Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP) har tillåtit lungtransplantation hos människor att bli mer lättillgängliga genom att förmågan att bedöma organ och expandera donatorpool. Här beskriver vi utvecklingen av en råtta EVLP programmet och förfiningar som möjliggör en reproducerbar modell för framtida expansion.
Antalet acceptabla donator lungor tillgängliga för lungtransplantation är starkt begränsad på grund av dålig kvalitet. Ex vivo Lung Perfusion (EVLP) har tillåtit lungtransplantation hos människor att bli mer lättillgängliga genom att förmågan att bedöma organ och expandera donatorpool. Eftersom denna teknik utökar och förbättrar förmågan att potentiellt utvärdera och förbättra kvaliteten på undermåliga lungor före transplantation är ett kritiskt behov. För att mer noggrant utvärdera dessa metoder, behöver en reproducerbar djurmodell inrättas som skulle möjliggöra test av förbättrade tekniker och hantering av de donerade lungor samt till lungan transplantation mottagare. Dessutom kan en EVLP djurmodell av tillhörande patologier, t.ex. ventilation inducerad lungskada (VILI), skulle tillhandahålla en ny metod för att utvärdera behandlingar för dessa patologier. Här beskriver vi utvecklingen av en råtta EVLP lungprogram och förbättringar till detta migThOD som möjliggör en reproducerbar modell för framtida expansion. Vi beskriver också tillämpningen av denna EVLP system för att modellera VILI i rått lungorna. Målet är att ge forskarsamhället med viktig information och "pärlor av visdom" / tekniker som uppstod från trial and error och är kritiska till upprättandet av en EVLP system som är robust och reproducerbar.
Klinisk Relevans
Det finns idag en brist på lämpliga lungor tillgängliga för transplantation med endast 19% av lungorna ska kunna utnyttjas nationellt leder till utdragna väntelista tid eller patienter dör i väntan transplantation 1. Bristen kan bero på äldre donatorer, trauma, infektion, multisystemisk organsvikt och ibland skadade donator lungorna vid skörd 2. Dessutom är lungan en bräcklig organ utanför brösthålan och standard transport och konserveringstekniker kan leda till nedbrytning och icke-viabla lungor. Därför upprätthålla och förbättra lung livskraft ex vivo har nyligen blivit ett stort fokus i lungtransplantationsmedicin.
Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP)
Ex-vivo lungblödning (EVLP) har utvecklats för att kontinuerligt BEGJUTA organ utvärderas för transplantation och möjliggör en period av bedömning att allaöden för potential lungräddning eller rekonditionering. EVLP kan förlänga totalt ur kroppsorgan ischemisk tid och låta de donerade organ för att resa längre sträckor 3. Typiskt är lungorna ventilerades vid 50% av total lungkapacitet eller 20 cmH 2 O av övre luftvägstrycket med en fraktion av inandat syre (FiO 2) av 30% till 50% 4. Bevarande lösning perfuseras vid 40-60 ml / kg (cirka 40% av den förutsagda hjärtutmatningen av 100 ml / kg) i människor och stora djur 5,6, men perfuseras vid cirka 20% av hjärtminutvolymen för råttor 7. Införandet av STEEN Solution har tillåtit mänskliga lungor att resa i RT miljöer utan utveckling av lungödem 9. Denna banbrytande arbete har förfinats av University of Toronto Lung Transplant Program 10-13 och utvärderas för bättre bedömning av marginaldonator lungor för transplantation 14,15. Emellertid, den optimala ventilation och perfusion förutsättningar som krävs för att regenerera marginella och / eller undermåliga lungor för transplantation är inte känd och är idag ett aktivt forskningsområde.
Isolerade lung perfusion system har använts i små djur för att orsaka lungskada, återskapa luftvägssjukdomar, och BEGJUTA lungorna med olika lösningar för att förhindra ischemisk skada. Forskare har skapat en liten-djurmodell för lungtransplantation genom att använda den isolerade lungan-perfusionssystem att härma EVLP protokoll som skulle kunna användas i människor och större djur 16-18. Emellertid har många utmaningar med avseende på de olika tekniker och parametrar som används för att efterlikna den mänskliga fysiologin denna experimentella modell. Framför allt finns det många nyanser att upprätthålla lung livskraft under EVLP. Dessa nyanser kan uppstå på grund av skillnader i skördeteknik, positiva ventilationstryckinställningar, perfusionsvätskan sammansättning och flödesförhållanden och kanylering av lungan. Theröre, är målet här för att ge forskarsamhället med ett antal felsökning och genomförande tips som vi har hittat leda till en robust metod för att implementera EVLP i en gnagarmodell.
Övervakningssystem
Vilka saker ser ut när experimentet går bra:
När kanyler har placerats i kretsen och lungorna ventiler, det finns flera sätt att säkerställa att systemet fungerar korrekt. Det bör inte finnas några läckor av perfusat hela linjen. Den pulmonell vaskulär resistans (PVR) bör förbli relativt konstant (förutsatt ett konstant flöde). Den syreutbytet bör öka när ventilatorn fungerar korrekt och utvidga lungorna att rekrytera fler alveoler för gasutbyte. Figur 12A visar god ventilation och perfusion lungor anslutna till EVLP krets i artificiella thorax.
Vilka saker ser ut när experimentet inte körs väl:
Det finns några gemensamma frågor som har haft den högsta förekomst under början stadier av en EVLP experiment. Den första och enklaste to botemedlet är en läcka i ledningen lämnar från lungan. Detta märks genom en pool av perfusatet sammanslagning enligt en del av kretsen och nivån i behållaren hela tiden minskar. Kontrollera och dra åt eventuella rörkopplingar runt spillområdet och inspektera själva röret för en läcka. Om denna läcka inträffar innan lungan, kan det även införa bubblor in i lungan. Detta bör åtgärdas så snart som möjligt som luftbubblor i perfusatet kommer att resultera i vävnadsskada och orsaka en betydande ökning i PVR. Det kan också finnas en läcka från lunga eller en av kanylerna. Detta kan orsakas av antingen glidning av en kanyl eller ett hinder i spännande linjen orsakar en tryckuppbyggnad. Inspektera positionen för båda kanyler för att säkerställa varken har halkat eller vriden. Bör också övervakas PA trycket under denna process eftersom en momentan ökning av PA trycket är ett självklart tecken på att ett hinder av något slag har nyligen inträffat. Figur 12Bvisar en brusten lunga som spruckit på grund av höga tryck. En läcka från lungan i sig kan också orsakas av en reva i vävnaden. Det här problemet kan eller inte kan vara repar men ompositionering och dra åt kanylerna är det bästa alternativet i detta scenario.
Nyckel lärande Points / Möjligheter:
Trial and error utveckling av ex vivo lungblödning systemet har tillåtit oss att identifiera flera viktiga frågor som vi fört fram här för att underlätta en effektiv tillämpning av EVLP systemet. Först, vad gäller upphandling, är det viktigt att vanliga anestesitekniker följs ordentligt söva djuren (tillräckligt anestesi, injektion i bukhinnan) och efterlevnad av alla IACUC politik krävs. Den kanyler (visas i figur 13 A, B och C) bör repetitivt spolas för att avlägsna eventuell koagel och / eller skräp i lung vasculature. När det gäller val av djur, föreslår vi att du använder Sprague Dawley eller Lewis-råttor som väger 250-350 g. Särskild försiktighet bör iakttas vid kanyle råttor som väger nära 250 g eftersom fartygen blir mindre och därför mycket svårare att cannulate utan att skada kärl. Om mindre råttor, eller en musmodell, ska användas, kan mindre kanyl behöva användas.
Tracheal kanyle är inte normalt utmanande så länge suturen säkras ordentligt genom att först passera en silkesutur posterior till luftstrupen efter dissekera de omgivande fascia och före kanyle. Följ den här med en främre snitt 1-2 trakealringar ovanför suturen att passera kanylen. Bind fyrkantiga knop i mellan de trakeala ringarna i syfte att säkra den inuti ett spår för bättre säkerhet (Figur 4C). Kanyle av lungartären (PA) är mer utmanande jämfört med trakealkanylen. Följande steg användes i denna studieför denna procedur. Först, ta tag i hjärtat apex med en pincett. Passera en annan pincett i tvär sinus och trä en sutur för att säkra kanylen i proximala PA. Incise högra ventrikeln omedelbart före höger kammares utflöde (RVOT) (figur 14A). Efter snitt i RVOT kommer kanylen styras mot lungartären utflöde. Med suturen i position bakom lungartären / aorta före rätt ventriculotomy ökar effektiviteten (figur 5C). Kanylen bör säkras på plats med sutur för att förhindra förskjutning. En stor komplikation kan uppstå om PA kanyl är inte i rätt anatomisk orientering. Kanylen kan införas för långt och bara BEGJUTA en gren eller bli mal-placerad med vridning av hjärt-lungprovet efter att de avlägsnats från brösthålan. Detta kan lätt orienteras tillbaka till den ursprungliga positionen för att bevara den korrekta vinkeln för anatomical ståndpunkt. Slutligen är vänster förmak (LA) kanyle den mest utmanande delen av förfarandet. LA kanyl måste placeras inom vänster förmak. Med vävnaderna är extremt sprött, vara uppmärksam att inte använda betydande kraft eller vridning i syfte att förhindra en tår inom lungvenen & vänster atrium som sedan skulle göra experimentet unsalvageable. PA kanyl är bäst lämpad innan LA kanylen. En vänster ventriculotomy med avlägsnande av spetsen har visats störa cordae tendinae och tillåta enklare åtkomst genom mitralis broschyrer. Dessutom gör den ventriculotomy det lättare att dilatera och visualisera mitralisklaffen och att mata kanylen genom mitralventilen. Dilation av annulus mitralis med ett par små trubbändade pickuper kan göras i syfte att visualisera-tarmkanalen till LA (Figur 14B). Sutur bör placeras bakom hjärtat före kanyler. Detta kan göras genom att helt enkelt lyfta hjärtat upp med ett par small trubbiga ändar pickuper och placera suturen under och över hjärtat. LA är nu redo att kanyl. Mata LA kanylen genom pickuper för att korrekt visualisera placeringen av kanylen i vänster förmak. Var särskilt försiktig att inte rubba kanylen tillbaka in i vänster kammare. Suturen bör sedan tätt säkras längs myokardiet av vänster kammare. Fästa suturen till vänster förmak kan ockludera hela eller en del av kanylen.
Under förfarandet är det avgörande att ingen luft kvar i inflödessektionen av apparaten. Någon betydande luft kan ge en luftemboli öka PVR (effektivt en "air-lock"), som kommer att resultera i en mycket lägre perfusatet flöde för ett givet tryck. Olika punkter kan användas för att avlägsna luft i systemet. Luft inuti utflödessektionen förväntas och bör inte ha någon skadlig effekt på lungorna. En grismodell för pulmonell hypertoni har varitvisat att återskapa patologin ur kontinuerliga små mängder luft över en 8-veckors period. Den ökade luft minskar mängden perfusion närvarande medan orsakar inflammation till omgivande vävnader 19.
Initieringen av perfusionen kan inträffa en gång kanyler är klar men innan röret som kommer från LA är ansluten till EVLP linjen. Perfusatet bör köras igenom för att rensa ut eventuella blodproppar och detta perfusat kan tömmas i bröstkorgen utan några problem. Växla perfusatet pumpen till manuellt läge och långsamt öka flödet till ~ 2 ml / min möjliggör noggrann övervakning av PA trycket. Trycken över 20-30 cmH 2 O kan indikera ett hinder och tittar efter perfusat lämnar LA är också en indikator, men detta kan vara mycket svårt att se. Om trycket inte ökar till över 20-30 cmH 2 O, stanna pumpen och kontrollera båda kanyle. När trycket är konstant runt 10-20 cmH H2O tillåter the perfusat att köra igenom och in i brösthålan för 2 min. Vid denna tid linjen från LA kan anslutas till EVLP kretsen. Perfusatet pumphastigheten kan ökas till 5-10 ml / min. Som vätskehuvudet skrider genom kretsen, kommer det att finnas en ökning i PA-tryck på grund av ökningen i höjd hos vätskehuvudet och därför det statiska trycket. Om vätskan inte kan strömma över den högsta punkten i linjen, kan det vara nödvändigt att antingen applicera en sugkraft på den motsatta änden av linjen eller försöka sänka den högsta delen av linjen. När denna fråga övervinnas, bör perfusatet cirkulera utan några problem.
Några frågor bör övervakas med avseende på ventilatorn. För det första kan vridning av luftrören / luftstrupe och hjärt-lung läge uppstå som lungorna blir mer ödematös och vikten ökar. Det är viktigt för kanylerna att stanna kvar i en relativt nära anatomiskt läge, därför att ändra endera eller båda kanyle kan vara nödvändig. Tryck eller volymstyrda fläktar samt positiva eller negativa ventilation kan användas med den här EVLP systemet. För råttmodell, har vi funnit att använda övertryck, fungerar volymstyrd ventilation bra på tidalvolymer mellan 4-10 ml / kg och vid positiva slutexpiratoriskt tryck (PEEP) mellan 2-8 cmH 2 O. Däremot kan en PEEP av 8 cmH 2 O orsaka en eventuell bristning vid bifurkationen av luftstrupen. Efter varje experiment (eller en serie experiment, om de utförs back-to-back), ventilationsledningen som leder till luftstrupen skall rengöras från bronkoalveolärt lavage (BAL) vätska som kan ha rest upp i luftstrupen. Denna vätska hårdnar om de lämnas orörda och kan helt blockera ventilationslinjen.
Perfusatet kompositionen är kritisk för en framgångsrik EVLP experiment. En 5% dextran blandning möjliggör lung perfusionen som är nära till fysiologiska betingelser, upprätthåller ett stabilt onkotiskt tryck för att driva fluid back in i kärlsystemet för att förhindra ödem och förhindrar blodpropp inom lungkärlen. Det är viktigt att notera att vissa arter av råttor kan vara allergisk mot dextran som kan orsaka lungödem 20. Innehållet i perfusatet var konsekvent mellan alla experimentella grupper i denna studie, därför dextran innehåll inte bör vara en confounder. Den onkotiskt trycket är en kritisk variabel som har potential att förbättra eller producera vävnadsödem. Kommersiellt tillgängliga perfusionslösningar som är optimerade för kall statisk lagring eller normotermisk perfusioner har använts i detta system för att öka lung viabilitet gånger. Vi noterar att vissa av dessa lösningar innehåller albumin och ett bekymmer är möjligheten till bovint albumin utlöser en inflammatorisk reaktion i gnaga lungan. Den optimala perfusatet komposition är en pågående föremål för undersökning, måste perfusatet att beakta det onkotiska trycket, det osmotiska trycket och buffertkapacitet. We rekommenderar att lösningen baseras på en modifierad Krebs-Henseleit lösning eller cellodlingsmedia. Den onkotiskt trycket bör hållas av dextran eller albumin, beroende på tillämpning. Den perfusionstryck och flödeshastighet påverkar perfusion parametrarna organ och supra-fysiologiska kan göra orgeln benägen till mekaniskt trauma.
Visuella indikatorer under Experiment:
Det finns många visuella referenser samt indikationer från realtidsdata som kan användas för att avgöra om en EVLP experiment går bra. Lungan förblir samma storlek och kommer att tömma på samma volym efter varje andetag. Det kommer även att finnas någon läckande från lungan i sig. PVR, lungvikt, och efterlevnad förblir relativt konstant. Syreproduktionen förblir konstant eller öka något.
Det finns många visuella indikatorer när lungan blir äventyras under ett experiment. Lungan blir ödematös and växer snabbt i storlek och vikt. Färgen på lungförändringar (från en solbränna-rosa till vitt) och fickor av vätska kan identifieras i vävnaden. Om luftstrupen eller lung bristningar från barotrauma eller över buk, kommer det att bubbla ur skada (Figur 12B). Syreproduktionen kommer att minska och PVR och efterlevnad kommer att dramatiskt öka.
Potentialen för att använda en EVLP modell på små djur såsom gnagare öppnar dörren för framtida studier att förbättra behandlingen av lungtransplantationer. Dock kräver det lilla djurmodell en bättre förståelse för att verkligen efterlikna en lungtransplantation. Denna modell kan användas i framtiden för att förbättra medicinska behandlingar och definiera utgångsvärdet för framtida lungtransplanterade studier.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för den hjälp av Harvard Apparatus, särskilt Stephanie Pazniokas, MS (Physiology Systems & regenerativ medicin) för deras hjälp i kretskort, modifiering och felsökning av perfusionskretsen och Xvivo Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) för tillhandahålla icke-klinisk användning lung plegia.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |