Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) har tilladt lungetransplantation i mennesker til at blive mere let tilgængelige ved at give mulighed for at vurdere organer og udvide donorpuljen. Her beskriver vi udviklingen af en rotte EVLP program og raffinementer, som muliggør en reproducerbar model for fremtidig ekspansion.
Antallet af acceptable donorer lunger til rådighed for lungetransplantation er stærkt begrænset på grund af dårlig kvalitet. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) har tilladt lungetransplantation i mennesker til at blive mere let tilgængelige ved at give mulighed for at vurdere organer og udvide donorpuljen. Da denne teknologi udvider og forbedrer evnen til potentielt at evaluere og forbedre kvaliteten af substandard lunger før transplantation er et kritisk behov. For mere nøje at evaluere disse metoder skal etableres, som ville give mulighed for afprøvning af forbedrede teknikker og forvaltning af de donerede lunger samt til lungen transplantationen modtager en reproducerbar dyremodel. Endvidere kan en EVLP dyremodel af associerede patologier, fx ventilation induceret lungeskade (VILI) vil tilvejebringe en hidtil ukendt metode til at evaluere behandlinger for disse sygdomme. Her beskriver vi udviklingen af en rotte EVLP lunge program og raffinementer til dette migThOD der mulighed for en reproducerbar model for fremtidig ekspansion. Vi beskriver også anvendelsen af denne EVLP system til at modellere VILI i rotte lungerne. Målet er at give forskningsmiljøet med vigtige oplysninger og "perler af visdom" / teknikker, der opstod fra trial and error, og er afgørende for om et EVLP system, der er robust og reproducerbar.
Klinisk relevans
Der er i øjeblikket en mangel på egnede lunger til rådighed til transplantation med kun 19% af lungerne er i stand til at blive udnyttet nationalt fører til langvarige Vent-liste tid eller patienter, der dør afventer transplantation 1. Manglen kan skyldes ældre donorer, traume, infektion, multi-system, organsvigt og undertiden sårede donor lunger upon høst 2. Desuden lungen er en skrøbelig organ uden for brysthulen og standard transport og konservering teknikker kan føre til forringelse og ikke-levedygtige lunger. Derfor vedligeholdelse og forbedring lunge levedygtighed ex-vivo er for nylig blevet en stor fokus på lungetransplantation medicin.
Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP)
Ex-vivo lunge perfusion (EVLP) har udviklet sig til løbende at perfundere organer evalueres til transplantation og muliggør en periode med vurdering, at alleOWS for potentialet i lunge genoplivning eller istandsættelse. EVLP kan forlænge alt ud af kroppen organ iskæmisk tid og lade de donerede organer til at rejse yderligere afstande 3. Typisk lungerne ventileret ved 50% af den samlede lungekapacitet eller 20 CMH 2 O af top luftvejstryk med en fraktion af inspireret oxygen (FiO 2) på 30% til 50% 4. Preservation opløsning perfunderet ved 40-60 ml / kg (ca. 40% af den forudsagte minutvolumen på 100 ml / kg) hos mennesker og store dyr 5,6, men er perfunderet på omkring 20% af minutvolumen for rotter 7. Inddragelsen af STEEN løsning har tilladt menneskelige lunger til at rejse i RT-miljøer uden udvikling af lungeødem 9. Denne pionerarbejde er blevet forfinet af University of Toronto lungetransplantation Program 10-13 og evalueres for bedre vurdering af marginale donor lunger til transplantation 14,15. Den optimale ventilation og perfusion betingelser er nødvendige for at regenerere marginale og / eller sub-standard lunger til transplantation er ikke kendt og er i øjeblikket et aktivt forskningsområde.
Isolerede lunge perfusion er blevet anvendt i små dyr til at forårsage lungeskade, genskabe luftvejssygdomme og perfundere lungerne med forskellige løsninger for at forhindre iskæmisk skade. Forskere har skabt en lille dyremodel for lungetransplantation ved hjælp af isolerede lunge-perfusion systemet at efterligne EVLP protokoller, der kan anvendes i mennesker og større dyr 16-18. Men denne forsøgsmodel har mange udfordringer med hensyn til de forskellige teknikker og parametre, der anvendes til at efterligne human fysiologi. Især er der mange finesser i at opretholde lunge levedygtighed under EVLP. Disse finesser kan opstå på grund af forskelle i høst teknik positive trykindstillinger ventilation Perfusatprøver sammensætning og strømningsforhold og kanylering af lungen. Therør, målet her er at give forskersamfundet med en række fejlfinding og implementering tip, som vi har fundet føre til en robust metode til gennemførelse EVLP i en gnaver-model.
