인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

Neuroscience

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Acabchuk, R. L., Sun, Y., Wolferz, Jr., R., Eastman, M. B., Lennington, J. B., Shook, B. A., Wu, Q., Conover, J. C. 3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse. J. Vis. Exp. (99), e52328, doi:10.3791/52328 (2015).

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Abstract

Introduction

뇌실막 세포 단층 선 뇌척수액 (CSF) 및 격자 간 유체 (ISF) 1-3 간의 양방향 장벽 및 전송 기능을 제공하는 뇌의 심실 시스템. 이러한 기능은 뇌가 독성이없는 생리적 균형 2,3에서 유지하는 데 도움이됩니다. 부상 또는 질병을 통해이 안감의 일부의 인간 손실에서 다른 상피 라이닝에서 발견 회생 교체에 결과에 표시되지 않습니다; 오히려 뇌실막 셀 커버리지의 손실은 심실 표면에서 뇌실막 세포의 무 결함 영역을 커버하는 성상 세포의 메쉬 작업과 뇌실 주위 백질 as​​trogliosis 될 것으로 보인다. 중요한 CSF / ISF 교환 및 통관 메커니즘에 심각한 영향이 상피 층 1,2,4-7의 손실이 발생할 것으로 예상된다.

인간의 노화의 일반적인 기능은 측면 심실 (뇌실) 및 observ 등 관련 뇌실 주위 부종을 확대MRI 및 유체 감쇠 반전 회복 자기 공명 영상 (MRI / FLAIR) 8-14에 의해 에드. 뇌실과 심실 라이닝의 세포 조직 사이의 관계를 조사하기 위해, 사후 인간의 자기 공명 영상 시퀀스는 측면 뇌실 뇌실 주위 조직의 조직 학적 제제와 일치했다. 뇌실 가지 경우에서, 신경교 증의 실질적인 영역은 측면 뇌실 벽을 따라 뇌실막 세포 커버리지를 교체했다. 뇌실 확장이 자기 공명 영상 기반 볼륨 분석에 의해 감지되지 않은 경우, 뇌실막 세포 안감은 그대로이고 신경교 증은 심실 라이닝 (6)에 따라 검출되지 않았다. 이 조합 방식은 부분의 wholemount 준비 또는 전체 측면 뇌실 벽과 심실 볼륨 (6)의 3D 모델링을 사용하여 측면 뇌실 내벽의 세포 무결성의 첫 번째 포괄적 인 문서 자세히 변경을 나타냅니다. 여러 질환 (알츠하이머 병, 정신 분열증)과 부상 (외상성 뇌 손상)초기 신경 병리학 적 기능으로 뇌실을 보여줍니다. 이에 뇌실막 세포 라이닝의 지역의 삭박 정상 뇌실막 세포 기능을 방해하고 CSF / ISF 유체 및 용질 교환 사이의 항상성 균형을 손상 할 것으로 예상된다. 따라서, 기본 또는 이웃 뇌 구조에 심실 시스템, 그것의 세포 구성하고, 결과에 대한 변경 사항에 대해 더욱 철저한 검사는 궁극적으로 뇌실의 확대와 관련된 신경 병리학에 대한 자세한 내용을 공개하기 시작합니다.

함께 학적 조직 샘플에 대응하는 액세스가 제한된 조영 데이터의 부족, 특히 길이 데이터 시퀀스에서, 인간의 뇌 병리 분석 어렵게 만든다. 인간의 노화 또는 질병에있는 모델링 표현형은 종종 마우스 모델을 달성 할 수있는 동물 모델은 인간의 질병 개시 및 진행에 대한 질문을 탐구하기 위해 최선의 방법 중 하나가. 의 여러 연구건강한 젊은 마우스는 좌우 심실 벽의 cytoarchitecture 및 기본 줄기 세포 틈새 4,7-15을 설명했다. 이들 연구는 -6,15- 노화 통해 좌심실 벽의 3D 모델링 및 세포 분석을 포함하도록 확장되어왔다. 마우스는 비교적 강력한 subventicular 영역 (SVZ) -6,15- 라이닝 그대로 뇌실막 세포에 세포 틈새 바로 아래 줄기 표시 오히려 뇌실 주위 백질 신경교 증이나 뇌실 어느 쪽도, 세 생쥐에서 관찰된다. 따라서, 타격 종 특이 차이 -6,15- 노화 과정에서 일반적인 관리 및 뇌실 라이닝의 무결성에 모두 존재한다. 따라서, 인간에서 발견 조건을 심문하는 것이 가장 사용 마우스로 두 종 사이의 차이가 특징으로 적절 어떤 모델링 패러다임에서 고려 될 필요가있다. 여기, 우리는 모두 인간과 M의 측면 심실에 길이 변화와 관련된 뇌실 주위 조직을 평가하는 절차를 제시여러개. 우리의 절차는 세포의 조직과 구조 모두의 특성을 3D 렌더링 및 마우스와 인간의 심실 모두의 용적 측정, 및 뇌실 주위 조직의 전체 마운트 준비의 면역 조직 화학 분석의 사용을 포함한다. 이러한 절차는 함께 심실 시스템의 변화와 연관된 뇌실 조직을 특성화하는 수단을 제공한다.

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Protocol

참고 : 동물 절차 IACUC 코네티컷 대학의 승인을 NIH의 지침을 준수 하였다. 인간의 조직 및 데이터 분석 및 절차를 준수했고, 코네티컷 IRB 대학의 승인을 NIH 가이드 라인을 준수합니다.

1. 마우스 : 뇌실의 뇌실 주위 세포 무결성 및 3D 모델링 분석

마우스 뇌실 벽 전체 마운트 1.1) 준비

  1. 면역 조직 화학 (IHC)에 대한 마우스 측면 뇌실 전체 마운트 준비는 이전에 16, 17을 설명했다.

측면 뇌실 분석을위한 1.2) 면역 조직 화학

  1. 이전 18, 19 설명 된대로 수정하고 섹션 마우스 뇌 조직.
    1. 기관은 (옅은 채색으로 표시) 삭제 될 때까지 간단히로 transcardially 정상과 같은 높이 마우스는 실온 식염수, 실온 4 % 파라 포름 알데히드 다음조직까지 0.1 M 인산염 완충 생리 식염수에 (PFA) (PBS)를 보강했다.
    2. 두개골에서 뇌를 제거합니다. 시상 봉합 따라 두개골의 기지에서 잘라 홍채 해부 가위를 사용합니다.
    3. 두개골을 노출하고 집게로 머리를 제거합니다. 밤새 4 ℃에서 4 % PFA 정착액의 뇌를 담가. 그 후 PBS로 20 분 동안 3 회 반복한다.
  2. 면역 조직 화학 및 볼륨 분석을위한 시리얼 섹션을 준비합니다.
    1. 미세 수술 메스를 사용하여, 플로팅 부분을 면역 염색시 우반구에서 좌반구의 식별을 허용하도록 세로 좌반구의 피질 따라 작은 절개를.
    2. vibratome 단면 동안 추가 구조 지원을 위해 3 % 아가로 오스의 머리를 고정 싸는. 증류수에서 따뜻한 3 % 아가로 오스는 (W / V)까지는 완전히 마이크로파 또는 핫 플레이트를 사용하여 용해시켰다.
    3. 면도날로,와 소뇌의 뇌의 꼬리 부분을 제거평평하고 심지어 표면을 떠나 관상 컷. 조직 단계에 강력 접착제를 적용하고 위로 향 후각 전구에 새로 절단 표면에 두뇌를 놓습니다.
    4. 액체 아가로 오스 용액이 닿지 그냥 따뜻한 온도로 냉각되면, 완전히 뇌 전체를 싸는 뇌에 균일하게 적용됩니다. 아가로 오스가 응고하도록 허용합니다.
    5. 아가 로스 부분은 순차 순서를 유지하기 위해 PBS를 함유하는 24- 웰 플레이트로 순차적으로 배치 된 부분과, 50 ㎛의 섹션으로 vibratome coronally 뇌에 쌌다.
      참고 : 일반적으로 12 우물이 잘 A1로 시작하는 측면 심실의 출현을보고 B6을 통해 수치 적으로 이동하고 다시 A1에 순환에 앞서 5 절을 시작하는 조직의 모음으로, 하나의 뇌에 사용됩니다. 이 같은 뇌의 여러 부분으로 구별이 동일한 웰 내에서 처리 할 수​​있다. 뇌실 부피 분석을 위해, 조직 수집이 중단 될 때를 뇌실의 잘 당 약 3 절 36 절 총의 결과로 제 3 뇌실 병합.
    6. 부동 섹션 실수로 흡입되지 않도록 20 ~ 200 μL 마이크로 피펫 팁이 부착 된 전송 피펫을 사용하여 PBS를 대기음. 블록 10 % 혈청 부유 섹션 Permeabilize 하시려면, 0.1 %, 실온에서 1 시간 동안 PBS에 트리톤 X-100 (TX) (PBS-TX). 24 웰 플레이트에없는 부동 조직 섹션을 포함하고 흔들 접시에 섹션의 모든 배양을 수행하기 위해 잘 당 용액 300 μl를 사용합니다.
    7. 차단 솔루션을 대기음, 4 ℃에서 PBS-TX 하룻밤 (최소 12 시간)에서 일차 항체와 섹션을 품어. 관상 섹션을 사용하여 뇌실 볼륨 추적의 경우, 뇌실막 세포에 라벨을 방지 S100β 항체를 사용합니다.
    8. 대기음 차 항체 용액과 함께 PBS-TX 부 10 분 동안 3 회 씻는다.
    9. 객실 템페라에서 1 시간 동안 어둠 속에서 섹션을 품어1의 농도로, 형광 이차 항체와 진짜야 : 1,000 10 % 혈청, PBS-TX를. 나머지 모든 인큐베이션 단계를 어둠 속에서 섹션을 유지합니다.
    10. 대기음 차 항체 용액과 5 분 세포 핵을 Counterstain과위한 PBS 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI, 10 μg의 / ml)로 배양 섹션. DAPI 솔루션을 기음과 PBS로 섹션을 10 분 동안 3 회 씻어.
    11. 대뇌 피질의 마크를 사용하여 슬라이드 위에 직렬 마운트 섹션은 오른쪽 반구 방향에 비해 왼쪽 유지하려면. 부드럽게 슬라이드에 장착 미디어의 얇은 층을 적용에 의해 어두운 다음 coverslip에 공기 건조 섹션 상단에 유리 커버 슬립을 배치합니다. coverslipped 슬라이드는 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다.

3D 재건 1.3) 측면 뇌실 분할

참고 : 수직 표면 형광 microsco에 매핑 소프트웨어를 사용하여 측면 심실의 추적을 수행자동 스테이지 및 형광 검출을위한 디지털 CCD 카메라로 퍼가기.

  1. 형광 현미경 장비의 전원을 켜고 형광 모드에서 매핑 소프트웨어를 실행합니다. 열기 '표시 옵션은'추적에 필요한 적절한 도구 모음 및 도킹 도구 패널을로드합니다. 옵션> 표시 옵션> 액세서리 및 '홈페이지'와 '마커'도구 모음을 선택합니다. 같은 메뉴에서 '카메라 히스토그램', '멀티 채널 제어', '카메라 설정', 이하 '이미지 인식'선택 '도킹 도구 패널을.'
  2. 측면 뇌실 라인 뇌실막 세포 레이블 강한 S-100β 형광에 기초하여 심실의 시작을 관찰한다. 측면 심실을 포함하는 조직의 첫 번째 부분을 확인합니다.
  3. 새로운 데이터 파일을 만들고 왼쪽 측면 뇌실 위의 이미지 창에서 클릭하여 단계 운동에 대한 기준점을 지정합니다. 작은을 찾습니다절개 오른쪽 반구에서 왼쪽 방향을. 시리얼 재건에 대한 윤곽을 가져올 때 도움이 파일을 추적을 통해 측면 심실에 일관된 상대적인 위치에 기준점을 유지합니다.
  4. 예를 들어, 드롭 다운 메뉴 형상으로부터 적절한 사전 윤곽 유형을 선택 '왼쪽 측면 뇌실.' 왼쪽과 오른쪽 측면 뇌실 트레이싱 각각의 고유 한 색상을 사용합니다. 윤곽 이름과 색상의 변화가 필요한 경우, '윤곽 유형을 추가'후 윤곽 색상의 이름을 수정하거나 선택한 옵션> 디스플레이 환경 설정> 윤곽로 이동합니다.
  5. '왼쪽 뇌실'윤곽이 선택으로, 추적 윤곽을 시작 뇌실막 라이닝의 혀끝의 표면을 따라 클릭합니다. 혀끝의 표면을 따라 연속적으로 클릭하여 계속하여 심실을 추적합니다.
    1. 더 기교를 요구하는 불규칙한 지역을 클릭하고 무료 손을 추적하기 위해 마우스 왼쪽 버튼을 누르고 있습니다. Ctrl 키를 누르면 + Z, 또는 이동 TO 옵션> 이전 윤곽 ​​점을 취소 취소합니다. 화살표 키를 사용하여 추적 창을 이동 또는 형상이 화면을 가리 만들고 윈도우가 자동으로 중앙에 있도록함으로써. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭을 추적 뇌실을 완료하고 '형상 닫기'를 선택합니다.
  6. 드롭 다운 메뉴를 사용하여 오른쪽 측면 뇌실을위한 새로운 윤곽 색상 (윤곽 유형)을 선택합니다. 왼쪽위한 단계 1.3.4과 우심실을 추적합니다.
  7. 윤곽 이름과 색상의 변화가 필요한 경우, 오른쪽 윤곽을 클릭하고 적절한 색상을 선택 변경 윤곽 유형을 선택합니다.
  8. 3 차원 복원을위한 일련의 윤곽을 정렬에 도움이 중간 선을 따라 마커를 추가합니다. 마커를 추가하려면 왼쪽에있는 마커 도구 모음에서 해당 마커를 ( 'X'를 사용)를 선택하고 추적 화면에 드롭합니다. 각 조직 섹션 추적의 윤곽과 함께 가져 오기 마커.
  9. > 저장을 조직 추적, [파일을 저장하려면같은 데이터 파일 및 새 폴더와 파일 이름을 만듭니다. 수의 추적 [슬라이드 #] - [조직 #] 시리얼 섹션에서 흔적을 쉽게 식별. 예를 들어, 제 2 번째 슬라이드 조직 절편 각 뇌 디렉토리 내의 파일 이름 '2-3'을 갖는다.
  10. 반복 심실 벽 부착 지역을 제외하고, 전체 뇌를 통해 심실을 추적하기 위해 뇌 조직의 각 시리얼 섹션 1.3.9에 1.3.4 단계를 반복합니다.
  11. 심실 접착 부위에 그 지느러미 및 복부에서의 밀착성, 서브 - 세그먼트의 전방 영역의 영역이있는 경우. 각각의 심실 (예를 들어, '지느러미 좌심실'과 '복부 좌심실')에 대한 두 가지 새로운 형상 유형을 만듭니다. 접착 최초의 조직 슬라이스에서 완전한 심실 재구성이 생성 될 수 있도록 원래의 측면 뇌실의 윤곽과 새로운 지느러미와 복부 윤곽 모두 측면 뇌실을 추적.
  12. 절에서는 ventricl에 후부E 벽 밀착성 각각 심실 (예를 들어, '후방 좌심실')의 후방 부에 대한 새로운 윤곽 색의 세트를 생성한다. 현재 접착 및 새로운 후방 윤곽 유형 모두이 첫 번째 재 합류 섹션을 두 번 추적.

1.4) 뇌실 3D 재건

  1. 정렬 및 3D 재구성 및 체적 데이터를 생성 할 수있는 마우스 측면 심실의 시리얼 윤곽 트레이싱을 컴파일합니다.
  2. 열기 3D 재건 프로그램. [파일]> [열기]를 클릭하고 첫 번째 추적 시리얼 부분의 윤곽 파일을 선택합니다. 왼쪽과 오른쪽 심실의 윤곽 트레이싱뿐만 아니라 추가 마커를 가져옵니다.
  3. 윤곽선을 선택하려면, '개체 선택'버튼 (커서 아이콘)을 클릭하고 'Ctrl'키를 잡고 두 심실과 마커를 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 윤곽의 Z 위치를 설정하려면 'Z 위치를 수정합니다'. 0 μm의 최초의 조직 절편을 설정합니다.
  4. <리> 재건으로, 파일> 저장 데이터 파일을 저장합니다. 실수가 이루어진 경우 복구가 다시로드 이전 파일로 쉽게 있도록, 모든 파일 가져 오기 후 저장합니다.
  5. 재건에 다음 조직 슬라이스를 추가하려면 디스플레이에 추가> 파일을 클릭합니다. 추가 할 .DAT 파일을 선택하고 '병합'상자를 선택합니다.
  6. 다시 새로 가져온 추적 파일의 Z 위치를 조정하는 단계 1.4.3을 따르십시오. 다른 흔적을 이동 피하기 위해 메인 윈도우 만 새로 추가 된 왼쪽과 오른쪽 윤곽을 선택합니다. 50 μm의 섹션에 대해 이전 형상의 Z 위치에서 50 μm의 각각의 연속적인 추적 파일을 설정합니다. (첫 번째 윤곽 : Z = 0, 두 번째 윤곽 : Z = 50, 세 번째 윤곽 : 등 Z = 100)
  7. , X, 선택 윤곽 및 마커의 Y 위치를 조정하려면 버튼을 클릭 '마우스로 번역을 사용'이전 조직의 윤곽과 정렬 윤곽을 드래그합니다. 계속 모두 현재 추적의 좌우 윤곽 선택된동기식 이동을 허용합니다.
  8. 흔적은 중간 선 마커를 줄을 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하려면, 'Z 축 회전'버튼을 선택합니다. , 마우스 오른쪽 버튼을 클릭, 수입 윤곽 및 마커 모두 선택 '설정 회전 각도'를 선택하고 'Y 회전'로 '180'를 입력 (왼쪽 윤곽이 오른쪽에있는 경우) Y 축에서 윤곽을 플립합니다.
  9. 심실과 중간 선 마커 가장 단계 1.4.4에서와 같이, 재건 파일을 저장하기 전에 정렬되어 있는지 확인하십시오.
  10. 반복 단계 이후의 각 조직 슬라이스 1.4.9에 1.4.5 모든 수입과 제대로 정렬 될 때까지.
  11. 직렬 재건의 볼륨 데이터를 보려면, 분석> '마커 및 지역 분석'을 클릭하고 '3D 윤곽 개요'를 선택합니다. 왼쪽 패널에서 모든 윤곽을 선택하고 최종 3 차원 복원을 표시합니다 '3D 시각화'버튼을 클릭합니다.

2. 인간 : 뇌실의 뇌실 주위 세포 무결성 및 3D 모델링 분석

2.1) 인간 MRI 데이터 분석

참고 : 프로토콜은 3D 이미지 복원 및 측면 심실의 체적 정량을 만들고 길이 방향 오버레이 분석을 사용하여 시간에 따른 부피 변화를 평가하기 위해 나열되어 있습니다. 이는 데이터의 포함은 20 세트에 대해 매우 중요한 기준이다 MR 데이터 수집 (예를 들어, 컴퓨터와 자석 강도, 단면 두께, 방향 및 해상도) 및 사후 - 취득 처리에 해당 일관성을 주목하는 것이 중요하다.

  1. 심실 분할
    참고 : ITK / 스냅 고해상도 T1 강조 자기 공명 영상에서 세그먼트에 심실 사용된다. 대안 적으로, 다른 Freesurfer 프리웨어 소프트웨어가 사용될 수있다.
    1. 열기 ITK / 스냅, 파일> 열기를 그레이 스케일 이미지. .nii 파일 (NITFI 파일) 원하는 파일 열기를 선택합니다.
    2. 각 아낫 스크롤omical 비행기, 지적 심실 이상 (협착 지역, 크고 작은 시간 뿔 등). 기본 도구 상자에서 '뱀 투자 수익 (ROI) 도구'를 클릭합니다. '세그먼트 3D'를 클릭하십시오. '강도 지역'옵션을 선택합니다.
    3. '사전 프로세스 이미지'를 클릭하십시오. 흰색에 투자 수익 (ROI)을 강조하기 위해 특정 강도 임계 값 아래 영역을 포함하는, '위'를 선택합니다. 슬라이드 막대를 사용하여 최대 강도를 기록합니다. 최대 강도 (기록이 값)의 15 % 임계 값을 설정합니다. '확인'을 10 클릭 한 다음 '다음'에 부드러움 매개 변수를 설정합니다.
    4. 각각의 심실에 10-12 작은 (크기 2) '거품'을 추가 : 두 전방 정면 경적에, 일곱 측면 뇌실 본체, 후두 뿔에 하나의 시간 뿔 하나의 우수한 표면을 따라 균등하게 간격 측면 뇌실. 및 설정 곡률 힘 0.4 '매개 변수 선택'을. 활성 윤곽 진화를 시작하려면 재생 기호를 클릭.
    5. 표면을 시각화 '업데이트 메쉬'를 클릭; '자동 업데이트'를 선택합니다. 측면 뇌실의 모든 분야가 관심 (ROI)의 영역에 포함되는 경우 분할을 중지합니다. 제 3 뇌실의 포함을 피하십시오. '마침'을 클릭합니다.
    6. 다음과 같은 방법으로 원하지 않는 영역을 제거하기 위해 필요한 경우 수동으로 이미지를 편집 (일반적으로 제 3 뇌실의 누설을 삭제해야합니다). 수동으로 여분의 영역을 제거하거나 수동으로 투자 수익 (ROI)을 넘어 모든 포함을 삭제 활성 도면의 레이블로 '클리어 라벨'와 '그림판'도구를 사용하는 '3D 메스'도구를 사용합니다.
    7. .nii 이미지로 분할 결과 ( 'NIFTI'파일 형식)을 저장합니다.
    8. 총 뇌실 볼륨을 얻으려면, '분할> 볼륨'및 통계를 선택; 색상 설정 라벨을 이용하여 심실의 총량을 얻었다.
  2. MRIScans에서 측면 심실의 종 대표
    참고 : 사용망고 소프트웨어는, 길이 방향의 ROI는 질적 및 양적으로 시간이 지남에 따라 과목 내에서 뇌실 용적의 변화를 보여 중첩된다.
    1. 열기 망고. 녹색으로 최초의 투자 수익 (ROI) 시점 (기준)의 파일>로드 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다. 파일> RED로 두 번째 투자 수익 (ROI) 시점의 부하 투자 수익 (ROI). 파일을 선택하여 종 오버레이를 저장>으로 저장; '- [두 번째 포인트 시대] .nii 파일 name_ [처음으로 포인트 시대]'등 각각의 이미지를 지정합니다.
    2. ITK-SNAP를 엽니 다. 이미지> 결합 된 투자 수익 (ROI) 파일의 분할>로드를 선택하여, '그레이 스케일 이미지'와 함께 투자 수익 (ROI)을 다시 엽니 다. 세로 볼륨 데이터는 다음과 같은 실행 얻으려면 : 분할> 볼륨 및 통계> 레이블 1 (빨간색은) 확장 볼륨을 =; 라벨 2 (녹색) 협착증 = 부피; 라벨 3 (파란색) = 기본 볼륨.

2.2) 인간의 뇌실 주위 조직 준비 및 분석

  1. 인체 조직 작업에 대한 안전 지침
    1. approp를 구합니다riate 안전 교육 (예., 혈액 매개 병원균 과정).
    2. 표준 (보편적 인) 안전주의 사항을 준수하십시오. 장갑을 착용 할 것. 일회용되지 않은 공통 장비 또는 표면을 만지기 전에 장갑을 변경합니다. '인체 조직 사용'명칭과 인체 조직과 작업 할 때 일상적으로 취급 된 항목을 레이블.
    3. 인체 조직과 접촉하는 모든 항목에 대한 오염 제거 방법을 따르십시오. 사전 처분에 24 시간의 최소 오염 된 액체 표백제 표백제 적신 수건 (예를 들어, 벤치 위) 또는 (예 : 집게) 표백제에 직접 객체를 배치하여 오염 된 표면을 처리합니다.
    4. 표백제에 종이 타월을 몸을 담글과 영향을받는 지역 (5 ~ 10 분)에 들고 포함 할 수있다 직접 피부에 인체 조직과 접촉하기위한 비상 계획을 준비합니다.
    5. 인체 조직과 접촉하는 모든 항목에 대한 적절한 폐기를 사​​용합니다.
  2. 뇌실 전체 마운트 준비
    1. (B)그대로 반구와 eginning 큰 칼을 사용하여 전체 반구를 통해 1.5 cm 두께의 관상 부분을 슬라이스 (10 % 포르말린에 고정 0.1 M PBS로 철저하게 세척).
      참고 : 모든 고정 프로토콜 전에 항체 확인이 필요합니다.
    2. 라벨 섹션은 전면 측면 뇌실을 포함하는 첫 번째 섹션으로 시작하는 백업한다. 번호 (위에서 아래로)와 문자 (전방 후부하는) 및 항을 조각 라벨, 알파 숫자 라벨링 시스템을 사용합니다. 뇌실막 표면을 방해하지 마십시오.
    3. 미세 수술 메스를 사용하여, 전체 측벽에 대한 하나의 연속 섹션을 유지, 1cm 깊이 심실 벽을 해부하다. 잘 염색에 대한 적절한 크기의 섹션을 만들 필요에 따라 벽을 분할합니다. 심실 벽의 반대측에 절 결부 우수 / 열등 방향의 동정을 행 하였다.
    4. 이중 주입기를 사용하여 10 내지 20 분 동안 100 ° C에서 10 mM 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 조직 절편을 배양하여 항원 검색을 수행R (최적의 배양 시간은 경험적으로 결정된다). PBS / 0.1 % 트리톤 X-100 (TX-PBS)로 3 회 헹군다.
    5. 실온에서 1 시간 동안 PBS / PBS-TX를 사용하여 10 %의 말 혈청 블록.
    6. 4 ℃에서 48 시간 동안 일차 항체에 품어. 다음 항체 조합 전체 마운트 발현 사이, 심실 벽의 안감을 시각화 : 마우스 항 - β-catenin의 (1 : 250); 염소 항 GFAP (1 : 250); 토끼 항 AQP4 (1 : 400).
    7. 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다. 이차 항체 (1 : 500)와 함께 배양, 조직을 PBS에서 3 회 헹구 4 ° C에서 24 시간 또는 실온에서 2 시간 동안, 및 다른 PBS로 3 회 헹군다. 실온에서 7 분 동안 DAPI에서 조직을 품어은 PBS의 다른 3 린스로 하였다.
    8. 파라 필름과 왁스 바닥 접시를 덮어 최종 해부를위한 조직을 준비합니다. 미세 집게를 사용하여 접시에 조직을 배치 뇌실막 벽과의 접촉을 피하고, PBS로 접시를 채우십시오.
    9. 해부 현미경, 단단히에서 Secu옆으로 사용하여 핀에 조직 재. 22.5 ° 미세 수술 자상 칼, 측면 뇌실 벽 (약 300 μm의 두께) 균일 한 얇은 섹션을 만들 수 있습니다. 큰 부분이나 어려운 곡률이 섹션의 경우, 설치 및 노트 위치에 대한 최종 부분으로 절단하기 전에 작은 조각으로 잘라.
    10. 조심스럽게, 미세 집게를 사용하여 슬라이드에 지역의 위치와 방향의 메모를 복용 슬라이드에 해부 섹션 ependyma 측 놓습니다. 거품을 피하기 위해주의하면서 aquapolymount의 얇은 층으로 조직을 커버. 조직을 통해 coverslip에 배치 coverslip에 아래에있는 모든 차이를 보충하기 위해 필요에 따라 추가 aquapolymount를 추가합니다.
    11. 실온에서 2-3 일 동안은 어둡고 건조에 장착 된 섹션을 배치합니다. 4 ° C에서 slidebox에 보관할 것.
  3. 면역 조직 학적 분석
    1. O 사용에 의해 결정되는 면역 형광을 볼 공 초점 현미경을 사용하여, 심실 표면에서 촬상 초점 평면을 설정할F의 β-catenin의 (뇌실막 세포의 꼭대기 adherens 접합 단백질 마커). 뇌실막 셀 커버리지 및 표면 astrogliosis (심실 표면에서 GFAP 염색)의 영역을 묘사.
    2. 전체 심실 표면 문서와 몽타주, 전체 표면을 커버하는 중첩 된 이미지를 사용합니다. 직렬 이미지의 몽타주를 만들려면, 어도비 포토샵을 엽니 다. , 오버레이 할 이미지를 선택하는 파일> 자동화> 진 Photomerge> 대화 형 레이아웃을 사용하여 필요한 경우 수동 조정을.
    3. 그대로 ependyma의 셀 커버리지 또는 심실 표면 신경교 증의 만화 표현을 생성하는 몽타주를 추적하기 위해 새 레이어를 만듭니다. 각 슬라이드 또는 투자 수익 (ROI)에 대해 반복합니다. 자기 공명 영상 재구성에 지역 대응하는 심실 벽과 링크의지도를 재구성하는 모든 섹션을 컴파일합니다.

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Representative Results

면역 염색 50 μm의 관상 섹션과 3D 재구성 (그림 3)에 따라 마우스 측면 심실의 윤곽 추적은 볼륨 데이터가 질병이나 부상에 대한 모델 시스템으로 마우스를 사용하여 다른 실험 패러다임에서 수집 할 수 있습니다. 이 절차에 긴급 뇌실 벽이 서로 접착 영역을 배제한다. 심실의 영역 subsegmenting 각 영역 (도 3C)에 대해 다른 색을 지정함으로써, 인접한 절편을 준수 할 수 있고, 지역 및 총 부피는 컴파일 서브 세그먼트로부터 계산 될 수있다.

비슷한 연구는 3D 렌더링에 대한 측뇌실 반자동 세그멘테이션 (ITK-SNAP)와 함께 뇌 MRI 스캔을 사용하여 수행 될 수있다. 뇌실 볼륨의 직접 페어링과 뇌실 주위 조직 분석, 사전 또는 사후의 경우 자기 공명 영상 검사는 분할 및 (3D 복원을 만들 정렬 (그림 5)에 대한 중첩 될 수 있습니다. 세로 분석은 미래의 면역 조직 화학 분석을위한 특별한 관심 지역에 대한 정보를 제공합니다. 대응 조직은 심실 표면 (그림 6A)에 그대로 뇌실막 세포 단층 대 astrogliosis의 영역을 나타 내기 위해 면역 조직 화학적 분석된다. 조직의 이미지를 캡처 한 후 심실 표면 (그림 6B)의 넓은 지역을 커버 montaged있다. 컴파일 된 몽타주는 만화 표현으로 변환 한 후 뇌실 주위 세포 무결성 (그림 6C)에서 지역의 변화를 보여주기 위해 자기 공명 영상 기반의 2D 모델에 매핑됩니다. 심실 벽의 전체 마운트 준비는 심실 표면의 큰 넓은 구역의 탁 트인 전망을 허용, 또는 우리는 전체 측면 심실 표면 6 증명으로. 증가 L부종을 암시 표면 신경교 증의 영역에서 아쿠아 포린 -4- 발현 evels은 심실 라이닝 (6)의 무결성을 평가할 수있다.

그림 1
그림 1 : ITK / 스냅 뱀 투자 수익 (ROI) 도구 ()를 사용하여 측면 뇌실 분할 공연은 '거품'는 측면 심실에 추가됩니다. (B) '거품'활성 윤곽 진화하는 동안 확장합니다. 전체 측면 뇌실가 작성 될 때 (C) 분할이 완료됩니다. (케어는 제 3 뇌실 않도록주의한다.)

그림 2
그림 2 : 인간의 측면 뇌실 벽 해부 ( (D)에 도시되어있다. (E) 심실 벽의 부분은 밖으로 해부와 IHC에 대한 처리됩니다. 조직 세분 크기와 곡률에 따라 요구 될 수있다. 배향을 유지하기 위해, 조직은 심실 표면의 반대측 (녹색)의 상단에서 노치된다. 핀 (검은 점) 조직을 확보하고 최종 해부을 안내하는 데 사용됩니다 (붉은 점선). 최종 전체 마운트 제제는 심실 표면 (녹색)을 위로 향하게하여 슬라이드에 장착된다.

그림 3
그림 3 : 추적 및 S100β 면역 뇌실막 세포에 의해 설명 된 마우스 측면 심실 (측면 심실 포함 코로나 마우스 뇌 섹션의 3 차원 복원 (*, 측면 심실, 브래킷, adhE 유전자의 지역. 시온; 스케일 바, 500 μm의). (B)는 마우스 측뇌실 체적 분석을 방해 뇌실 접착 영역을 제외한 '등고선'로 추적 및 하위 섹션으로 분할 배치되어있다. 측면 뇌실 윤곽의 (C) 3D 재구성. 측뇌실 함유 관심 영역에 걸친 전체 뇌 용적의 황색, 컨투어.

그림 4
그림 4 : 자기 공명 영상 기반 측면 뇌실 분할 (A) 자기 공명 영상이 조립된다. (B) 뇌실는 ROI (적색)으로서 정의된다. (C) 3 차원 영상 재구성은 체적 정량 및 측면 뇌실의 질적 시각화 할 수 있습니다.

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그림 5 : 종 뇌실 확장 세로 자기 공명 영상의 평가 여러 지점에서 정렬 및 시각화하고 시간이 지남에 따라 과목 내에서 뇌실의 부피 팽창을 정량화하는 오버레이 할 수 있습니다.

그림 6
그림 6 : 면역 조직 화학적 평가와 β-catenin의 염색으로 설명 인간의 측면 뇌실면 (A) 그대로 ependyma 세포 분야의 지역 매핑, 조약돌 모양 (별표)를 표시하고 심실 표면에 astrogliosis 지역에서 점선으로 경계가된다 (GFAP + 염색). (B)의 직렬 공 초점 이미지는 지역의 몽타주를 생성하는 중첩과 심실 표면에서 세포 조직의 만화 표현 어도비 포토샵을 사용하여 추적됩니다. 의 (C) 만화이미지 몽타주는 자기 공명 영상 기반 3 차원 심실 재구성 대응에 심실 표면에 매핑됩니다. (스케일 바 (A), 40 μm의, 스케일 바 (B), 1mm)

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Discussion

우리는 도구와 쥐 및 인간에서 뇌의 심실 시스템의 무결성을 평가할 수있다 프로토콜을 제시한다. 이러한 도구는, 그러나, 또한, 14,21,22 또는 노화 과정에서 손상, 질환으로 인한 변화를 겪는 다른 뇌 구조 또는 기관 시스템에 적용될 수있다. 전략의 단면과 길이 MRI 시퀀스들의 정렬이 특정 영역 또는 관심있는 구조의 3 차원 볼륨 표현을 생성 할 수있는 소프트웨어의 인출 이점을 제시 하였다. 종 MRI 시퀀스 수 시간에 걸쳐 발생하는 총 뇌 체적비로 뇌실 총 뇌 부피, 및 / 또는 기타 뇌 구조 (예 subthalamic 핵 23 또는 뇌량 백색질을 포함하도록 확장 될 수있는 3 차원 볼륨 변경 컴파일 ) 확산 가중 텐서 영상을 사용하여. 함께, 뇌의 구조적인 변화의 포괄적 인 분석이 수행 될 수있다. 궁극적으로,조영 기술 컬렉션 뇌 구조 노화 관련 질병 - 관련 변화를 평가하기 위해 뇌의 건강 상태 (24)의 가장 정확한 그림을 제공하기 위해 필요하다. 함께 주제 주제 변동과 과목에 걸쳐 변화의 범위와 문서 및 중요한 구조적 데이터의 편집은, 이상적으로 건강 또는 질병에있는 조직의 최고 가이드 임상 진단에 초고 필드 MRI를지도 책을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

몇 가지 중요한 단계 사이와 대상 데이터 세트에서 수집 및 처리 변동성을 감소하기 위해주의하는 것이 중요하다. 이상적으로 유사한 데이터 시퀀스를 획득하기 위해, 동일한 MRI 스캐너와 서열 유형 연구 전반에 걸쳐 사용한다. 사후 뇌 조직은 종종 다양한 품질이고; 이러한 정착액에서 사망 원인, 사후 간격, 관류의 품질 및 시간의 길이가 중요한 요소 모두 염색 효능의 필요성에 영향을 미칠 수있다항원 검색 프로토콜. 또한, 인간의 뇌의 크기는 관심 영역을 포함하는 조직을 얻기 위해 추가 조작을 필요로하는 각각의 슬라이스를 다중 슬라이스 단면을 필요로한다. 따라서, 각 구역의 위치 및 방향이 명확하게 표시되어 기록하는 것이 중요하다. 궁극적으로, 사후 조직 분석 주요 문제는 정확하게 그 - 그것은 사후 - 그리고 따라서 수명이 조직의 스냅 뷰를 제공한다. 향상된 조영 기술들은 뇌 세포의 구조 및 해상도 모토 - 작용 정보에 대한 변경의 실시간 분석을 위해 요구된다.

마우스 연구는 변수에 의해 인간의 조건 변수의 심문을 허용하고 인체 조직 작업을 할 때 발견 된 문제의 많은 존재하지 않습니다. 인과 구조 역학의 분석을 통해 인간의 질병이나 상해를 모델링하는데 사용 마우스 연구는 질병 모델 발을위한 향상된 기능을 제공 할 수 있습니다전문화는. 그러나, 종 특이 차이에 유의해야한다. 측뇌실의 분석에서, 마우스로, 측뇌실의 측벽을 따라 활성 줄기 세포 틈새를 유지하고 라이닝 적당한 뇌실막 세포 손실의 경우에 발생하는 심실의 세포 매개 회생 수리 줄기 것을 주목하는 것이 중요하다 세 쥐에서 발견 또는 제한 뇌실막 세포 삭박이 ependyma의 노출을 통해 발생했을 때 19 뉴 라미니다 아제 할 수 있습니다. 어떤, 회생 가능성이있는 경우 반면에, 인간은, 측면 뇌실 벽 25-27 작은 함께 강력한 줄기 세포 틈새를 유지하지 않습니다. 세 마우스와 대조적으로, 세 인간 심실 확장 (6)와 관련된 심실 표면에서 광범위한 astrogliosis를 나타낸다. 발가 벗김과 심실 라이닝의 '상처'의이 레벨은 뇌실막 세포 6,28의 뇌실 안감을 발가 벗기다하는 뉴 라미니다 아제를 사용하여 마우스를 모델링 할 수 있습니다. 또한, 차를 인식하는 것이 중요하다동식물 사육장 - 유지 마우스에서 가장 인체에서 많은 다른 병력을 제시, 감염, 질병이나 외상 발생하지 않습니다. 또한, 마우스는 일반적으로 연령 관련 퇴행성 신경 질환, 뇌실 또는 뇌실 주위 백질 신경교 증을 표시하지 않습니다. 따라서, 그들은 모델링 할 필요가 이러한 표현형을 관찰합니다. 결국, 어떤 동물 모델은 완전히 개체 발생, 병태 생리, 인간 질병의 증상 복잡성을 요점을 되풀이 할 수 없으며 이러한 한계는 인정하고 적절하게 전달 될 필요가있다.

요약하면, 우리는 기술과 프로토콜이 마우스와 인간의 측면 뇌실 볼륨을 평가하기 위해 제시한다. 심실 3D로 렌더링 할 수 및 종 분석은 시공간 볼륨 변경의 편집을 할 수 있습니다. 또한, 한 쌍의 뇌 조직을 이용하여 우리는 심실 부피 변화에 링크 될 수있는 방법을 보여주는 세포 기능. 최근 결과 periventricu의 분야에서 아쿠아 포린-4 발현의 수준을 증가 시연LAR의 신경교 증은 심실 표면을 따라 부종을 제안한다. 조직의 조직 학적으로 FLAIR-MRI 페어링 따라서 미래 연구는 CSF 및 간질 액 교환에 대한 우리의 이해를 향상시키고, 심실 시스템 상태 및 방법의 열화가 다양한 뇌 기능에 영향을 미치는에 대한 중요한 정보를 제공 할 것입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 21600-069
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 19210 Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum Life Technologies 16050 10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum Life Technologies 16210 10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX) Sigma-Aldrich T8787 0.1% in PBS (v/v)
Vibratome Leica VT1000S
Fluorescence Microscope Zeiss Imager.M2
Camera Hamamatsu ORCA R2
Microscope Stage Controller Ludl Electronic Products MAC 6000
Stereology software MBF Bioscience Stereo Investigator 11
Stereology software ImageJ/NIH NIH freeware
3D Reconstruction software MBF Bioscience Neurolucida Explorer
Confocal Microscope Leica TCS SP2
MRI Software
Freesurfer https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall Segmentation and Volume
ITK-Snap http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango) http://ric.uthscsa.edu/mango/ Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife Fisher Scientific NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish 
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope Leica MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin BD Bioschiences, San Jose, CA, USA 1:250
goat anti-GFAP Santa Cruz Biotechnology 1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)  Sigma-Aldrich 1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody Sigma-Aldrich 1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Life Technologies D-1306 10 µg/ml in PBS

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References

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