाओं के बीच स्थिर था।

चित्रा 7
चित्रा 7.। मैन्युअल रूप से अलग-थलग RPE के संस्कृति लगातर (ए) RPE subcultured किया गया था और fibroblast morpholo का अधिग्रहणपारित होने के बाद GY। (बी एंड सी) प्रकोष्ठों समय के साथ बहुभुज आकृति विज्ञान और रंजकता विकसित की है। (बढ़ाई 100X, पैमाने बार = 400 माइक्रोन)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सेल थेरेपी के लिए स्टेम सेल का पूरा वादा एहसास करने के लिए, यह एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में उनके भेदभाव को विनियमित करने के लिए आवश्यक है। इस रिपोर्ट microwell थाली प्रौद्योगिकी का उपयोग कर आकार नियंत्रित ईबीएस फार्म RPE की ओर भेदभाव आरंभ और RPE के प्रोटीन और जीन मार्कर की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। इन विट्रो भेदभाव सिंक्रनाइज़ करने के लिए, ईबीएस के समरूप आकार के लिए मजबूर एकत्रीकरण द्वारा microwell प्लेटों में centrifuged आईपीएस कोशिकाओं की ज्ञात संख्या से गठन किया गया। Immunocytochemistry और रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) की व्याख्या की अभिव्यक्ति RPE प्रोटीन और के जीन की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है। अंत में, ईबीएस के विभिन्न आकारों में भेदभाव की दक्षता FACS विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया था। इन तकनीकों में भविष्य के लिए आवेदन पत्र RPE में आईपीएस कोशिकाओं के भेदभाव सुविधा कर सकते हैं।

ध्यान से ई करने के लिए निष्पादित किया जाना चाहिए कि इस विधि में कई महत्वपूर्ण अंक हैंसटीक आंकड़ों के इस प्रोटोकॉल और प्राप्ति की सफलता nsure। पहला महत्वपूर्ण कदम आईपीएस सेल संस्कृति के दौरान होता है। आईपीएस कोशिकाओं उनके stemness बनाए रखने के लिए एक pluripotent राज्य में बनाए रखा जाना चाहिए। कोशिकाओं bFGF के उचित स्तर बनाए रखने के लिए और ध्यान से भेदभाव के संकेत के लिए दैनिक निरीक्षण किया जा क्रम में दैनिक बदल मध्यम होना आवश्यक है। Undifferentiated आईपीएस कोशिकाओं कॉम्पैक्ट बहुकोशिकीय कालोनियों के रूप में विकसित। कोशिकाओं कोशिका द्रव्य अनुपात और प्रमुख nucleoli करने के लिए एक उच्च परमाणु होनी चाहिए। आईपीएस कालोनियों केंद्र में कोशिकाओं की कई परतों के साथ, एक विशिष्ट सीमा की विशेषता है। भेदभाव के लक्षण परिभाषित कॉलोनी सीमाओं की हानि, गैर वर्दी सेल आकृति विज्ञान, और इस तरह के न्यूरॉन्स और fibroblasts के रूप में स्पष्ट सेल प्रकार, की उपस्थिति में शामिल हैं। Dispase और rinsing द्वारा हटाया जा सकता है विभेदित है कि एकल कक्षों, हालांकि, इन विशेषताओं के साथ कालोनियों मैन्युअल रूप से संस्कृति 22 से हटाया जाना चाहिए। एक भी आईपीएस सेल निलंबन के लिए तैयार करनाआर ईबीएस के गठन के लिए अगले महत्वपूर्ण कदम है। यह सही microwell थाली करने के लिए कोशिकाओं की वांछित संख्या देने और वांछित आकार ईबी तैयार करने के क्रम में सेल समुच्चय के बिना एक निलंबन तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। पीसीआर विश्लेषण के लिए शाही सेना की तैयारी भी महत्वपूर्ण हैं। असंगत शाही सेना गुणवत्ता पीसीआर डेटा में परिवर्तनशीलता का एक महत्वपूर्ण स्रोत है। शाही सेना निकासी न्यूनतम अच्छे परिणाम के लिए शाही सेना अपमानित उपज चाहिए। सफल शाही सेना निकासी कम से कम गिरावट है और किसी भी contaminating RNases से मुक्त के साथ कुल शाही सेना निकलेगा। 260 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा शाही सेना एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद, नमूना की शुद्धता polysaccharides या प्रोटीन के साथ संदूषण का पता लगाने के लिए 230 और 280 एनएम पर निर्धारित किया जाना चाहिए। 230: 260: कोई संदूषण 23 के साथ उच्च गुणवत्ता आरएनए इंगित करने के लिए 1: 2: शाही सेना के लिए 280 अनुपात एक होना चाहिए। अंत में, यह पर्याप्त रूप से FACS धुंधला के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस निर्धारण के चरण के दौरान, कोशिकाओं clumping को रोकने के लिए अलग किया जाना चाहिए। Insufficपूर्व permeabilization के लिए ient सेल मेजबान सेल clumping और गलत धुंधला करने का नेतृत्व करेंगे।

हम यदि आवश्यक हो तो फिर भी कुछ संशोधन किया जा सकता है, के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन किया जाना है कि सलाह देते हैं। ईबीएस की पीढ़ी चरण 4 में वर्णित के दौरान, ईबी प्रति कोशिकाओं की संख्या RPE में विभेदित कोशिकाओं के एक उच्च उपज प्राप्त करने के लिए 3000 के लिए 500 के बीच हो सकती है। आईपीएस कोशिकाओं की संख्या सीमित है, 500-सेल ईबीएस 3000 सेल ईबीएस के लिए तुलनीय RPE के उत्पादन होगा। एक्स्ट्रा केयर 6. नमूने उच्च गुणवत्ता आरएनए हासिल किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए तीन प्रतियों में चलाया जाना चाहिए चरण में वर्णित शाही सेना निकासी की प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए। चरण 7 में वर्णित के रूप में immunocytochemistry के दौरान, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता संकेत तीव्रता में सुधार लाने और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता है। उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण परख में शामिल किया जाना चाहिए। चरण 8 के दौरान, FACS विश्लेषण, परिणाम की उम्मीद ACQ नहीं कर रहे हैंधुंधला के बाद uired, दाग कोशिकाओं का एक छोटा सा नमूना एक स्लाइड पर रखा जा सकता है और धुंधला कल्पना करने के लिए एक खुर्दबीन के साथ देखा। उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण परख में शामिल किया जाना चाहिए। उम्मीद के रूप में कोशिकाओं दाग नहीं कर रहे हैं, एंटीबॉडी सांद्रता बढ़ा जा सकता है या जरूरत के रूप में कमी आई है।

इस रिपोर्ट में वर्णित तकनीक जोड़ा रसायनों के उपयोग के बिना, सहज भेदभाव से RPE के एक उच्च उपज में परिणाम होगा। हालांकि, इस दृष्टिकोण के मुख्य सीमा भी उत्पन्न गैर RPE कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में हो जाएगा। इसलिए, RPE के ध्यान से बाहर चुना है और एक समरूप जनसंख्या सुनिश्चित करने के लिए कदम 9 में वर्णित के रूप में समृद्ध किया जाना चाहिए।

इस दृष्टिकोण का महत्व RPE के एक उच्च उपज सहज भेदभाव तकनीकों की तुलना में आईपीएस कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है। आईपीएस से RPE प्राप्त करने के लिए छोटे अणुओं का उपयोग भी की एक उच्च उपज देने के लिए सूचित किया गया हैविभेदित कोशिकाओं, तथापि, कि तकनीक और अधिक जटिल है और समय की आवश्यकता है और छोटे अणुओं की सांद्रता वांछित परिणाम 7,10 प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना है। इसके अलावा, उन तरीकों में इस्तेमाल छोटे अणुओं परिणाम उलझाना कर सकते हैं जो pleiotropic प्रभाव है।

वर्णित विधि उच्च reproducibility के साथ वांछित आकार के ईबीएस बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक को अतिरिक्त रसायनों के उपयोग के बिना RPE के वंश की ओर आईपीएस कोशिकाओं के भेदभाव का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो वर्दी आकार के ईबीएस उत्पन्न। ईबीएस से निकाली गई आईपीएस RPE कोशिकाओं तो आगे एक कार्यात्मक संगठन में रेटिना में उनके एकीकरण की पुष्टि करने के प्रत्यारोपण के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है। इन कोशिकाओं को भी इन विट्रो में विभिन्न RPE के रोगों के रोगजनन अध्ययन करने के लिए एक अच्छा शोध मॉडल प्रदान कर सकते हैं। इस दृष्टिकोण की उपयोगिता, कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं में निर्देशित भेदभाव करने के लिए आवेदन के आधार पर किया जा सकता हैईबीएस के आकार और ब्लास्टोसिस्ट में सेल के vivo मूल। बाहरी झिल्ली की कोशिकाओं न्यूरॉन्स, एपिडर्मिस, बाल और स्तन ग्रंथि की कोशिकाओं को जन्म देगा; अन्तर्जनस्तर पेट, पेट, फेफड़े, और आंतों की कोशिकाओं को जन्म देगा; मेसोडर्म कंकाल की मांसपेशी, हृदय, गुर्दे, और संयोजी ऊतक कोशिकाओं 3,11,19 को जन्म देगा। सही ईबी आकार निर्धारित किया गया है, विभेदित कोशिकाओं की जरूरत ही मार्कर प्रोटीन की सही अभिव्यक्ति के लिए immunocytochemistry या FACS द्वारा विश्लेषण किया जा सके।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

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References

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