SYSTEM OVERVÅGNING
Hvilke ting ser ud, når eksperimentet kører godt:
Når kanyler er blevet placeret i kredsløbet og lungerne ventilation, er der flere måder at sikre, at systemet fungerer korrekt. Der bør ikke være nogen lækager af perfusat hele linjen. Den pulmonale vaskulære modstand (PVR) bør forblive relativt konstant (under forudsætning af en konstant strøm). Den ilt udveksling bør stige, når ventilatoren fungerer korrekt og udvide lungerne til at ansætte flere alveoler for gas udveksling. Figur 12A viser god ventilation og perfunderet lunger forbundet til EVLP kredsløb inde i kunstige brystkassen.
Hvilke ting ser ud, når eksperiment ikke kører godt:
Der er et par almindelige problemer, der har haft den højeste forekomst i begyndelsen faser af en EVLP eksperiment. Den første og nemmeste to afhjælpning er en lækage i ledningen kommer ud fra lungen. Dette er bemærkelsesværdigt ved en pulje af perfusat sammenlægning under en del af kredsløbet, og det i beholderen hele tiden faldende. Kontrollér og spænd eventuelle rørkoblingerne omkring spildområdet og inspicere røret selv for en lækage. Hvis denne lækage inden i lungerne, kan det også indføre bobler i lungerne. Dette bør afhjælpes så hurtigt som muligt, da luftbobler i perfusatet vil resultere i vævsskade og forårsage en væsentlig stigning i PVR. Der kan også være en lækage fra lungen eller en af kanyler. Dette kan skyldes enten glidning af en kanyle eller en obstruktion i spændende linje forårsager en trykopbygning. Undersøg positionen for begge kanyler hverken at sikre er gledet eller snoet. Bør også overvåges PA tryk under denne proces, fordi en øjeblikkelig stigning i PA tryk er en indlysende tegn på, at en forhindring af en slags for nylig har fundet sted. Figur 12Bviser en bristet lunge, der bristede grundet høje tryk. En lækage fra selve lungen kan også være forårsaget af en tåre i vævet. Dette problem kan eller ikke kan erstattes, men repositionering og efterspænding af kanyler er den bedste løsning i dette scenario.
Vigtig læring Points / muligheder:
Trial and error udvikling af det færdige vivo lunge perfusionssystem har givet os mulighed for at identificere en række centrale spørgsmål, som vi skitsere her for at lette en effektiv gennemførelse af EVLP system. Først med hensyn til indkøb, er det vigtigt, at standard bedøvende teknikker følges korrekt bedøve dyrene (nok bedøvende, injektion i bughinden) og tilslutning til alle IACUC politikker er påkrævet. Kanylerne (vist i figur 13 A, B og C), bør gentagne gange skylles for at fjerne enhver størkne og / eller snavs i den pulmonale vasculature. Med hensyn til valg af dyr, foreslår vi at bruge Sprague Dawley eller Lewis-rotter, der vejer 250-350 g. Der bør udvises særlig forsigtighed ved kanylering rotter vejer tæt på 250 g, da skibene vil være mindre og derfor langt vanskeligere at kanyle uden at skade karrene. Hvis mindre rotter eller en musemodel, der skal anvendes, kan mindre kanyle skal anvendes.
Tracheal kanylering er ikke typisk udfordrende, så længe suturen er sikret korrekt ved først at passere en silkesutur posteriort for luftrøret efter dissekere de omgivende fascia og før kanylering. Følg dette med en forreste snit 1-2 trachealringe over suturen at passere kanylen. Bind firkantede knuder i mellem trachealringe for at sikre det i en rille for bedre sikkerhed (figur 4C). Kanylering af lungepulsåren (PA) er mere udfordrende i forhold til tracheal kanyle. De følgende trin blev anvendt i denne undersøgelsefor denne procedure. Først tage fat i hjerte spids med en pincet. Pass anden tang i den tværgående sinus og tråd en sutur at fastgøre kanylen i den proksimale PA. Incise højre hjertekammer umiddelbart før den højre ventrikulære udstrømning tarmkanalen (RVOT) (figur 14A). Efter indsnit i RVOT vil kanylen styres hen imod lungepulsåren udstrømning tarmkanalen. Under suturen i position bag lungepulsåren / aorta før højre ventriculotomy øger effektiviteten (figur 5C). Kanylen skal sikres på plads med sutur for at forhindre forskydning. En alvorlig komplikation kan opstå, hvis PA kanylen ikke er i den korrekte anatomiske orientering. Kanylen kan indsættes for langt og kun perfundere en gren eller blive mal-placeret med snoning af hjerte-lunge prøve efter udtagning fra brysthulen. Dette kan let orienteres tilbage til den oprindelige position for at bevare den korrekte vinkel af anatomical position. Endelig venstre forkammer (LA) kanylering er den mest udfordrende del af proceduren. LA kanylen skal placeres i venstre atrium. Med vævene være yderst letsmuldrende, være opmærksom ikke at bruge betydelig kraft eller vridning for at forhindre en tåre i lungevenen & venstre atrium, som derefter ville gøre forsøget genanvendelige. PA kanylen er bedst placeret før LA kanylen. En venstre ventriculotomy med fjernelse af spidsen har vist sig at forstyrre cordae tendinae og tillade lettere adgang gennem mitral foldere. Også ventriculotomy gør det lettere at spile og visualisere mitralklappen og at fodre kanylen gennem mitralklappen. Dilatation af mitralklappen annulus med et par små stumpendede pick-ups kan gøres for at visualisere tarmkanalen i LA (figur 14B). Sutur skal placeres bag hjertet før kanylering. Dette kan gøres blot ved at løfte hjertet ved hjælp af et par small stumpendebehandlet pick-ups og placere suturen nedenunder og på tværs af hjertet. LA er nu klar til at være kanylerede. Feed LA kanylen gennem pick-ups med henblik på korrekt visualisere placeringen af kanylen ind i venstre atrium. Vær særlig opmærksom på ikke at fjerne kanylen tilbage i den venstre ventrikel. Suturen bør derefter stramt fastgjort langs myokardiet af den venstre ventrikel. Sikring af sutur til venstre atrium kan okkludere hele eller en del af kanylen.
Under proceduren, er det afgørende, at ingen luft forbliver i tilstrømningen del af apparatet. Enhver væsentlig luft kan producere en luftembolisme øge PVR (effektivt en "air-lock"), som vil resultere i en meget lavere perfusatet flow for et givet tryk. Forskellige punkter kan anvendes til at fjerne luft i systemet. Luft inde udstrømning sektion forventes og bør ikke have nogen skadelig virkning på lungerne. En svinemodel for pulmonal hypertension har væretvist at genskabe patologien fra kontinuerlige små mængder luft over en periode 8 uger. Den øgede luft nedsætter mængden af perfusion til stede samtidig forårsager betændelse til de omgivende væv 19.
Indledningen af perfusion kan forekomme, når kanylering er komplet, men før røret kommer fra LA er forbundet til EVLP linje. Perfusat skal køres igennem for at rydde eventuelle blodpropper og denne perfusat kan tømmes i brystvæggen uden nogen problemer. Skift perfusatet pumpe til manuel drift og langsomt øge strømningshastigheden til ~ 2 ml / min giver mulighed for nøje overvågning af PA pres. Pres på 20-30 CMH 2 O kan indikere en obstruktion og ser for perfusat forlader LA er også en indikator, men det kan være meget svært at se. Hvis trykket stiger til over 20-30 CMH 2 O, stop pumpen og igen begge kanyleringerne. Når trykket er konstant omkring 10-20 CMH 2 O tillade the perfusatet til at løbe igennem og ind i brysthulen i 2 min. På dette tidspunkt linjen fra LA kan tilsluttes til EVLP kredsløb. Perfusatet pumpehastighed kan øges til 5-10 ml / min. Som flydende hoved skrider frem gennem kredsløbet, vil der være en stigning i PA tryk på grund af stigningen i højden af væsken hoved og derfor det statiske tryk. Hvis væsken ikke kan strømme over det højeste punkt på den linje, kan det være nødvendigt enten at anvende en sugekraft på den modsatte ende af linjen eller forsøge at sænke den højeste del af linjen. Når dette spørgsmål er overvundet, bør perfusatet cirkulere uden problemer.
Et par spørgsmål bør overvåges med hensyn til ventilatoren. For det første kan vridning af bronkier / luftrøret og hjerte-lunge position forekomme som lungerne blive mere edematous og vægten øges. Det er vigtigt for kanylerne at forblive i en forholdsvis tæt anatomisk position derfor ændre eller begge kanylee kan være nødvendig. Tryk og den store kontrollerede ventilatorer samt positive eller negative ventilation kan anvendes med denne EVLP system. For rottemodellen, har vi fundet ved hjælp af positivt tryk, volumen kontrolleret ventilation fungerer godt ved respirationsmængde mellem 4-10 ml / kg og ved positive sluteksspiratorisk tryk (PEEP) mellem 2-8 CMH 2 O. En PEEP på 8 CMH 2 O kan imidlertid forårsage en mulig brud ved bifurkationen af luftrøret. Efter hvert forsøg (eller et sæt af forsøg, hvis den udføres back-to-back), ventilationen, der fører til luftrøret skal være renset for enhver bronchoalveolar lavage (BAL) væske, der kan have rejst op luftrøret. Denne væske vil hærde hvis urørt og kan helt blokere ventilationen linje.
Perfusatet sammensætning er kritisk for en vellykket EVLP eksperiment. En 5% dextran blanding tillader lunge perfusion der er tæt på fysiologiske betingelser, har en stabil onkotisk tryk til at drive væske Back i vaskulaturen at forhindre ødem og forhindrer trombose inden for de pulmonale kar. Det er vigtigt at bemærke, at nogle arter af rotter kan være allergiske over for dextran som kan forårsage lungeødem 20. Indholdet af perfusatet var generelt for alle forsøgsgrupper i denne undersøgelse, hvorfor dextran indhold bør ikke være en confounder. Den onkotisk tryk er en kritisk variabel, der har potentiale til at forbedre eller producere vævsødem. Kommercielt tilgængelige perfusionsopløsninger der er optimeret til koldt statisk opbevaring eller normotermiske perfusioner er blevet anvendt i dette system for at forøge lunge levedygtighed gange. Vi bemærker, at nogle af disse opløsninger indeholder albumin og en bekymring er muligheden for bovin albumin udløser et inflammatorisk respons i gnaver lunge. Selv optimal perfusatet sammensætning er en løbende genstand for undersøgelse, perfusatet nødt til at tage hensyn til den onkotisk tryk, det osmotiske tryk og bufferkapacitet. We anbefaler, at løsningen baseres på en modificeret Krebs-Henseleit opløsning eller celledyrkningsmedier. Den onkotiske pres bør opretholdes af dextran eller albumin, afhængigt af programmet. Den perfusion tryk og flow påvirker orgel og overnationale fysiologisk perfusion parametre kan gøre orglet udsat for mekanisk traume.
Visuelle indikatorer i eksperiment:
Der er mange visuelle signaler samt indikationer fra real-time data, der kan anvendes til at bestemme, om en EVLP eksperiment kører godt. Lungerne vil forblive den samme størrelse og vil tage gassen til samme volumen efter hver åndedrag. Der vil heller ikke være nogen lækage fra selve lungen. Den PVR, lunge vægt, og overholdelse af dem vil være forholdsvis konstant. Oxygen produktion vil være konstant eller stige svagt.
Der er mange visuelle indikatorer, når lungerne bliver kompromitteret under et eksperiment. Lungerne bliver edematous enND vokser hurtigt i størrelse og vægt. Farven på lungeforandringer (fra en tan-lyserød til hvid) og lommer af væske kan identificeres i væv. Hvis luftrøret eller lunge brud fra barotrauma eller derover distension, vil der blive boblende fra det sted, skade (figur 12B). Ilt produktionen vil falde, og PVR og overholdelse vil dramatisk øge samt.
Potentialet i at bruge en EVLP model på små dyr såsom gnavere åbner døren for fremtidige undersøgelser forbedre behandlingen af lunge transplantationer. Men den lille dyremodel kræver en bedre forståelse lige efterligne en lungetransplantation. Denne model kan anvendes i fremtiden for at forbedre medicinske behandlinger og definere baseline parametre for fremtidige lungetransplantation studier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende bistand fra Harvard Apparatus, især Stephanie Pazniokas, MS (Fysiologi Systems & regenerativ medicin) for deres bistand i kredsløb samling, ændring og fejlfinding af perfusionskredsløbet og XVIVO Perfusion (Daniel Martinelli, CCP, CTP) for at tilvejebringe ikke-klinisk anvendelse pulmonal plegia.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
Tweezer #5 Dumostar, 11cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
Vannas Scissors 8cm Str 5mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
Heparin 30,000 units per 30mL | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Ketamine 500mg per 5mL | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
Xylazine 100mg per 1mL | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-0065 | |
TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 73-1793 | |
SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 732806 | |
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731747 | |
VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731741 | |
TCM time control module type 686 | Hugo Sachs – Harvard Apparatus | 731750 | |
IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |