Metod för Isolerad * These authors contributed equally

Medicine
 

Summary

Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP) har tillåtit lungtransplantation hos människor att bli mer lättillgängliga genom att förmågan att bedöma organ och expandera donatorpool. Här beskriver vi utvecklingen av en råtta EVLP programmet och förfiningar som möjliggör en reproducerbar modell för framtida expansion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antalet acceptabla donator lungor tillgängliga för lungtransplantation är starkt begränsad på grund av dålig kvalitet. Ex vivo Lung Perfusion (EVLP) har tillåtit lungtransplantation hos människor att bli mer lättillgängliga genom att förmågan att bedöma organ och expandera donatorpool. Eftersom denna teknik utökar och förbättrar förmågan att potentiellt utvärdera och förbättra kvaliteten på undermåliga lungor före transplantation är ett kritiskt behov. För att mer noggrant utvärdera dessa metoder, behöver en reproducerbar djurmodell inrättas som skulle möjliggöra test av förbättrade tekniker och hantering av de donerade lungor samt till lungan transplantation mottagare. Dessutom kan en EVLP djurmodell av tillhörande patologier, t.ex. ventilation inducerad lungskada (VILI), skulle tillhandahålla en ny metod för att utvärdera behandlingar för dessa patologier. Här beskriver vi utvecklingen av en råtta EVLP lungprogram och förbättringar till detta migThOD som möjliggör en reproducerbar modell för framtida expansion. Vi beskriver också tillämpningen av denna EVLP system för att modellera VILI i rått lungorna. Målet är att ge forskarsamhället med viktig information och "pärlor av visdom" / tekniker som uppstod från trial and error och är kritiska till upprättandet av en EVLP system som är robust och reproducerbar.

Introduction

Klinisk Relevans

Det finns idag en brist på lämpliga lungor tillgängliga för transplantation med endast 19% av lungorna ska kunna utnyttjas nationellt leder till utdragna väntelista tid eller patienter dör i väntan transplantation 1. Bristen kan bero på äldre donatorer, trauma, infektion, multisystemisk organsvikt och ibland skadade donator lungorna vid skörd 2. Dessutom är lungan en bräcklig organ utanför brösthålan och standard transport och konserveringstekniker kan leda till nedbrytning och icke-viabla lungor. Därför upprätthålla och förbättra lung livskraft ex vivo har nyligen blivit ett stort fokus i lungtransplantationsmedicin.

Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP)

Ex-vivo lungblödning (EVLP) har utvecklats för att kontinuerligt BEGJUTA organ utvärderas för transplantation och möjliggör en period av bedömning att allaöden för potential lungräddning eller rekonditionering. EVLP kan förlänga totalt ur kroppsorgan ischemisk tid och låta de donerade organ för att resa längre sträckor 3. Typiskt är lungorna ventilerades vid 50% av total lungkapacitet eller 20 cmH 2 O av övre luftvägstrycket med en fraktion av inandat syre (FiO 2) av 30% till 50% 4. Bevarande lösning perfuseras vid 40-60 ml / kg (cirka 40% av den förutsagda hjärtutmatningen av 100 ml / kg) i människor och stora djur 5,6, men perfuseras vid cirka 20% av hjärtminutvolymen för råttor 7. Införandet av STEEN Solution har tillåtit mänskliga lungor att resa i RT miljöer utan utveckling av lungödem 9. Denna banbrytande arbete har förfinats av University of Toronto Lung Transplant Program 10-13 och utvärderas för bättre bedömning av marginaldonator lungor för transplantation 14,15. Emellertid, den optimala ventilation och perfusion förutsättningar som krävs för att regenerera marginella och / eller undermåliga lungor för transplantation är inte känd och är idag ett aktivt forskningsområde.

Isolerade lung perfusion system har använts i små djur för att orsaka lungskada, återskapa luftvägssjukdomar, och BEGJUTA lungorna med olika lösningar för att förhindra ischemisk skada. Forskare har skapat en liten-djurmodell för lungtransplantation genom att använda den isolerade lungan-perfusionssystem att härma EVLP protokoll som skulle kunna användas i människor och större djur 16-18. Emellertid har många utmaningar med avseende på de olika tekniker och parametrar som används för att efterlikna den mänskliga fysiologin denna experimentella modell. Framför allt finns det många nyanser att upprätthålla lung livskraft under EVLP. Dessa nyanser kan uppstå på grund av skillnader i skördeteknik, positiva ventilationstryckinställningar, perfusionsvätskan sammansättning och flödesförhållanden och kanylering av lungan. Theröre, är målet här för att ge forskarsamhället med ett antal felsökning och genomförande tips som vi har hittat leda till en robust metod för att implementera EVLP i en gnagarmodell.

Protocol

OBS: Alla procedurer utfördes enligt styr-linjer av Institutional Animal Care och National Research Council Handbok för human vård och användning av försöksdjur (IACUC) och har genomgått godkännande från Ohio State University IACUC kommitté.

1. Initial Setup

  1. Ställ upp EVLP kretsen och har varmt (37 ° C) perfusat som cirkulerar genom systemet före införliva fritt planterade lunga (figur 1).
  2. Ställ in varmt vattenbad, som används för att jackan perfusatet behållare, värmeväxlare, och artificiell thorax, till 37 ° C och cirkulerande (figur 1).
  3. Kör ett de-syresättning lösningen (t.ex., 6% O2, 8% CO2, 84% N2) motströms genom perfusatet i gasfiltret att säkerställa perfusatet har ~ 6% löst syre för experimentet.
    OBS: Denna de-syresatt perfusat gör bedömningen of lungfunktionen genom att mäta syret införes i perfusatet, post-orgel.
  4. Öppna datainsamlingsprogram och anslut lungartärtryckomvandlare, trakeal differentialtryckgivare, andningsflödet differentialtryckgivare, lungvikt transduktor och pumphastigheten givaren till EVLP kretsen och datainsamling / analog-till-digital-konverteraren ( Figur 2).
  5. Ställ in operationsbordet och operativa verktyg vid EVLP kretsen (Figur 3).
  6. Sätt upp en liten behållare med flytande kväve nära EVLP krets om prover kommer att erhållas.
    OBS: Författarens systemet har modifierats för att samla in pre-orgel och efter organ perfusat utan att avbryta de tryckflödesdynamik som potentiellt kan skada lungorna.

2. Beredning av narkosmedel och heparin, Anesthetization av Rat

  1. Sätt på följande personlig skyddsutrustning(PPE) innan du hanterar råttor och råttvävnad: kirurgisk mask, kirurgiska handskar, och disponibel klänning.
  2. Väg råttan och notera vikten.
  3. Förbered 1200 U / kg heparin.
  4. Förbered både 60 mg / kg ketamin och 5 mg / kg Xylazin i samma spruta, förbereda ketamin först.
  5. Intraperitonealt injicera blandning av ketamin och Xylazine i råtta och låt 5 minuter för råttan att bli medvetslös.
  6. Bekräfta korrekt anesthetization genom att kontrollera tå nypa reflex. Om råttan inte tillbaka sitt tå, är det inte att känna smärta.
  7. Flytta råtta till operationsbordet, fast i ryggläge, och spraya med alkohol för sterilisering.

3. Extraktion och Initial Ventilation av Rat lungor

  1. Förbered 4-20 cm långa silkessuturer (3-0 eller 4-0 bör räcka).
  2. Börja inspelning data med hjälp av datainsamlingsprogrammet.
  3. Kontrollera om lämplig anestesidjup, med hjälp av kirurgisk sax ange peritoneal cavitet genom en mittlinje laparotomi och injicera heparin in i den nedre hålvenen.
  4. Bär snittet cranially förbi munröret i halsen tills luftstrupen exponeras. Inte brista brösthålan (Figur 4A).
  5. Dissekera posterior till luftstrupen i mittlinjen och skjut en silkesutur posterior till luftstrupen (Figur 4B).
  6. Höj den främre delen av luftstrupen och göra en tvärgående snitt mellan broskringarna, högt på luftstrupen. Skär inte igenom den bakre membranös delen av luftstrupen vid denna punkt (Figur 4C).
  7. Kanylera luftstrupen med luftstrupen kanyl och säker med silkessutur (Figur 4D). Säkerställ att suturen ligatur är fäst i stansning för att mildra migrering av kanylen.
  8. Anslut trakea kanyl till ventilationskrets.
  9. Slå på mekanisk ventilator att starta mekaniskt ventilera lungar.
    OBS: Inledande inställningar valdes för att vara en tidalvolym på 4 ml / kg och positiv slutexpiratoriskt tryck (PEEP) 2 cmH 2 O. Dessa inställningar är de ursprungliga inställningarna och beroende på försöksbetingelserna kan justeras när orgeln är i ex vivo perfusionssystem.
  10. Ange brösthålan genom bröstbenet / xyphoid och fortsätta cranially mot halsgropen. Var noga med att undvika att röra lungorna.
    NOTERA: Som den råttlunga är ömtåligt, kan någon oavsiktlig manipulering leda till trauma och lungödem (Figur 5A).
  11. Med 2 upprullningsdon dra brösthålan för att korrekt exponera anatomin (Figur 5A). Än en gång, ta hand för att undvika att röra lungorna.
  12. Ta bräss med lätt förhöjning och dissektion.
  13. Shift de abdominala innehållet till en sida för att exponera antingen den nedre hålvenen (IVC) eller tarmkäxvenen (MV).
  14. Incise antingen IVC eller MV att exsanguinate råttan, ger dödshjälp.
  15. Placera en silkessutur posteriort till lungpulsådern och aorta som förberedelse för att fästa lungartärkanylen (figur 5B).
  16. Gör en 2-3 mm snitt på den främre ytan av den högra kammares utflöde och placera kanylen i snittet och in i huvudlungartären och säkra med silkessutur (figur 5C).
  17. Transekt apex av hjärtat för att ge tillgång till den vänstra ventrikeln och spola eventuella klumpar inom den pulmonella vaskulaturen genom att flöda ~ 15 ml av ett lågt K + elektrolytlösning genom lungartären och ut genom spetsen av hjärtat in i brösthålan ( Figur 5D).
  18. Anslut lungartären (PA) kanyl till EVLP kretsen. Se till inflödesledningen som kommer från kretsen till PA kanylen primas med perfusatet för att undvika att luft kommer in i hjärtat och lungorna.
  19. Slå påHuvud peristaltisk pump och ställ in den på en låg (~ 2 ml / min) hastighet att tillåta perfusat att köra genom lungartären och ut vänster kammare in i brösthålan. ** kritiskt steg ** Se till PA trycket inte spika så detta är ett tecken på antingen en blockering eller dålig kanyle (figur 6).
  20. Stäng av den peristaltiska pumpen.
  21. Placera en silkessutur bakom hjärtat, runt ventriklarna (Figur 7).
  22. Påbörja processen med kanyle vänster förmak genom att sätta in ett litet par av kirurgiska pincett i spetsen, genom mitralisklaffen, och in i vänster förmak.
    OBS: Detta kommer vidga mitralisklaffen och underlätta kanyle. Aggressiv utvidgning, eller för djupt dilatation, kan oavsiktligt SARGA vänster förmak gör upphandlingen ineffektiv.
  23. Ta pincetten från hjärtat.
  24. Sätt i vänstra förmaket kanyl i spetsen genom mitralisklaffen och in i vänster vidrium.
  25. Säkra vänster förmak kanylen med silkessutur bakom hjärtat (figur 8).
    OBS: Denna sutur kan vara "pre-bundna" för att underlätta kanyle.
  26. Anslut lungartären kanylen till ex vivo lung perfusionskretsen (figur 9A). Anslut inte vänster förmak kanyl till EVLP kretsen tills hjärtlungblocket har tagits bort helt från kroppen.
  27. Kläm matstrupen med en hemostat och skär under klämman (mellan klämman och diafragma) så att matstrupen kan användas för att höja hjärt strukturer kraniella.
  28. Rakt på sak dissekera den omgivande vävnaden och skär den nedåt aorta och hjälpfartyg för att befria hjärt-lungblocket som det höjs via matstrupen (figur 9B).
  29. Transekt trakea cephalad till trakealkanylen att helt fri hjärt-lungblock.
  30. Ta bort hjärtlungblocket och placera i designated plats på EVLP kretsen (figur 9C).
  31. Anslut det vänstra förmaket kanyl till utflödesslangen och starta huvud peristaltiska pumpen (figur 9D).

4. Ex vivo Perfusion av lungorna

  1. Snabbt ta bort ventilations linje från toppen av EVLP apparaten och fäst kåpan med trycksensorer, sedan in ventilationslinjen på toppen av huset på toppen av EVLP apparaten.
    OBS: Detta gör att ventilations uppgifter som ska registreras och tryck övervakas.
  2. Se till bubbelfällan är fylld med en tillräcklig mängd av perfusat så att inga luftbubblor (dvs., luftemboli) introduceras till lungorna.
  3. Sakta förändras ventilation och perfusion inställningar till önskade experimentella nivåer under den inledande 15 min. Dessutom, under den här inledande uppstartsfasen, öka perfusionen flödeshastigheten till den önskade hastigheten och / eller tryck.
    OBS: Programming ventilatorn att producera intermittenta suck andetag, som underlättar förflyttning av fluid ut ur lungan utrymme och därför fördröja uppkomsten av ödem, rekommenderas. Dessa kan framställas genom ventilatorer utrustade med suckfunktionen.
  4. Definiera "Tid 0" som den tid då ventilationsparametrar är vid en tidalvolym på 4 ml / kg, PEEP vid 2 cm H2O, och perfusion parametrarna är vid sina förväntade nivåer och förblir konstant.
  5. Om det behövs, ta perfusionsvätskan prover från provporten, blixt frysa i flytande kväve, och notera tiden av proverna.
  6. När experimentet är klar, isolera eventuella anatomiska stycken för insamling och antingen flash frysa i flytande kväve eller plats i fixeringslösning för vidare studier.

Representative Results

De realtid mekaniska data som samlas in genom datainsamling programmet kan enkelt analyseras för att testa valfritt antal hypoteser. Till exempel visar figur 10A genomsnittslung vikt genom 60 min från 10 råttexperiment där djuren ventilerade med låg tidalvolym / låg PEEP av 4 ml / kg och 2 cmH 2 O. Även om det är en mycket mindre ökning i lungvikt under hela experimentet, är denna ökning inte statistiskt signifikant (ANOVA, p = 0,92). Figur 10B visar den genomsnittliga pulmonella artärtrycket (PAP) genom 60 min från 12 råttexperiment. Den lägre PAP vid 0 min tidpunkt är ett resultat av lägre flöde och ventilationsinställningar som används i början av alla experiment och PAP förblir konstant efter denna tidpunkt med inga statistiskt signifikanta förändringar efter t = 10 min (ANOVA på leden, p = 0,89). Figur 10C visar pulmonell vaskulär resistans (PVR) via 60 min från 12 råttaexperiment och även om det finns en liten minskning i PVR efter t = 20 min, det var ingen statistiskt signifikant skillnad i PVR under detta experiment (ANOVA på leden, p = 0,65). I jämförelse med de PVR som uppges här, Noda et al. har visat PVR öka något över tiden 4 timmar. Men dessa författare rapporterar data i PVR börjar vid 1 timme i stället för i början av experimentet och inga standardavvikelsen värden finns 7. Noda et al. också visar inte lungödem data för de fyra hr experimenten så ingen jämförelse kan göras med de data som presenteras här i figur 10A. Stora skillnader i Noda et al. förfarande jämfört med vad som visas i detta dokument innefattar: a 1 tim kallt bevarande i LPS lösning innan EVLP råttor initialt ventilerat med en gasblandning inkluderande isofluran för att göra dem medvetslösa, var perfusatet lösningen kompletterad med 50 mg metylprednisolon och 50 mg av cefalosporin, total flow definierades som 20% av den beräknade hjärtminutvolym, har perfusionsvätskan prover tas först efter lungan hade ventilerats på 100% O 2 för 5 min före och experimentet kördes under 4 h.

Prover tagna under experimentet från perfusatet kan också analyseras för många ändamål. Som ett exempel, i fig 11 visar vi hur högt tidalvolym / hög PEEP ventilation kan inducera en pro-inflammatorisk reaktion i 60 min. För dessa experiment perfusatet från 4 råttor ventilerat enligt skadliga förhållanden, det vill säga hög tidalvolym på 10 ml / kg och hög PEEP av 8 cmH 2 O, analyserades med avseende pro- och antiinflammatoriska cytokiner IL1β, TNF och IL4 använder standard ELISA-tekniker. Som visas i figur 11, jämfört med cytokinnivåer innan ventilation (0 min), 60 min av skadlig ventilation resulterade i en statistiskt signifikant ökning av IL-1β och TNF (pro-inflammatoriska cytokiner) a nd ingen förändring i IL-4 (en anti-inflammatorisk cytokin) koncentration. Därför är detta EVLP systemet kan generera lungskada profiler som vanligen observeras under mekanisk ventilation.

Figur 1
Figur 1. Diagram och fotografi av smådjur ex vivo lungblödning (EVLP) krets. Bokstäver i diagrammet stämmer med bokstäver i fotografiet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Alla givare är ordentligt anslutna till styrboxar."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. operationsbordet råttan är ordentligt inställd intill ex vivo lungblödning (EVLP) krets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. (A) Ett snitt görs kranialt för att exponera luftstrupen. Brösthålan är inte utsatt. (B) En silkessutur placeras bakom luftstrupen. (C) Luftstrupen är delvis skuren för att förbereda för kanyle. (D) Trakea kanyl placeras i positionering n och säkras med en silkessutur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. (A) Brösthålan dras tillbaka för att tillåta åtkomst till hjärtat och lungan. (B) Förberedelse för placering sutur bakom lungartären. (C) Den lungartären kanyl och bundna med den tidigare placerade silkessutur. (D) En låg K + elektrolytlösning spolas genom lungartären och ut vänster förmak för att avlägsna eventuella blodproppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

lways "> Figur 6
Figur 6. Öka pulmonell arteriell flödet vid spolning lungan kan orsaka lungartärtrycket att öka dramatiskt. Om kanyle utfördes korrekt och det finns ingen större blockering, trycket ska minska. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Figur 7
Figur 7. Silk sutur placeras runt hela hjärtat som förberedelse för vänster förmak kanyler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

n-page = "always"> Figur 8
Figur 8. Den vänstra förmak kanylen är fäst på plats med ett silkessutur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figur 9. (A) Den lungartären kanylen är ansluten till ex-vivo lung perfusionskretsen. (B) Matstrupen är fastklämd och bindväv är rakt på sak dissekeras för att avlägsna hjärtlung blocket. (C) Den hjärt-lung blocket avlägsnas från brösthålan och placerades i den ex-vivo lung perfusionskretsen. (D) Den vänstra förmak är ansluten till ex-vivo lung perfusionskretsen. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10
Figur 10. (A) Lung vikt av Sprague Dawley-råttor genom 60 min av ex vivo lung perfusion (n = 10). (B) artärtryck av Sprague Dawley-råttor genom 60 min av ex vivo lung perfusion (n = 12). (C) Pulmonell vaskulär resistans Sprague Dawley genom 60 min av ex vivo lungblödning (n = 12), indikerar NS ingen statistiskt signifikant skillnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

</ Html "Figur 11" src = "/ filer / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg" />
Figur 11. Effekt av ett h ventilation vid höga tidalvolymer (10 ml / kg) och hög PEEP (8 cmH 2 O) på pro- och antiinflammatoriska cytokin-koncentrationer i perfusatet. N = 4, * anger statistiskt signifikant skillnad med avseende på 0 tim prov (p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 12
Figur 12. (A) En korrekt ventilation och perfusion lunga ansluten till EVLP kretsen. (B) Hög slutexpiratoriskt tryck (PEEP) orsakar en reva vid trakea bifurkationen orsakar bubblor bildas vid skada och fylla den artificiella thorax. es / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 13
Figur 13. (A) pulmonell arteriell kanyl. Denna kanyl är mindre än det vänstra förmaket kanylen. (B) Vänster atrium kanyl. Denna kanyl är mycket större än lungartären kanylen. (C) Luftstrupe kanyl. Denna kanyl har ribbor till stöd i att säkra luftstrupen med silke sutur. Slutet som sätts in i luftstrupen är också något påpekas att hjälpa till att sätta in kanylen i luftstrupen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

09fig14highres.jpg "/>
Figur 14. (A) Hjärtat apex hålls av en pincett som den högra ventrikeln är på väg att snittas för att kanylera lungartären. (B) Utvidgning av mitralisklaffen annulus med ett par små trubbiga ändar pickuper gör det lättare att visualisera vägarna in i vänster förmak. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Övervakningssystem

Vilka saker ser ut när experimentet går bra:

När kanyler har placerats i kretsen och lungorna ventiler, det finns flera sätt att säkerställa att systemet fungerar korrekt. Det bör inte finnas några läckor av perfusat hela linjen. Den pulmonell vaskulär resistans (PVR) bör förbli relativt konstant (förutsatt ett konstant flöde). Den syreutbytet bör öka när ventilatorn fungerar korrekt och utvidga lungorna att rekrytera fler alveoler för gasutbyte. Figur 12A visar god ventilation och perfusion lungor anslutna till EVLP krets i artificiella thorax.

Vilka saker ser ut när experimentet inte körs väl:

Det finns några gemensamma frågor som har haft den högsta förekomst under början stadier av en EVLP experiment. Den första och enklaste to botemedlet är en läcka i ledningen lämnar från lungan. Detta märks genom en pool av perfusatet sammanslagning enligt en del av kretsen och nivån i behållaren hela tiden minskar. Kontrollera och dra åt eventuella rörkopplingar runt spillområdet och inspektera själva röret för en läcka. Om denna läcka inträffar innan lungan, kan det även införa bubblor in i lungan. Detta bör åtgärdas så snart som möjligt som luftbubblor i perfusatet kommer att resultera i vävnadsskada och orsaka en betydande ökning i PVR. Det kan också finnas en läcka från lunga eller en av kanylerna. Detta kan orsakas av antingen glidning av en kanyl eller ett hinder i spännande linjen orsakar en tryckuppbyggnad. Inspektera positionen för båda kanyler för att säkerställa varken har halkat eller vriden. Bör också övervakas PA trycket under denna process eftersom en momentan ökning av PA trycket är ett självklart tecken på att ett hinder av något slag har nyligen inträffat. Figur 12Bvisar en brusten lunga som spruckit på grund av höga tryck. En läcka från lungan i sig kan också orsakas av en reva i vävnaden. Det här problemet kan eller inte kan vara repar men ompositionering och dra åt kanylerna är det bästa alternativet i detta scenario.

Nyckel lärande Points / Möjligheter:

Trial and error utveckling av ex vivo lungblödning systemet har tillåtit oss att identifiera flera viktiga frågor som vi fört fram här för att underlätta en effektiv tillämpning av EVLP systemet. Först, vad gäller upphandling, är det viktigt att vanliga anestesitekniker följs ordentligt söva djuren (tillräckligt anestesi, injektion i bukhinnan) och efterlevnad av alla IACUC politik krävs. Den kanyler (visas i figur 13 A, B och C) bör repetitivt spolas för att avlägsna eventuell koagel och / eller skräp i lung vasculature. När det gäller val av djur, föreslår vi att du använder Sprague Dawley eller Lewis-råttor som väger 250-350 g. Särskild försiktighet bör iakttas vid kanyle råttor som väger nära 250 g eftersom fartygen blir mindre och därför mycket svårare att cannulate utan att skada kärl. Om mindre råttor, eller en musmodell, ska användas, kan mindre kanyl behöva användas.

Tracheal kanyle är inte normalt utmanande så länge suturen säkras ordentligt genom att först passera en silkesutur posterior till luftstrupen efter dissekera de omgivande fascia och före kanyle. Följ den här med en främre snitt 1-2 trakealringar ovanför suturen att passera kanylen. Bind fyrkantiga knop i mellan de trakeala ringarna i syfte att säkra den inuti ett spår för bättre säkerhet (Figur 4C). Kanyle av lungartären (PA) är mer utmanande jämfört med trakealkanylen. Följande steg användes i denna studieför denna procedur. Först, ta tag i hjärtat apex med en pincett. Passera en annan pincett i tvär sinus och trä en sutur för att säkra kanylen i proximala PA. Incise högra ventrikeln omedelbart före höger kammares utflöde (RVOT) (figur 14A). Efter snitt i RVOT kommer kanylen styras mot lungartären utflöde. Med suturen i position bakom lungartären / aorta före rätt ventriculotomy ökar effektiviteten (figur 5C). Kanylen bör säkras på plats med sutur för att förhindra förskjutning. En stor komplikation kan uppstå om PA kanyl är inte i rätt anatomisk orientering. Kanylen kan införas för långt och bara BEGJUTA en gren eller bli mal-placerad med vridning av hjärt-lungprovet efter att de avlägsnats från brösthålan. Detta kan lätt orienteras tillbaka till den ursprungliga positionen för att bevara den korrekta vinkeln för anatomical ståndpunkt. Slutligen är vänster förmak (LA) kanyle den mest utmanande delen av förfarandet. LA kanyl måste placeras inom vänster förmak. Med vävnaderna är extremt sprött, vara uppmärksam att inte använda betydande kraft eller vridning i syfte att förhindra en tår inom lungvenen & vänster atrium som sedan skulle göra experimentet unsalvageable. PA kanyl är bäst lämpad innan LA kanylen. En vänster ventriculotomy med avlägsnande av spetsen har visats störa cordae tendinae och tillåta enklare åtkomst genom mitralis broschyrer. Dessutom gör den ventriculotomy det lättare att dilatera och visualisera mitralisklaffen och att mata kanylen genom mitralventilen. Dilation av annulus mitralis med ett par små trubbändade pickuper kan göras i syfte att visualisera-tarmkanalen till LA (Figur 14B). Sutur bör placeras bakom hjärtat före kanyler. Detta kan göras genom att helt enkelt lyfta hjärtat upp med ett par small trubbiga ändar pickuper och placera suturen under och över hjärtat. LA är nu redo att kanyl. Mata LA kanylen genom pickuper för att korrekt visualisera placeringen av kanylen i vänster förmak. Var särskilt försiktig att inte rubba kanylen tillbaka in i vänster kammare. Suturen bör sedan tätt säkras längs myokardiet av vänster kammare. Fästa suturen till vänster förmak kan ockludera hela eller en del av kanylen.

Under förfarandet är det avgörande att ingen luft kvar i inflödessektionen av apparaten. Någon betydande luft kan ge en luftemboli öka PVR (effektivt en "air-lock"), som kommer att resultera i en mycket lägre perfusatet flöde för ett givet tryck. Olika punkter kan användas för att avlägsna luft i systemet. Luft inuti utflödessektionen förväntas och bör inte ha någon skadlig effekt på lungorna. En grismodell för pulmonell hypertoni har varitvisat att återskapa patologin ur kontinuerliga små mängder luft över en 8-veckors period. Den ökade luft minskar mängden perfusion närvarande medan orsakar inflammation till omgivande vävnader 19.

Initieringen av perfusionen kan inträffa en gång kanyler är klar men innan röret som kommer från LA är ansluten till EVLP linjen. Perfusatet bör köras igenom för att rensa ut eventuella blodproppar och detta perfusat kan tömmas i bröstkorgen utan några problem. Växla perfusatet pumpen till manuellt läge och långsamt öka flödet till ~ 2 ml / min möjliggör noggrann övervakning av PA trycket. Trycken över 20-30 cmH 2 O kan indikera ett hinder och tittar efter perfusat lämnar LA är också en indikator, men detta kan vara mycket svårt att se. Om trycket inte ökar till över 20-30 cmH 2 O, stanna pumpen och kontrollera båda kanyle. När trycket är konstant runt 10-20 cmH H2O tillåter the perfusat att köra igenom och in i brösthålan för 2 min. Vid denna tid linjen från LA kan anslutas till EVLP kretsen. Perfusatet pumphastigheten kan ökas till 5-10 ml / min. Som vätskehuvudet skrider genom kretsen, kommer det att finnas en ökning i PA-tryck på grund av ökningen i höjd hos vätskehuvudet och därför det statiska trycket. Om vätskan inte kan strömma över den högsta punkten i linjen, kan det vara nödvändigt att antingen applicera en sugkraft på den motsatta änden av linjen eller försöka sänka den högsta delen av linjen. När denna fråga övervinnas, bör perfusatet cirkulera utan några problem.

Några frågor bör övervakas med avseende på ventilatorn. För det första kan vridning av luftrören / luftstrupe och hjärt-lung läge uppstå som lungorna blir mer ödematös och vikten ökar. Det är viktigt för kanylerna att stanna kvar i en relativt nära anatomiskt läge, därför att ändra endera eller båda kanyle kan vara nödvändig. Tryck eller volymstyrda fläktar samt positiva eller negativa ventilation kan användas med den här EVLP systemet. För råttmodell, har vi funnit att använda övertryck, fungerar volymstyrd ventilation bra på tidalvolymer mellan 4-10 ml / kg och vid positiva slutexpiratoriskt tryck (PEEP) mellan 2-8 cmH 2 O. Däremot kan en PEEP av 8 cmH 2 O orsaka en eventuell bristning vid bifurkationen av luftstrupen. Efter varje experiment (eller en serie experiment, om de utförs back-to-back), ventilationsledningen som leder till luftstrupen skall rengöras från bronkoalveolärt lavage (BAL) vätska som kan ha rest upp i luftstrupen. Denna vätska hårdnar om de lämnas orörda och kan helt blockera ventilationslinjen.

Perfusatet kompositionen är kritisk för en framgångsrik EVLP experiment. En 5% dextran blandning möjliggör lung perfusionen som är nära till fysiologiska betingelser, upprätthåller ett stabilt onkotiskt tryck för att driva fluid back in i kärlsystemet för att förhindra ödem och förhindrar blodpropp inom lungkärlen. Det är viktigt att notera att vissa arter av råttor kan vara allergisk mot dextran som kan orsaka lungödem 20. Innehållet i perfusatet var konsekvent mellan alla experimentella grupper i denna studie, därför dextran innehåll inte bör vara en confounder. Den onkotiskt trycket är en kritisk variabel som har potential att förbättra eller producera vävnadsödem. Kommersiellt tillgängliga perfusionslösningar som är optimerade för kall statisk lagring eller normotermisk perfusioner har använts i detta system för att öka lung viabilitet gånger. Vi noterar att vissa av dessa lösningar innehåller albumin och ett bekymmer är möjligheten till bovint albumin utlöser en inflammatorisk reaktion i gnaga lungan. Den optimala perfusatet komposition är en pågående föremål för undersökning, måste perfusatet att beakta det onkotiska trycket, det osmotiska trycket och buffertkapacitet. We rekommenderar att lösningen baseras på en modifierad Krebs-Henseleit lösning eller cellodlingsmedia. Den onkotiskt trycket bör hållas av dextran eller albumin, beroende på tillämpning. Den perfusionstryck och flödeshastighet påverkar perfusion parametrarna organ och supra-fysiologiska kan göra orgeln benägen till mekaniskt trauma.

Visuella indikatorer under Experiment:

Det finns många visuella referenser samt indikationer från realtidsdata som kan användas för att avgöra om en EVLP experiment går bra. Lungan förblir samma storlek och kommer att tömma på samma volym efter varje andetag. Det kommer även att finnas någon läckande från lungan i sig. PVR, lungvikt, och efterlevnad förblir relativt konstant. Syreproduktionen förblir konstant eller öka något.

Det finns många visuella indikatorer när lungan blir äventyras under ett experiment. Lungan blir ödematös and växer snabbt i storlek och vikt. Färgen på lungförändringar (från en solbränna-rosa till vitt) och fickor av vätska kan identifieras i vävnaden. Om luftstrupen eller lung bristningar från barotrauma eller över buk, kommer det att bubbla ur skada (Figur 12B). Syreproduktionen kommer att minska och PVR och efterlevnad kommer att dramatiskt öka.

Potentialen för att använda en EVLP modell på små djur såsom gnagare öppnar dörren för framtida studier att förbättra behandlingen av lungtransplantationer. Dock kräver det lilla djurmodell en bättre förståelse för att verkligen efterlikna en lungtransplantation. Denna modell kan användas i framtiden för att förbättra medicinska behandlingar och definiera utgångsvärdet för framtida lungtransplanterade studier.

Disclosures

Inget

Acknowledgements

Författarna vill tacka för den hjälp av Harvard Apparatus, särskilt Stephanie Pazniokas, MS (Physiology Systems & regenerativ medicin) för deras hjälp i kretskort, modifiering och felsökning av perfusionskretsen och Xvivo Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) för tillhandahålla icke-klinisk användning lung plegia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics