Metode til isoleret * These authors contributed equally

Medicine
 

Summary

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) har tilladt lungetransplantation i mennesker til at blive mere let tilgængelige ved at give mulighed for at vurdere organer og udvide donorpuljen. Her beskriver vi udviklingen af ​​en rotte EVLP program og raffinementer, som muliggør en reproducerbar model for fremtidig ekspansion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antallet af acceptable donorer lunger til rådighed for lungetransplantation er stærkt begrænset på grund af dårlig kvalitet. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) har tilladt lungetransplantation i mennesker til at blive mere let tilgængelige ved at give mulighed for at vurdere organer og udvide donorpuljen. Da denne teknologi udvider og forbedrer evnen til potentielt at evaluere og forbedre kvaliteten af ​​substandard lunger før transplantation er et kritisk behov. For mere nøje at evaluere disse metoder skal etableres, som ville give mulighed for afprøvning af forbedrede teknikker og forvaltning af de donerede lunger samt til lungen transplantationen modtager en reproducerbar dyremodel. Endvidere kan en EVLP dyremodel af associerede patologier, fx ventilation induceret lungeskade (VILI) vil tilvejebringe en hidtil ukendt metode til at evaluere behandlinger for disse sygdomme. Her beskriver vi udviklingen af ​​en rotte EVLP lunge program og raffinementer til dette migThOD der mulighed for en reproducerbar model for fremtidig ekspansion. Vi beskriver også anvendelsen af ​​denne EVLP system til at modellere VILI i rotte lungerne. Målet er at give forskningsmiljøet med vigtige oplysninger og "perler af visdom" / teknikker, der opstod fra trial and error, og er afgørende for om et EVLP system, der er robust og reproducerbar.

Introduction

Klinisk relevans

Der er i øjeblikket en mangel på egnede lunger til rådighed til transplantation med kun 19% af lungerne er i stand til at blive udnyttet nationalt fører til langvarige Vent-liste tid eller patienter, der dør afventer transplantation 1. Manglen kan skyldes ældre donorer, traume, infektion, multi-system, organsvigt og undertiden sårede donor lunger upon høst 2. Desuden lungen er en skrøbelig organ uden for brysthulen og standard transport og konservering teknikker kan føre til forringelse og ikke-levedygtige lunger. Derfor vedligeholdelse og forbedring lunge levedygtighed ex-vivo er for nylig blevet en stor fokus på lungetransplantation medicin.

Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP)

Ex-vivo lunge perfusion (EVLP) har udviklet sig til løbende at perfundere organer evalueres til transplantation og muliggør en periode med vurdering, at alleOWS for potentialet i lunge genoplivning eller istandsættelse. EVLP kan forlænge alt ud af kroppen organ iskæmisk tid og lade de donerede organer til at rejse yderligere afstande 3. Typisk lungerne ventileret ved 50% af den samlede lungekapacitet eller 20 CMH 2 O af top luftvejstryk med en fraktion af inspireret oxygen (FiO 2) på 30% til 50% 4. Preservation opløsning perfunderet ved 40-60 ml / kg (ca. 40% af den forudsagte minutvolumen på 100 ml / kg) hos mennesker og store dyr 5,6, men er perfunderet på omkring 20% af minutvolumen for rotter 7. Inddragelsen af STEEN løsning har tilladt menneskelige lunger til at rejse i RT-miljøer uden udvikling af lungeødem 9. Denne pionerarbejde er blevet forfinet af University of Toronto lungetransplantation Program 10-13 og evalueres for bedre vurdering af marginale donor lunger til transplantation 14,15. Den optimale ventilation og perfusion betingelser er nødvendige for at regenerere marginale og / eller sub-standard lunger til transplantation er ikke kendt og er i øjeblikket et aktivt forskningsområde.

Isolerede lunge perfusion er blevet anvendt i små dyr til at forårsage lungeskade, genskabe luftvejssygdomme og perfundere lungerne med forskellige løsninger for at forhindre iskæmisk skade. Forskere har skabt en lille dyremodel for lungetransplantation ved hjælp af isolerede lunge-perfusion systemet at efterligne EVLP protokoller, der kan anvendes i mennesker og større dyr 16-18. Men denne forsøgsmodel har mange udfordringer med hensyn til de forskellige teknikker og parametre, der anvendes til at efterligne human fysiologi. Især er der mange finesser i at opretholde lunge levedygtighed under EVLP. Disse finesser kan opstå på grund af forskelle i høst teknik positive trykindstillinger ventilation Perfusatprøver sammensætning og strømningsforhold og kanylering af lungen. Therør, målet her er at give forskersamfundet med en række fejlfinding og implementering tip, som vi har fundet føre til en robust metode til gennemførelse EVLP i en gnaver-model.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med de vejledende-linjer af den institutionelle Animal Care og National Research Council Guide for Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (IACUC) og har gennemgået godkendes af Ohio State University IACUC udvalg.

1. Indledende opsætning

  1. Opsætning af EVLP kredsløb og har varm (37 ° C) perfusat cirkulerer gennem systemet, før indarbejde tidligere plantet lunge (figur 1).
  2. Indstil varmt vandbad, der anvendes til jakke perfusatet reservoir, varmeveksler, og kunstig brystkasse, til 37 ° C og cirkulerende (figur 1).
  3. Kør en deoxygenering opløsning (f.eks 6% O 2, 8% CO2, 84% N2) mod tiden gennem perfusatet i gassen filter for at sikre perfusatet har ~ 6% opløst oxygen til eksperimentet.
    BEMÆRK: Denne de-iltet perfusat muliggør en evaluering of lungefunktionen ved måling af oxygen indføres i perfusatet, post-organ.
  4. Åbn datafangst program og tilslut lungepulsåren tryktransducer, luftrør differentialtryktransducer, respiratorisk flow differentialtryktransducer, lunge vægt transducer, og pumpehastighed transducer til EVLP kredsløbet og data-erhvervelse / analog-til-digital omformer boks ( figur 2).
  5. Opsætning operationsbordet og praktiske værktøjer ved EVLP kredsløb (figur 3).
  6. Opsætning af en lille beholder med flydende nitrogen nær EVLP kredsløb, hvis der opnås prøver.
    BEMÆRK: Forfatterens systemet er blevet ændret for at indsamle før orgel og post-orgel perfusat uden at afbryde de tryk-flow dynamik, der potentielt kan såre lungerne.

2. Fremstilling af anæstesi og heparin, bedøvelse af Rat

  1. Sæt på følgende personlige værnemidler(PPE) før håndtering rotter og rotte væv: kirurgisk maske, kirurgiske handsker, og disponibel kjole.
  2. Rotten vejes, og massen noteres.
  3. Forbered 1.200 U / kg heparin.
  4. Forbered både 60 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin i den samme sprøjte, forberedelse af ketamin først.
  5. Intraperitonealt injicere blandingen af ​​ketamin og xylazin i rotter og tillade 5 minutter for rotten bliver bevidstløs.
  6. Bekræft ordentlig bedøvelse ved at kontrollere tå knivspids refleks. Hvis rotten ikke trække sin tå, er det ikke føle smerte.
  7. Flyt rotte til operationsbordet, sikre i liggende stilling, og spray med alkohol til sterilisering.

3. Udvinding og Indledende ventilation af rottelunger

  1. Forbered 4-20 cm lange silkesuturer (3-0 eller 4-0 burde være nok).
  2. Begynd registrering af data ved hjælp af datafangst program.
  3. Check for passende dybde af anæstesi, ved hjælp af kirurgiske sakse indtaste peritoneal cavity af en midterlinje laparotomi og indsprøjte heparin i vena cava inferior.
  4. Carry snittet kranialt forbi manubrium ind i halsen, indtil luftrøret eksponeres. Du må ikke udvise brud brysthulen (figur 4A).
  5. Skær posterior til luftrøret i midterlinjen og skub en silkesutur posterior til luftrøret (figur 4B).
  6. Hæv forreste del af luftrøret og foretage en tværgående indsnit mellem de bruskagtige ringe, højt på trachea. Skær ikke igennem den bageste membranøs del af luftrøret på dette tidspunkt (figur 4C).
  7. Kanyler luftrøret med luftrøret kanyle og sikkert med silke sutur (figur 4D). Kontroller, at suturen ligatur fastgøres i udhugning at afbøde migration af kanylen.
  8. Slut trachea kanyle til ventileringskredsløbet.
  9. Tænd for mekanisk ventilator til at starte mekanisk ventilering af luNGS.
    BEMÆRK: Indledende indstillinger blev udvalgt til at være en tidalvolumen på 4 ml / kg og positiv sluteksspiratorisk tryk (PEEP) 2 CMH 2 O. Disse indstillinger er de oprindelige indstillinger og afhængigt af de eksperimentelle betingelser kan justeres, når orglet er i ex-vivo perfusion system.
  10. Indtast brysthulen gennem brystbenet / Xyphoid og fortsætte kranialt mod suprasternal hak. Sørg for at undgå at røre lungerne.
    BEMÆRK: Da rottelunge er skrøbelige, kan utilsigtet manipulation fører til traumer og lungeødem (figur 5A).
  11. Anvendelse af 2 retraktor trække brysthulen korrekt blotlægge anatomi (figur 5A). Endnu en gang sørge for at undgå at røre lungerne.
  12. Fjern thymus med lille højde og stump dissektion.
  13. Skift abdominale indhold til en side for at blotlægge enten inferior vena cava (IVC) eller mesenteriske vene (MV).
  14. Incise enten IVC eller MV at exsanguinate rotter give eutanasi.
  15. Placer en silkesutur posterior til det pulmonale arterie og aorta i forberedelse til fastgørelse lungepulsåren kanyle (figur 5B).
  16. Lav en 2-3 mm incision på den forreste overflade af den højre ventrikel udstrømning tarmkanalen og placere kanylen i snittet og i de vigtigste lungepulsåren og fastgør med silke sutur (figur 5C).
  17. Transekt toppunktet af hjertet til at give adgang til den venstre ventrikel og skylle eventuelle blodpropper i lungekarrene ved at strømme ~ 15 ml af en lav K + elektrolytopløsning gennem lungepulsåren og ud gennem spidsen af hjertet i brysthulen ( Figur 5D).
  18. Tilslut lungepulsåren (PA) kanyle til EVLP kredsløb. Sørg tilstrømningen linje kommer fra kredsløb til PA kanyle primes med perfusat at undgå luft ind i hjerte og lunger.
  19. Tændvigtigste peristaltisk pumpe og sæt den til en lav (~ 2 ml / min) hastighed for at tillade perfusat at køre gennem lungepulsåren og ud i venstre ventrikel ind i brysthulen. ** kritiske trin ** Sørg for PA trykket ikke spike som dette er et tegn på enten en blokering eller dårlig kanylering (figur 6).
  20. Sluk den peristaltiske pumpe.
  21. Placer en silkesutur bag hjertet omkring ventriklerne (Figur 7).
  22. Begynde processen med kanylering det venstre atrium ved at indsætte et lille par kirurgiske pincet i spidsen gennem mitralklappen, og ind i venstre atrium.
    BEMÆRK: Dette vil spile mitralklappen og lette kanylering. Aggressiv dilatation, eller for dybt dilatation, kan uforvarende lacerate venstre atrium gøre indkøb ineffektiv.
  23. Fjern pincet fra hjertet.
  24. Sæt venstre atrium kanyle i spidsen gennem mitralklappen og ind i venstre vedrium.
  25. Fastgør venstre atrium kanyle med silke sutur bag hjertet (figur 8).
    BEMÆRK: Denne sutur kan være "pre-bundet" til lette kanylering.
  26. Slut lungepulsåren kanyle til ex-vivo lunge perfusionskredsløb (figur 9A). Tilslut ikke venstre atrium kanyle til EVLP kredsløbet indtil hjerte-lunge-blok er blevet fuldstændigt fjernet fra kroppen.
  27. Klemme spiserøret med en hæmostat og skæres under klemmen (mellem klemmen og membranen), således at spiserøret kan anvendes til at hæve kardiopulmonal strukturer kraniale.
  28. Ligeud dissekere det omgivende væv og skære den nedadgående aorta og hjælpestoffer fartøjer at frigøre hjerte-lunge blok, som det hæves via spiserøret (figur 9B).
  29. Transekt luftrøret kranialt til tracheale kanyle til helt fri hjerte-lunge blok.
  30. Tag hjerte-lunge blok og placerer i designated placering på EVLP kredsløb (figur 9C).
  31. Tilslut venstre atrium kanyle til udstrømning linje og starte vigtigste peristaltisk pumpe (figur 9D).

4. Ex Vivo Perfusion af lungerne

  1. Hurtigt fjerne ventilationen linje fra toppen af ​​EVLP apparatet og fastgør huset med tryksensorer, sæt derefter ventilation linje på toppen af ​​huset på toppen af ​​EVLP apparatet.
    BEMÆRK: Dette vil give data ventilation skal registreres og tryk overvåges.
  2. Sørg boblen fælden er fyldt med en passende mængde perfusat så der ikke luftbobler (dvs. luft emboli) introduceres til lungerne.
  3. Langsomt ændrer ventilation og perfusion indstillinger til de ønskede eksperimentelle niveauer i den indledende 15 minutter. Desuden blev der i denne indledende ramp-up fasen, øge perfusion strømningshastigheden til den ønskede hastighed og / eller tryk.
    BEMÆRK: Programming ventilatoren til at producere intermitterende suk vejrtrækninger, som letter bevægelse af fluid ud af lungen rum og dermed forsinke indtræden af ​​ødem, anbefales. Disse kan fremstilles ved ventilatorer udstyret med suk funktion.
  4. Definer "Time 0" som det tidspunkt, hvor ventilation parametre er på en tidalvolumen på 4 ml / kg, PEEP ved 2 cm H 2 O, og perfusion parametre er på deres forventede niveau og forbliver konstant.
  5. Hvis det er nødvendigt, tage Perfusatprøver fra prøven porten, flash fryse i flydende nitrogen, og bemærk tidspunktet for prøverne.
  6. Når eksperimentet er færdig, isolere eventuelle nødvendige anatomiske stykker for indsamling og enten flash fryse i flydende nitrogen eller sted ved fastsættelsen løsning til yderligere undersøgelser.

Representative Results

De realtid mekaniske data indsamlet gennem datafangst program kan nemt analyseres for at afprøve nogen række hypoteser. For eksempel, figur 10A viser de gennemsnitlige lungevægt gennem 60 min fra 10 rotteforsøg hvor dyrene blev ventileret med en lav respirationsvolumen / lav PEEP på 4 ml / kg og 2 CMH 2 O. Selv om der er en meget lille stigning i lungevægt hele eksperimentet, denne stigning er ikke statistisk signifikant (ANOVA, p = 0,92). Figur 10B viser det gennemsnitlige pulmonale arterielle tryk (PAP) gennem 60 min fra 12 rotter eksperimenter. Den lavere PAP ved 0 min tidspunkt er et resultat af lavere flow og ventilation indstillinger, der bruges i begyndelsen af ​​alle forsøg og PAP forbliver konstant efter dette tidspunkt med ingen statistisk signifikante ændringer efter t = 10 min (ANOVA på rækker, s = 0,89). Figur 10C viser den pulmonale vaskulære modstand (PVR) gennem 60 min fra 12 rotteeksperimenter og selv om der er et lille fald i PVR efter t = 20 min, var der ingen statistisk signifikant forskel i PVR i dette eksperiment (ANOVA på rækker, p = 0,65). I sammenligning med de PVR data er vist her, Noda et al. har vist PVR at stige en smule over tid i 4 timer. Men disse Forfatterne rapporterer data i PVR begyndende ved 1 time i stedet for starten af forsøget, og ingen standardafvigelsesværdier leveres 7. Noda et al. også viser ikke lungeødem data for de 4 timer eksperimenter så kan der ikke sammenligning med de oplysninger, der præsenteres her i figur 10A. Store forskelle i Noda et al. procedure i forhold til hvad der er vist i dette dokument, omfatter: 1 times kold konservering i LPS-opløsning før EVLP blev rotter oprindeligt ventileret med en gasblanding herunder isofluran for at gøre dem bevidstløs blev perfusatet opløsning suppleret med 50 mg methylprednisolon og 50 mg af cephalosporin, total flow blev defineret som 20% af det beregnede minutvolumen blev Perfusatprøver kun træffes efter lungen var blevet ventileret på 100% O 2 i 5 minutter før og forsøget blev kørt i 4 timer.

Prøver udtaget under forsøget fra perfusatet kan også analyseres til mange formål. Som et eksempel har vi i figur 11 viser, hvordan høj respirationsvolumen / høj PEEP ventilation kan inducere en pro-inflammatorisk reaktion i 60 min. Til disse eksperimenter perfusatet fra 4 rotter ventileres under skadelige forhold, dvs. stor respirationsvolumen på 10 ml / kg og høj PEEP på 8 CMH 2 O, blev analyseret for pro- og antiinflammatoriske cytokiner IL1β, TNFa og IL4 anvendelse af standard ELISA-teknikker. Som vist i figur 11, i forhold til cytokinniveauer før ventilation (0 min), 60 min skadevoldende ventilation resulterede i en statistisk signifikant stigning i IL-1β og TNFa (pro-inflammatoriske cytokiner) en nd ingen ændring i IL-4 (et anti-inflammatorisk cytokin) koncentration. Derfor er denne EVLP systemet er i stand til at generere lungeskade profiler almindeligvis observeret under mekanisk ventilation.

Figur 1
Figur 1. Diagram og fotografi af små dyr ex-vivo lunge perfusion (EVLP) kredsløb. Bogstaver i diagrammet passer sammen med bogstaver i fotografiet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Alle transducere er sikkert forbundet med kontrolbokse."> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Rotten operationsbordet er sikkert sat op ved siden af ex vivo lunge perfusion (EVLP) kredsløb. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. (A) En incision kranialt at blotlægge trachea. Brysthulen ikke er udsat. (B) en silkesutur er placeret bag luftrøret. (C) Trachea delvist skåret at forberede kanylering. (D) Den luftrøret kanyle placeres i positio n og sikret med en silke sutur. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. (A) brysthulen trækkes tilbage for at give adgang til hjertet og lungerne. (B) Fremstilling til anbringelse sutur bag lungepulsåren. (C) Den lungepulsåren kanyleres og bundet med den tidligere placeret silkesutur. (D) En lav K + elektrolytopløsning skylles gennem lungepulsåren og ud i venstre atrium for at fjerne eventuelle blodpropper. Klik her for at se et større version af denne figur.

lways "> Figur 6
Figur 6. Forøgelse af pulmonal arteriel flow ved gennemskylning lungerne kan forårsage pulmonal arteriel pres for at stige drastisk. Hvis kanylering blev udført korrekt, og der er ingen større blokering, trykket skulle falde. Klik her for at se en større udgave af dette tal .

Figur 7
Figur 7. silkesutur placeres rundt om hele hjerte som forberedelse til venstre atrium kanylering. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

n-side = "altid"> Figur 8
Figur 8. Den venstre forkammer kanyle holdes på plads med en silke sutur. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 9
Figur 9. (A) lungepulsåren kanyle er forbundet til ex-vivo lunge perfusionskredsløb. (B) Spiserøret er fastspændt og bindevæv er stumpt dissekeret for at fjerne hjerte-lunge blok. (C) hjerte-lunge blok fjernes fra brysthulen og anbringes i ex-vivo lunge perfusionskredsløb. (D) Den venstre atrium er forbundet med ex-vivo lunge perfusionskredsløb. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 10
Figur 10. (A) lungevægt af Sprague Dawley-rotter ved 60 min på ex vivo lunge perfusion (n = 10). (B) Pulmonal arterietryk af Sprague Dawley-rotter ved 60 min på ex vivo lunge perfusion (n = 12). (C) pulmonal vaskulær modstand Sprague Dawley-rotter gennem 60 min af ex vivo lunge perfusion (n = 12), NS indikerer ingen statistisk signifikant forskel. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

</ Html "Figur 11" src = "/ files / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg" />
Figur 11. Virkning af 1 time ventilation ved høje tidal volumener (10 ml / kg) og høj PEEP (8 CMH 2 O) på pro- og antiinflammatoriske cytokinkoncentrationer i perfusatet. N = 4, * indikerer statistisk signifikant forskel med forhold til 0 HR prøve (p <0,05). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 12
Figur 12. (A) En korrekt ventilation og perfusion lunge tilsluttet EVLP kredsløb. (B) Høj positiv sluteksspiratorisk tryk (PEEP) forårsager en tåre på luftrøret tvedeling forårsager bobler til at danne på skaden og udfylde den kunstige brystkassen. es / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 13
Figur 13. (A) pulmonal kanyle. Denne kanyle er mindre end det venstre atrium kanyle. (B) venstre atrium kanyle. Denne kanyle er meget større end lungepulsåren kanyle. (C) Luftrøret kanyle. Denne kanyle har ribben at hjælpe med at sikre luftrøret med silke sutur. Den ende, der er indsat i luftrøret er også let tilspidset til at støtte i at indsætte kanylen ind i luftrøret. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

09fig14highres.jpg "/>
Figur 14. (A) Hjertet spids holdes af et par pincet som højre hjertekammer er ved at blive indsnit for at kanyle lungepulsåren. (B) udvidelse af mitralklappen annulus med et par små stumpe-ended pick-ups gør det nemmere at visualisere tarmkanalen ind i venstre atrium. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

SYSTEM OVERVÅGNING

Hvilke ting ser ud, når eksperimentet kører godt:

Når kanyler er blevet placeret i kredsløbet og lungerne ventilation, er der flere måder at sikre, at systemet fungerer korrekt. Der bør ikke være nogen lækager af perfusat hele linjen. Den pulmonale vaskulære modstand (PVR) bør forblive relativt konstant (under forudsætning af en konstant strøm). Den ilt udveksling bør stige, når ventilatoren fungerer korrekt og udvide lungerne til at ansætte flere alveoler for gas udveksling. Figur 12A viser god ventilation og perfunderet lunger forbundet til EVLP kredsløb inde i kunstige brystkassen.

Hvilke ting ser ud, når eksperiment ikke kører godt:

Der er et par almindelige problemer, der har haft den højeste forekomst i begyndelsen faser af en EVLP eksperiment. Den første og nemmeste to afhjælpning er en lækage i ledningen kommer ud fra lungen. Dette er bemærkelsesværdigt ved en pulje af perfusat sammenlægning under en del af kredsløbet, og det i beholderen hele tiden faldende. Kontrollér og spænd eventuelle rørkoblingerne omkring spildområdet og inspicere røret selv for en lækage. Hvis denne lækage inden i lungerne, kan det også indføre bobler i lungerne. Dette bør afhjælpes så hurtigt som muligt, da luftbobler i perfusatet vil resultere i vævsskade og forårsage en væsentlig stigning i PVR. Der kan også være en lækage fra lungen eller en af ​​kanyler. Dette kan skyldes enten glidning af en kanyle eller en obstruktion i spændende linje forårsager en trykopbygning. Undersøg positionen for begge kanyler hverken at sikre er gledet eller snoet. Bør også overvåges PA tryk under denne proces, fordi en øjeblikkelig stigning i PA tryk er en indlysende tegn på, at en forhindring af en slags for nylig har fundet sted. Figur 12Bviser en bristet lunge, der bristede grundet høje tryk. En lækage fra selve lungen kan også være forårsaget af en tåre i vævet. Dette problem kan eller ikke kan erstattes, men repositionering og efterspænding af kanyler er den bedste løsning i dette scenario.

Vigtig læring Points / muligheder:

Trial and error udvikling af det færdige vivo lunge perfusionssystem har givet os mulighed for at identificere en række centrale spørgsmål, som vi skitsere her for at lette en effektiv gennemførelse af EVLP system. Først med hensyn til indkøb, er det vigtigt, at standard bedøvende teknikker følges korrekt bedøve dyrene (nok bedøvende, injektion i bughinden) og tilslutning til alle IACUC politikker er påkrævet. Kanylerne (vist i figur 13 A, B og C), bør gentagne gange skylles for at fjerne enhver størkne og / eller snavs i den pulmonale vasculature. Med hensyn til valg af dyr, foreslår vi at bruge Sprague Dawley eller Lewis-rotter, der vejer 250-350 g. Der bør udvises særlig forsigtighed ved kanylering rotter vejer tæt på 250 g, da skibene vil være mindre og derfor langt vanskeligere at kanyle uden at skade karrene. Hvis mindre rotter eller en musemodel, der skal anvendes, kan mindre kanyle skal anvendes.

Tracheal kanylering er ikke typisk udfordrende, så længe suturen er sikret korrekt ved først at passere en silkesutur posteriort for luftrøret efter dissekere de omgivende fascia og før kanylering. Følg dette med en forreste snit 1-2 trachealringe over suturen at passere kanylen. Bind firkantede knuder i mellem trachealringe for at sikre det i en rille for bedre sikkerhed (figur 4C). Kanylering af lungepulsåren (PA) er mere udfordrende i forhold til tracheal kanyle. De følgende trin blev anvendt i denne undersøgelsefor denne procedure. Først tage fat i hjerte spids med en pincet. Pass anden tang i den tværgående sinus og tråd en sutur at fastgøre kanylen i den proksimale PA. Incise højre hjertekammer umiddelbart før den højre ventrikulære udstrømning tarmkanalen (RVOT) (figur 14A). Efter indsnit i RVOT vil kanylen styres hen imod lungepulsåren udstrømning tarmkanalen. Under suturen i position bag lungepulsåren / aorta før højre ventriculotomy øger effektiviteten (figur 5C). Kanylen skal sikres på plads med sutur for at forhindre forskydning. En alvorlig komplikation kan opstå, hvis PA kanylen ikke er i den korrekte anatomiske orientering. Kanylen kan indsættes for langt og kun perfundere en gren eller blive mal-placeret med snoning af hjerte-lunge prøve efter udtagning fra brysthulen. Dette kan let orienteres tilbage til den oprindelige position for at bevare den korrekte vinkel af anatomical position. Endelig venstre forkammer (LA) kanylering er den mest udfordrende del af proceduren. LA kanylen skal placeres i venstre atrium. Med vævene være yderst letsmuldrende, være opmærksom ikke at bruge betydelig kraft eller vridning for at forhindre en tåre i lungevenen & venstre atrium, som derefter ville gøre forsøget genanvendelige. PA kanylen er bedst placeret før LA kanylen. En venstre ventriculotomy med fjernelse af spidsen har vist sig at forstyrre cordae tendinae og tillade lettere adgang gennem mitral foldere. Også ventriculotomy gør det lettere at spile og visualisere mitralklappen og at fodre kanylen gennem mitralklappen. Dilatation af mitralklappen annulus med et par små stumpendede pick-ups kan gøres for at visualisere tarmkanalen i LA (figur 14B). Sutur skal placeres bag hjertet før kanylering. Dette kan gøres blot ved at løfte hjertet ved hjælp af et par small stumpendebehandlet pick-ups og placere suturen nedenunder og på tværs af hjertet. LA er nu klar til at være kanylerede. Feed LA kanylen gennem pick-ups med henblik på korrekt visualisere placeringen af ​​kanylen ind i venstre atrium. Vær særlig opmærksom på ikke at fjerne kanylen tilbage i den venstre ventrikel. Suturen bør derefter stramt fastgjort langs myokardiet af den venstre ventrikel. Sikring af sutur til venstre atrium kan okkludere hele eller en del af kanylen.

Under proceduren, er det afgørende, at ingen luft forbliver i tilstrømningen del af apparatet. Enhver væsentlig luft kan producere en luftembolisme øge PVR (effektivt en "air-lock"), som vil resultere i en meget lavere perfusatet flow for et givet tryk. Forskellige punkter kan anvendes til at fjerne luft i systemet. Luft inde udstrømning sektion forventes og bør ikke have nogen skadelig virkning på lungerne. En svinemodel for pulmonal hypertension har væretvist at genskabe patologien fra kontinuerlige små mængder luft over en periode 8 uger. Den øgede luft nedsætter mængden af perfusion til stede samtidig forårsager betændelse til de omgivende væv 19.

Indledningen af ​​perfusion kan forekomme, når kanylering er komplet, men før røret kommer fra LA er forbundet til EVLP linje. Perfusat skal køres igennem for at rydde eventuelle blodpropper og denne perfusat kan tømmes i brystvæggen uden nogen problemer. Skift perfusatet pumpe til manuel drift og langsomt øge strømningshastigheden til ~ 2 ml / min giver mulighed for nøje overvågning af PA pres. Pres på 20-30 CMH 2 O kan indikere en obstruktion og ser for perfusat forlader LA er også en indikator, men det kan være meget svært at se. Hvis trykket stiger til over 20-30 CMH 2 O, stop pumpen og igen begge kanyleringerne. Når trykket er konstant omkring 10-20 CMH 2 O tillade the perfusatet til at løbe igennem og ind i brysthulen i 2 min. På dette tidspunkt linjen fra LA kan tilsluttes til EVLP kredsløb. Perfusatet pumpehastighed kan øges til 5-10 ml / min. Som flydende hoved skrider frem gennem kredsløbet, vil der være en stigning i PA tryk på grund af stigningen i højden af ​​væsken hoved og derfor det statiske tryk. Hvis væsken ikke kan strømme over det højeste punkt på den linje, kan det være nødvendigt enten at anvende en sugekraft på den modsatte ende af linjen eller forsøge at sænke den højeste del af linjen. Når dette spørgsmål er overvundet, bør perfusatet cirkulere uden problemer.

Et par spørgsmål bør overvåges med hensyn til ventilatoren. For det første kan vridning af bronkier / luftrøret og hjerte-lunge position forekomme som lungerne blive mere edematous og vægten øges. Det er vigtigt for kanylerne at forblive i en forholdsvis tæt anatomisk position derfor ændre eller begge kanylee kan være nødvendig. Tryk og den store kontrollerede ventilatorer samt positive eller negative ventilation kan anvendes med denne EVLP system. For rottemodellen, har vi fundet ved hjælp af positivt tryk, volumen kontrolleret ventilation fungerer godt ved respirationsmængde mellem 4-10 ml / kg og ved positive sluteksspiratorisk tryk (PEEP) mellem 2-8 CMH 2 O. En PEEP på 8 CMH 2 O kan imidlertid forårsage en mulig brud ved bifurkationen af luftrøret. Efter hvert forsøg (eller et sæt af forsøg, hvis den udføres back-to-back), ventilationen, der fører til luftrøret skal være renset for enhver bronchoalveolar lavage (BAL) væske, der kan have rejst op luftrøret. Denne væske vil hærde hvis urørt og kan helt blokere ventilationen linje.

Perfusatet sammensætning er kritisk for en vellykket EVLP eksperiment. En 5% dextran blanding tillader lunge perfusion der er tæt på fysiologiske betingelser, har en stabil onkotisk tryk til at drive væske Back i vaskulaturen at forhindre ødem og forhindrer trombose inden for de pulmonale kar. Det er vigtigt at bemærke, at nogle arter af rotter kan være allergiske over for dextran som kan forårsage lungeødem 20. Indholdet af perfusatet var generelt for alle forsøgsgrupper i denne undersøgelse, hvorfor dextran indhold bør ikke være en confounder. Den onkotisk tryk er en kritisk variabel, der har potentiale til at forbedre eller producere vævsødem. Kommercielt tilgængelige perfusionsopløsninger der er optimeret til koldt statisk opbevaring eller normotermiske perfusioner er blevet anvendt i dette system for at forøge lunge levedygtighed gange. Vi bemærker, at nogle af disse opløsninger indeholder albumin og en bekymring er muligheden for bovin albumin udløser et inflammatorisk respons i gnaver lunge. Selv optimal perfusatet sammensætning er en løbende genstand for undersøgelse, perfusatet nødt til at tage hensyn til den onkotisk tryk, det osmotiske tryk og bufferkapacitet. We anbefaler, at løsningen baseres på en modificeret Krebs-Henseleit opløsning eller celledyrkningsmedier. Den onkotiske pres bør opretholdes af dextran eller albumin, afhængigt af programmet. Den perfusion tryk og flow påvirker orgel og overnationale fysiologisk perfusion parametre kan gøre orglet udsat for mekanisk traume.

Visuelle indikatorer i eksperiment:

Der er mange visuelle signaler samt indikationer fra real-time data, der kan anvendes til at bestemme, om en EVLP eksperiment kører godt. Lungerne vil forblive den samme størrelse og vil tage gassen til samme volumen efter hver åndedrag. Der vil heller ikke være nogen lækage fra selve lungen. Den PVR, lunge vægt, og overholdelse af dem vil være forholdsvis konstant. Oxygen produktion vil være konstant eller stige svagt.

Der er mange visuelle indikatorer, når lungerne bliver kompromitteret under et eksperiment. Lungerne bliver edematous enND vokser hurtigt i størrelse og vægt. Farven på lungeforandringer (fra en tan-lyserød til hvid) og lommer af væske kan identificeres i væv. Hvis luftrøret eller lunge brud fra barotrauma eller derover distension, vil der blive boblende fra det sted, skade (figur 12B). Ilt produktionen vil falde, og PVR og overholdelse vil dramatisk øge samt.

Potentialet i at bruge en EVLP model på små dyr såsom gnavere åbner døren for fremtidige undersøgelser forbedre behandlingen af ​​lunge transplantationer. Men den lille dyremodel kræver en bedre forståelse lige efterligne en lungetransplantation. Denne model kan anvendes i fremtiden for at forbedre medicinske behandlinger og definere baseline parametre for fremtidige lungetransplantation studier.

Disclosures

Ingen

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra Harvard Apparatus, især Stephanie Pazniokas, MS (Fysiologi Systems & regenerativ medicin) for deres bistand i kredsløb samling, ændring og fejlfinding af perfusionskredsløbet og XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) for at tilvejebringe ikke-klinisk anvendelse pulmonal plegia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics