3D-моделирование боковых желудочков и гистологического Характеристика Перивентрикулярные тканях человека и мыши

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Acabchuk, R. L., Sun, Y., Wolferz, Jr., R., Eastman, M. B., Lennington, J. B., Shook, B. A., Wu, Q., Conover, J. C. 3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse. J. Vis. Exp. (99), e52328, doi:10.3791/52328 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

An эпендимные клеточный монослой линии желудочковой системы головного мозга, обеспечивающей двунаправленную барьерные и транспортные функции между спинномозговой жидкости (ликвора) и интерстициальной жидкости (ISF) 1-3. Эти функции помогают держать мозг ядовито-бесплатно и в физиологического равновесия 2,3. У людей потери частей этой подкладке из-за травмы или болезни видимому, не приводит к регенеративной замены, как и в других эпителиальных накладок; а появляется потеря эпендимных охвата клетки приведет к перивентрикулярного астроглиоза с сетчатой ​​астроцитов, охватывающих регионы лишена эпендимных клеток на поверхности желудочка. Серьезные последствия для важных CSF / обмена ИСБ и оформления механизмов можно было бы предсказать результат от потери этого эпителиального слоя 1,2,4-7.

Общей чертой человеческого старения увеличивается боковые желудочки (вентрикуломегалия) и связанный перивентрикулярная отек качестве наблюдателей,ред МРТ и жидкости-ослабленный восстановления инверсии MRI (МРТ / FLAIR) 8-14. Чтобы исследовать отношения между вентрикуломегалии и клеточной организации желудочка подкладке, посмертные последовательности человека МРТ были согласованы с гистологических препаратов бокового желудочка перивентрикулярного ткани. В случаях вентрикуломегалии существенные области глиозом заменил эпендимных покрытие клеток вдоль боковой стенки желудочка. Когда расширение желудочка не был обнаружен МРТ основе анализа объема, эпендимных клеток подкладка была цела и глиоз не был обнаружен по желудочка накладки 6. Это комбинаторный подход представляет первые комплексные документации подробно изменения в клеточной целостности бокового желудочка с помощью облицовки Wholemount препараты порциями или весь боковой стенки желудочка и 3D моделирование объемов желудочков 6. Некоторые заболевания (болезнь Альцгеймера, шизофрения) и травмы (черепно-мозговая травма)показать вентрикуломегалия как ранней нейропатологического функции. Денудации областей эпендимных клеток выстилки тем самым можно было бы предсказать мешать нормальной функции клеток эпендимных и компромисс гомеостатического баланса между CSF / ISF жидкости и растворенного обмена. Таким образом, более тщательное изучение изменений в желудочковой системе, ее клеточного состава, и следствие до основных или соседних структур головного мозга, в конечном счете начинают раскрывать больше о невропатологии, связанной с расширением желудочка.

Отсутствие мультимодальных данных изображений, и, в частности продольных последовательностей данных, вместе с ограниченным доступом к соответствующей образцы тканей гистологические делает анализ патологий головного мозга человека трудно. Моделирование фенотипы найдены в старения человека или заболевания часто может быть достигнуто с мышиных моделях и моделях животных стать одним из наших лучших средств для изучения вопросов о возбуждении заболеваний человека и прогрессии. Несколько исследований вздоровых молодых мышей описали цитоархитектуры из боковых стенок желудочка и нишу, лежащий в основе стволовых клеток 4,7-15. Эти исследования были расширены, чтобы включить 3D-моделирования и анализа сотовой стенок желудочков через 6,15 старения. Ни перивентрикулярная глиоз ни вентрикуломегалия наблюдаются у мышей в возрасте, а мыши обнаруживают относительно надежный subventicular зона (СВЗ) стволовых клеток нижележащих нишу на неповрежденной эпендимных клетки подкладка 6,15. Таким образом, бастующие видоспецифичны различия существуют как в общем обслуживание и целостности облицовки боковой желудочек в процессе старения 6,15. Поэтому, лучше всего использовать мышей, чтобы допросить условия, найденные в людях, различия между этими двумя видами необходимо охарактеризовать и соответствующим образом учитываться в любом моделирования парадигмы. Здесь мы представляем процедуры оценки продольные изменения в боковых желудочков и связанное перивентрикулярная ткани в обеих людях и мУз. Наши процедуры включают 3D-рендеринга и Волюметри обоих мыши и человека желудочков, и использование иммуногистохимического анализа вся гора препаратов перивентрикулярного ткани, чтобы охарактеризовать как сотовый организацию и структуру. Вместе эти процедуры обеспечивают средства для характеристики изменений в желудочковой системе и связанный перивентрикулярная ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были одобрены Университета Коннектикута IACUC и соответствует руководящим принципам NIH. Человек ткани и анализ данных и процедуры были в соответствии с утвержденной и Университета Коннектикута IRB и соответствует руководящим принципам NIH.

1. Мышь: Анализ Перивентрикулярные клеточную целостность и 3D моделирования бокового желудочка

1.1) Подготовка мыши бокового желудочка Стеновые тотальных

  1. Подготовьте мышь боковой желудочек тотальных для иммуногистохимии (IHC), как описано ранее 16,17.

1.2) Иммуногистохимия для боковой анализа желудочка

  1. Fix и раздел мозга мыши ткани, как описано ранее 18,19.
    1. Вкратце, мышей флеш транскардиальную с нормальным, при комнатной температуре раствор, до тех пор, пока органы очистили (обозначено бледно окраски), а затем при комнатной температуре 4% параформальдегида(PFA) в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе (PBS) до ткани застыл.
    2. Удалить мозг из черепа. Используйте ножницы радужной оболочки глаза рассечение вырезать из основания черепа вдоль стреловидного шва.
    3. Expose черепа и удаления мозг щипцами. Погружают мозг в 4% PFA фиксатором течение ночи при 4 ° С. Затем промыть 3 раза в течение 20 мин с PBS.
  2. Подготовка серийных срезов для иммуногистохимического анализа и громкости.
    1. Использование микрохирургической скальпель, сделайте небольшой надрез в продольном направлении вдоль коры левого полушария, чтобы позволить идентификацию левого полушария от правого полушария, когда плавающие разделы иммуноокрашиванию.
    2. Накрыть фиксированной мозги в 3% агарозном для дополнительной структурной поддержки во время vibratome срезов. Теплый 3% агарозном в дистиллированной воде (вес / объем) до полного растворения с использованием либо микроволновую печь или горячую плиту.
    3. С бритвой, удалить хвостовой участок мозга в мозжечок скорональной вырезать, оставляя ровную и ровную поверхность. Применить супер клей на стадии ткани и поместите мозг на вновь сократить поверхность обонятельных луковиц, стоящих перед вверх.
    4. При жидкости раствор агарозы остынет до температуры чуть теплой на ощупь, применяются равномерно по мозгу, чтобы полностью накрыть весь мозг. Разрешить агарозном закрепить.
    5. Раздел агарозном заключен мозги коронки на vibratome в 50 мкм секций, с участков, расположенных последовательно в 24-луночный планшет, содержащий PBS, чтобы сохранить последовательном порядке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вообще 12 скважин используются для одного мозга, с коллекцией тканей, начиная 5 разделов до наблюдаем появление боковых желудочков, начиная с ячейки А1, двигаясь численно до B6 и езда на велосипеде А1. Это позволяет нескольким различимы разделы из того же мозга, который будет обработан в течение той же скважине. Для бокового желудочка анализа объема, сбор ткани прекратилось, когда боковой желудочекс и третий желудочек слияние, в результате чего примерно на 3 секции в скважине или 36 Всего форумов.
    6. Аспирируйте PBS использованием передачи пипетки, прикрепленную с микропипетки наконечник в 20-200 мкл, чтобы убедиться, что плавающие разделы не случайно атмосферный. Блок и проницаемыми плавающей секции в 10% сыворотки, 0,1% Тритон Х-100 (ТХ) в PBS (PBS-TX) в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте 300 мкл раствора на лунку, чтобы покрыть разделы свободно плавающих ткани в 24-луночного планшета и выполнять все инкубации разделов на качающейся пластины.
    7. Аспирируйте блокирующий раствор и инкубировать секций с первичными антителами в PBS-TX в течение ночи (по крайней мере, 12 ч) при температуре 4 ° С. Для желудочка объемом следов с использованием корональные разделы, используйте анти-антитела S100β маркировать эпендимных клетки.
    8. Аспирируйте решение первичного антитела и промыть разделах 3 раза в течение 10 мин каждый с PBS-TX.
    9. Выдержите разделы в темноте в течение 1 часа при комнатной темпераТуре с люминесцентными вторичными антителами в концентрации 1: 1000 в 10% сыворотки, PBS-TX. Держите секций в темно для всех остальных этапов инкубации.
    10. Аспирируйте раствор вторичного антитела и инкубировать секций с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола в PBS (DAPI, 10 мкг / мл) в течение 5 мин, чтобы контрастное клеточные ядра. Аспирируйте решение DAPI и промыть разделах 3 раза в течение 10 мин каждый с PBS.
    11. Mount разделы серийно на слайды с помощью корковой знак, чтобы сохранить оставили против правого полушария ориентации. Воздух сухой секции в темноте, а затем покровное путем применения тонким слоем монтажных СМИ к слайду и аккуратно поместить стекло покровное на вершине. Разрешить coverslipped скользит высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.

1.3) бокового желудочка Сегментация для 3D реконструкций

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните трассировку боковых желудочков с помощью программного обеспечения отображения на вертикальном эпифлуоресцентной microscoПЭ с автоматизированной стадии и цифровой камерой CCD для регистрации флуоресценции.

  1. Включите микроскопа оборудования флуоресценции и запуска программного обеспечения отображения в режиме флуоресценции. Откройте "Показать параметры", чтобы загрузить соответствующие панели инструментов и панели док-инструмента, необходимых для отслеживания. Функции> Показать параметры> Аксессуары и выберите 'Main' и панели инструментов "Маркер". В этом же меню, выберите 'Camera гистограмма', 'Многоканальный управления »,« Настройки камеры »и« Приобретение изображения в разделе' Панели инструментов Док.
  2. Соблюдайте начало желудочков, основанных на сильном S-100β флуоресценции, которая маркирует эпендимных клетки, которые выстилают боковой желудочек. Определить первый кусок ткани, содержащий боковые желудочки.
  3. Создайте новый файл данных и назначить опорную точку для сценического движения, нажав в окне изображения выше левого бокового желудочка. Посмотрите на небольшойРазрез ориентироваться слева от правого полушария. Держите опорную точку в последовательной месте по отношению к боковых желудочков через отслеживание файлов, чтобы помочь при импорте контуров для последовательного восстановления.
  4. Выберите подходящий тип контура предварительно от контура выпадающего меню, например, "левого бокового желудочка. Используйте уникальный цвет для каждого из левого и правого боковых желудочков кальки. Если изменения в названия контура и цвета требуется, перейдите к Функции> Настройки> Показать контуры, а затем изменить имена контурных цветов или выбрать "Добавить контура Тип".
  5. С контура в "левого бокового желудочка 'выбран, нажмите по апикальной поверхности футеровки эпендимных начать контур трассировки. Проследите желудочек, продолжая последовательно нажмите по апикальной поверхности.
    1. Для нерегулярных областях, требующих больше изящества, нажмите и удерживайте левую кнопку мыши для того, чтобы проследить свободной рукой. Нажмите Ctrl + Z, или пойти тО Опции> Undo, чтобы отменить предыдущую точку контура. Перемещение кальку окно, используя клавиши со стрелками или путем точки контура от экрана и позволяет окно автоматически центрироваться. Чтобы закончить желудочек трассировки правой кнопкой мыши и выберите "Закрыть" Контур.
  6. Выберите новый цвет контура (тип контура) для правого бокового желудочка с помощью выпадающего меню. Проследите правый желудочек, как в шаге 1.3.4 для левого.
  7. Если изменения в названия контура и цвета требуется, щелкните правой кнопкой мыши на контуре и выберите Изменить контура Тип, чтобы выбрать подходящий цвет.
  8. Добавить маркеры вдоль средней линии, чтобы помочь в выравнивании серийные контуры для 3D реконструкции. Чтобы добавить маркеры, выберите соответствующий маркер (используйте 'X') на панели инструментов Маркеры слева и нажать на кнопку еще их на экране трассировки. Импорт маркеры вместе с контурами для каждого раздела тканей следа.
  9. Чтобы сохранить ткани следы, выберите Файл> СохранитьФайл данных Как и создать новую папку и имя файла. Количество обводка [слайд #] - [#] ткани для легкой идентификации следов от серийных срезов. Например, секция с третьими ткани на втором слайде имеет имя файла "2-3" в пределах каталога для каждого мозга.
  10. Повторите шаги 1.3.4 1.3.9 для каждого последовательного части мозговой ткани, чтобы проследить желудочки через весь мозг, за исключением регионов желудочка стены адгезии.
  11. Если желудочек имеет область адгезии, суб-сегмента передней области от тех спинной и брюшной к адгезии сайта. Создать два новых типа контура для каждого желудочка (например, «Спинной левого желудочка" и "Брюшной левого желудочка"). На первом тканей срез с адгезией, проследить боковой желудочек и с оригинальной боковой желудочек контура и новой спинных и брюшных контуров для обеспечения полной реконструкции желудочка может быть создан.
  12. В разделах позади в ventriclстены адгезии е, создать множество новых цветов контурных для задней части каждого желудочка (например, «Задний левый желудочек"). Дважды проследить этот первый воссоединился раздел как с текущей адгезии и новых видов задняя контура.

1.4) бокового желудочка 3D реконструкция

  1. Выравнивание и составить последовательный контур прорисовки мыши боковых желудочков генерировать 3D реконструкций и объемные данные.
  2. Открыть 3D программа реконструкции. Нажмите Файл> Открыть и выберите файл контурную первый серийный прослеживается разделе. Импорт горизонталей прорисовки левой и правого желудочка, а также любые дополнительные маркеры.
  3. Чтобы выбрать контуры, нажмите кнопку "Выбрать объекты" (значок курсора) и выберите два желудочка и маркеры, удерживая клавишу "Ctrl". Чтобы установить Z позицию контуров, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Изменить Z позиции. Установите первый кусочек ткани в 0 мкм.
  4. <LI> Чтобы сохранить реконструкцию, выберите Файл> Сохранить файл данных как. Сохранить после каждого импорта файлов, так что если допущена ошибка восстановления, как легко, как перегрузка предыдущий файл.
  5. Чтобы добавить следующий ткани ломтик реконструкции, нажмите Файл> Добавить к изображению. Выберите файл .DAT, который будет добавлен и флажок "Объединить".
  6. Следуйте шаг 1.4.3 снова настроить Z позицию импортированного файла трассировки. Выберите только добавленных левые и правые контуры в главном окне, чтобы избежать перемещения других следов. Установка каждого последующего файла трассировки до 50 мкм из Z позиции предыдущего контура в течение 50 мкм секций. (Первый контур: г = 0, второй контур: г = 50, третий контур: г = 100, и т.д.)
  7. Чтобы настроить X, Y позиции отдельных контуров и маркеров, нажмите "Включить перевод с помощью мыши 'кнопку, и тащить контуры по согласованию с предыдущими контурами тканей. Держите оба левые и правые контуры текущей трассы выбранДля синхронного движения.
  8. Чтобы повернуть следы по часовой стрелке или против часовой стрелки, чтобы выстроиться средней линии маркеров, выберите кнопку 'оси вращения. Чтобы перевернуть контуры всей Y-оси (если слева контур справа) выберите оба импортные контуры и маркеры, щелкните правой кнопкой мыши, выберите 'Set' Угол поворота, и введите "180" в "Y ротации".
  9. Убедитесь, что желудочки и средней линии маркеры лучше выровнены перед сохранением файла реконструкции, как в шаге 1.4.4.
  10. Повторите шаги 1.4.5 1.4.9 для каждого последующего ткани ломтик, пока все не были импортированы и правильно выровнены.
  11. Для просмотра объема данных последовательного реконструкции, нажмите анализ> "Маркеры и область Анализ" и выберите "3D Контур Сводка". Выберите все контуры в левой панели, а затем нажмите кнопку "3D визуализация" для отображения окончательного восстановления 3D.

2. Человеческий Анализ Перивентрикулярные клеточную целостность и 3D моделирования бокового желудочка

2.1) Анализ данных МРТ человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы перечислены для создания 3D-реконструкции изображения и объемного количественного боковых желудочков и оценить объемные изменения с течением времени, используя продольный анализ наложения. Важно отметить, что последовательность в сборе МР данных (например, машины и силой магнита, толщины сечения, ориентации и разрешение) и обработки после приобретения крайне важные критерии для включения наборов данных 20.

  1. Желудочковая Сегментация
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИТК / мгновенного используется для сегмента желудочки от T1-взвешенных МРТ высокого разрешения. В качестве альтернативы, другой бесплатной программы, такие как Freesurfer могут быть использованы.
    1. Открыть ИТК / мгновенного, Файл> Открыть изображение в градациях серого. Выберите нужный файл и открыть как .nii файла (NITFI файла).
    2. Прокрутка каждого Анатomical самолет, отметив желудочковая аномалии (суженный регионы, большие или малые временные рога, и т.д.). В основной панели инструментов нажмите кнопку "Snake ROI Tool". Нажмите кнопку "Segment 3D". Выберите опцию 'Интенсивность региона.
    3. Нажмите кнопку "Предварительная обработка изображения». Выберите «выше», чтобы включить регионы ниже определенного порога интенсивности, с тем чтобы подчеркнуть ROI в белом. Запишите максимальную интенсивность использования ползунка. Установите порог до 15% от максимальной интенсивности (запись этого значения). Установите параметр гладкость до 10. Нажмите "OK", затем "Далее".
    4. Добавить 10-12 небольшой размер (2) 'пузыри' на каждой желудочка: два в передней фронтальной рога, семь равномерно распределенных по верхней поверхности боковой желудочек тела, один в затылочной рога и один в височной рога бокового желудочка. "Выберите Параметры" и установить силу кривизны до 0,4. Нажмите Play, чтобы начать символ эволюции активное контур,
    5. Нажмите кнопку "Обновить" Mesh для визуализации поверхности; проверить 'Auto-Update'. Стоп сегментации, когда все области бокового желудочка включены в области интереса (ROI). Избегайте включения третьего желудочка. Нажмите кнопку "Готово".
    6. Вручную редактировать файл, если необходимо, чтобы удалить нежелательные области с помощью следующих методов (как правило, необходимо, чтобы стереть третий желудочек утечки). Вручную использовать '3D' скальпеля инструмент для удаления избытка регионы или вручную с помощью 'Кисть' инструмент с 'Clear Этикетка "в качестве активного чертежа метки, чтобы стереть любую включение пределами ROI.
    7. Сохранить результаты сегментации как .nii изображения (формат файла "NIFTI ').
    8. Чтобы получить общий объем желудочка, выберите 'Сегментация> Громкость »и статистики; получить общий объем желудочка, используя набор метку цвета.
  2. Продольный Представление боковых желудочков От MRIScans
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИспользованиеПрограммное обеспечение Манго, продольные трансформирования накладываются на качественно и количественно продемонстрировать изменения в объеме желудочка в пределах субъектов с течением времени.
    1. Открыть Манго. Нажмите Файл> Загрузить ROI в момент времени первый ROI (базового) как зеленый. Файл> Загрузить ROI второй момент времени ROI как красный. Сохранить продольную накладку, выбрав Файл> Сохранить как; назначить каждое изображение как 'файла name_ [Первая точка возрастной время] - [точка возрастной второй раз] .nii ".
    2. Откройте ИТК-SNAP. Повторно комбинированный ROI как «исходном изображении», выбрав сегментации> Load From Image> объединенного файла ROI. Для получения данных продольные объем выполните следующую: сегментация> Громкость и статистика> Метка 1 (красный) = объем расширения; Этикетка 2 (зеленый) = объем стеноз; Этикетка 3 (синий) = базовый объем.

2.2) Человеческий Перивентрикулярная Подготовка ткани и анализ

  1. Инструкции по технике безопасности для работы с человеческой ткани
    1. Получить appropетел обучение технике безопасности (например,., ГКИ, конечно).
    2. Соблюдайте стандартные (универсальные) меры предосторожности. Надевайте перчатки. Изменить перчатки, прежде чем прикасаться любой общее оборудование или поверхностей, которые не одноразовые. Добавьте все детали обычно обрабатываются при работе с человеческой ткани с "использование человеческих тканей" обозначений.
    3. Следуйте практики обеззараживания для всех элементов, контактирующих тканей человека. Bleach все загрязненных жидкостей в течение как минимум 24 часов до утилизации, лечения загрязненных поверхностей с отбеливателем пропитанной полотенцем (например, скамейка верхней) или путем размещения объекта непосредственно в отбеливателем (например, щипцы).
    4. Подготовить план на случай непредвиденных обстоятельств для контакта с человеческой ткани непосредственно на кожу, которая может включать замачивания бумажное полотенце в хлорной и проведение на пораженный участок (5-10 мин).
    5. Используйте соответствующую утилизацию отходов для всех элементов, контактирующих с человеческой тканью.
  2. Боковой желудочек Всего горе Подготовка
    1. Вeginning с интактной полушарии (фиксировали в 10% формалине и тщательно промывают 0,1 М PBS), нарезать 1,5 см Коронарные срезы через всю полусферу, используя большой нож.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы фиксации требуют предварительной проверки антител.
    2. Разделы маркировки спереди назад, начиная с первой секции, содержащей боковой желудочек. Используйте систему маркировки буквенно-цифровой, называя ломтики с буквами (спереди назад) и подразделе с числами (сверху вниз). Избегайте нарушая эпендимных поверхность.
    3. Использование микрохирургической скальпель, рассекают стенку желудочка 1 см глубоко, поддерживая одну непрерывную раздел всей боковой стенке. Разделите стены, как нужно создавать соответствующего размера разделов для окрашивания хорошо. Выемка раздел на противоположной стороне стенки желудочка для выявления превосходной / низший ориентацию.
    4. Выполнение извлечение антигена путем инкубации срезов ткани в 10 мМ натрий-цитратном буфере (рН 6,0) при 100 ° С в течение 10-20 мин с использованием двойного boileг (оптимальное время инкубации определяют эмпирически). Промыть 3 раза в PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
    5. Блок в 10% лошадиной сыворотки с помощью PBS / PBS-TX в течение 1 часа при комнатной температуре.
    6. Инкубируйте с первичными антителами в течение 48 ч при 4 ° С. Для визуализации желудочка облицовки, immunostain тотальных со следующими комбинациями антитела: анти-мыши β-катенин (1: 250); козий анти-GFAP (1: 250); кролика против AQP4 (1: 400).
    7. Выполните все последующие шаги в темноте. Промыть 3 раза ткани в PBS, инкубируют со вторичными антителами (1: 500) в течение 24 ч при 4 ° С или 2 ч при комнатной температуре, и промыть еще 3 раза в PBS. Инкубируйте ткани в DAPI в течение 7 мин при комнатной температуре с последующим с еще 3 полоскания в PBS.
    8. Подготовьте ткань для окончательного вскрытия, покрывая воском нижнюю тарелку с парафином. Заполните блюдо с PBS, поместите ткань в чашке с использованием тонких щипцов, избегая контакта с эпендимных стене.
    9. Под микроскопом рассекает, твердо ВХСУRe ткани на боковых помощью штифтов. С 22,5 ° микрохирургических колотой ножом, создать единые тонких срезов (примерно 300 мкм) из боковой стенки желудочка. Для больших участков или участков с затрудненным кривизны, нарезать кубиками небольших до резки в заключительной части для монтажа и примечания месте.
    10. Осторожно положите расчлененный раздел эпендимы стороной вверх на слайде с использованием тонких щипцов, принимая к сведению регионального местоположения и ориентации на слайде. Обложка ткани с тонким слоем aquapolymount, заботясь, чтобы избежать пузырей. Поместите покровное над ткани, добавить дополнительные aquapolymount, как нужно заполнить пробелы в покровное.
    11. Поместите установлены секции в темное и сухое в течение 2-3 дней при комнатной температуре. Хранить в slidebox при 4 ° С.
  3. Иммуногистохимия и Гистологический анализ
    1. Использование конфокальной микроскопии для просмотра флуоресцентного иммуногистохимии, установлен в фокальной плоскости изображения на поверхности желудочка, как определено с использованием Oе β-катенин (маркер для верхушечные слипчивых соединительных белков эпендимных клеток). Очертить регионы эпендимных охвата клетки и поверхности астроглиоза (GFAP окрашивания на поверхности желудочка).
    2. Для документа и фотомонтаж всей поверхности желудочка, использовать перекрывающихся изображений, чтобы покрыть всю поверхность. Чтобы создать монтаж последовательных изображений, откройте Adobe Photoshop. Используйте Файл> Автоматизация> Photomerge> Интерактивная макета выберите изображения для наложения, ручной настройки, если это необходимо.
    3. Создайте новый слой, чтобы проследить монтаж генерировать мультфильм представительство нетронутыми покрытия Эпендима клеток или желудочка поверхности глиозом. Повторите для каждого слайда или ROI. Составьте все разделы реконструировать карту стенки желудочка и ссылка на соответствующий регион на реконструкцию МРТ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Контур отслеживания мыши боковых желудочков на основе иммуноокрашиванию 50 мкм корональных секций и 3D реконструкций (рис 3) позволяет получить сведения об объеме, чтобы быть собраны в различных экспериментальных парадигм, используя мышь в качестве модельной системы для болезни или травмы. Решающее значение для этой процедуры является исключение тех регионах, где боковые стенки желудочка прилипают друг к другу. По subsegmenting регионы желудочков и назначение другого цвета для каждого региона (рис 3C), смежные разделы могут быть соблюдены и региональных и общий объем может быть рассчитана из скомпилированных подсегментов.

Подобные исследования могут быть выполнены с использованием МРТ головного мозга вместе с полуавтоматической сегментации (ИТК-SNAP) боковых желудочков для 3D визуализации. Для прямого сопряжения объемов желудочков и анализа перивентрикулярного ткани, до или после вскрытия МРТ на сегменты и выровнены для создания 3D-реконструкции ( (рис 5). Продольный анализ дает информацию о регионах, представляющих особый интерес для будущего иммуногистохимического анализа. Соответствующий ткани анализируется иммуногистохимически выявить регионы астроглиоза против неповрежденной эпендимных монослоя клеток на поверхности желудочка (рис 6а). Тканевые изображения будут захвачены, а затем montaged, чтобы покрыть большие участки поверхности желудочка (рис 6В). Составитель монтажи преобразуются в представлениях мультфильмов, а затем отображается на МРТ на основе 2D модели, чтобы показать региональные изменения в перивентрикулярного сотовой целостности (рис 6C). Всего подготовка горе стенки желудочка позволяет панорамный вид на больших просторах поверхности желудочка, или, как мы показали всю поверхность бокового желудочка 6. Увеличение лevels из аквапорин-4 выражении в районах поверхности глиозом предлагая отек может быть использован для оценки желудочка целостности футеровки 6.

Фигура 1
Рисунок 1: Выполнение бокового желудочка сегментации, используя ИТК / оснастку Snake ROI Tool (A) "Пузыри 'добавляются боковых желудочков. (Б) "Пузыри" расширить в ходе эволюции активной контура. (С) Сегментация завершается, когда весь боковой желудочек заполняется. (Принимаются меры, чтобы избежать 3-й желудочек).

Рисунок 2
Рисунок 2: Человек рассечение стенки бокового желудочка ( (D). (Е) часть стенки желудочка имеет вырезали и обрабатывали для IHC. Подразделение ткани может потребоваться в зависимости от размера и кривизны. Для поддержания ориентации, ткань надрезать сверху на противоположной стороне желудочка поверхности (зеленый). Пальцы (черные точки) используются для крепления ткани и направлять окончательное рассечение (красная пунктирная линия). Итоговый вся подготовка крепление монтируется на слайде с желудочек поверхностью вверх (зеленый).

Рисунок 3
Рисунок 3: Трассировка и 3D реконструкция мыши боковых желудочков (корональной разделе мозга мыши в том числе боковых желудочков, изложенных в S100β-иммунореактивных клеток эпендимных (*, боковых желудочков; кронштейн, область адгезив. Сион; Шкалы, 500 мкм). (Б) мыши боковые желудочки прослеживаются как «контуров» и расположены в подсегменты разделах, за исключением регионов внутрижелудочкового адгезии от вмешательства объемного анализа. (С) 3D реконструкция боковой желудочек контуров. Желтый, контур всему объему мозга, охватывающей область интереса, содержащей боковые желудочки.

Рисунок 4
Рисунок 4: МРТ на основе бокового желудочка сегментация () МРТ собраны. (Б) бокового желудочка определяется как ROI (красный). (С) 3D-реконструкция изображения позволяет для объемного количественного и качественного визуализации бокового желудочка.

объявления / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Рисунок 5: Оценка продольного расширения желудочка продольного магнитно-резонансную томографию с нескольких точек могут быть выровнены и обложил визуализировать и количественно желудочка расширение объема внутри субъектов в течение долгого времени.

Рисунок 6
Рисунок 6: Иммуногистохимическое оценки и региональное картирование человеческого боковой поверхности желудочка (а) участки интактных клеток эпендиме, изложенной окрашивания β-катенина, показывают булыжник вид (звездочка) и разграничены пунктиром из областей астроглиоза на поверхности желудочка (GFAP + окрашивание). (B) Последовательные конфокальные изображения накладываются, чтобы создать региональную монтаж и прослежены с помощью Adobe Photoshop для мультфильма представления клеточной организации на поверхности желудочка. (С) МультфильмИзображение монтаж отображается желудочка поверхности на соответствующих МРТ основана реконструкцию 3D желудочка. (Масштаб бар (), 40 мкм; Масштаб бар (B), 1 мм)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем инструменты и протоколы, которые могут быть использованы для оценки целостности системы желудочков мозга у мышей и человека. Эти инструменты, однако, может также применяться к другим структурам головного мозга или органов и систем, которые подвергаются изменениям в связи с травмой, болезнью или в процессе старения 14,21,22. Стратегии представлены использует преимущества программного обеспечения, что позволяет выравнивание поперечного сечения и продольных последовательностей МРТ для создания объема 3D представления конкретных регионов или сооружений, представляющих интерес. Продольный последовательности МРТ позволяют сборник изменений 3D объема, которые происходят в течение долгого времени и может быть расширена, чтобы включить общий объем мозга, для бокового желудочка в общей объемных соотношениях мозга, и / или другие структуры мозга (например, гипоталамический-ядерных 23 или мозолистого тела трактов белого вещества с помощью диффузионно-взвешенной визуализации тензор). Вместе всесторонний анализ структурных изменений головного мозга может быть выполнена. В конечном счете,оценить возрастные и болезни, связанные с изменениями в структурах мозга коллекция мультимодальных методов визуализации необходимо, чтобы обеспечить наиболее точную картину состояния здоровья мозга 24. Документация и составление критических структурных данных, вместе с изменчивостью субъект-субъектному и диапазона изменчивости через субъектов, в идеале можно было бы использовать для создания ультра-высокого поля МРТ атласы в лучшем направляющей клинического диагноза ткани в здоровья или болезни.

Несколько важных шагов важно отметить, чтобы уменьшить сбора и обработки изменчивости внутри и между наборами данных, подлежащих. В идеале, чтобы получить подобранные последовательности данных, же томограф и последовательность типа следует использовать на протяжении всего исследования. Посмертный ткани мозга часто меняя качества; Критические факторы, такие как причина смерти, посмертной интервала, качество перфузии, и продолжительности в фиксатора все может повлиять на эффективность окрашивания и необходимостьАнтиген поиска протокол. Кроме того, размер человеческого мозга требуется несколько секций фрагмент с каждого среза, требующего дальнейшей обработки, чтобы получить ткань, содержащую интерес областей. Поэтому, очень важно, чтобы расположение и ориентация каждой секции четко обозначены и записал. В конечном счете, основной проблемой анализа посмертных тканей, что именно - это посмертных - и, следовательно, обеспечивает только мгновенный снимок ткани в конце жизни. Улучшенные мультимодальные методы визуализации необходим для анализа в реальном времени изменений в структурах головного мозга и морфо-функциональной информации с клеточной резолюции.

Исследования мыши позволяют допрос человека переменной условия по переменной и не представляют многие трудности, найденных при работе с человеческой тканью. Исследования мыши, используемые для моделирования человеческого болезни или травмы в результате анализа причинно-следственных структурной динамики может предложить усовершенствования для болезни модели валidation. Тем не менее, следует отметить, видовые различия конкретных. В нашем анализе боковых желудочков, важно отметить, что у мышей, сохраняют активное нишу стволовых клеток вдоль боковой стенки боковых желудочков и стволовых клеток опосредованного восстановительного ремонта футеровки желудочка происходит в случаях скромных эпендимных гибели клеток, так как найти в старых мышей, или когда ограничены эпендимных оголение клеток происходит в результате воздействия на эпендимы для нейраминидазы 19. В отличие от этого, люди не выдерживают надежную нишу стволовых клеток вдоль боковых стенок желудочков 25-27 и мало, если таковые имеются, регенерация, скорее всего. В отличие от мышей в возрасте, в возрасте люди показывают огромный астроглиоз на поверхности желудочка, связанной с расширением желудочка 6. Этот уровень денудации и «рубцов» желудочка облицовки могут быть смоделированы у мышей с помощью нейраминидазы оголять желудочка прокладку эпендимных клеток 6,28. Кроме того, важно, чтобы распознать йна вивария-поддерживается мышей не испытывают инфекции, болезни или травмы, представляя много различных историю болезни от большинства человеческих существ. Кроме того, мыши, как правило, не показывают возраст-ассоциированных заболеваний нейродегенеративных, вентрикуломегалия или перивентрикулярная глиоза. Поэтому, чтобы соблюдать эти фенотипы они должны быть смоделированы. В конце концов, ни одна модель животное не может полностью повторять онтогенез, патофизиологии, и симптоматическое сложность заболевания человека и должны быть признаны и должным образом доведены эти ограничения.

В целом, мы представляем методы и протоколы для оценки боковые объемы желудочка мыши и человека. Желудочки может быть оказана в 3D и продольный анализ позволяет компиляцию изменений пространственно-временных громкости. Кроме того, с помощью парного ткани мозга показано, как сотовая функции могут быть связаны с изменениями в объемах желудочка. Последние результаты, демонстрирующие повышенный уровень аквапорин-4 выражении в районах periventricuLAR глиоз предложить отек вдоль поверхности желудочка. Поэтому будущие исследования спаривания FLAIR-МРТ с ткани гистологии улучшит наше понимание CSF и межуточный обмен жидкости, и обеспечивают важную информацию о состоянии системы желудочка и как его ухудшение влияет на различные функции мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 21600-069
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 19210 Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum Life Technologies 16050 10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum Life Technologies 16210 10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX) Sigma-Aldrich T8787 0.1% in PBS (v/v)
Vibratome Leica VT1000S
Fluorescence Microscope Zeiss Imager.M2
Camera Hamamatsu ORCA R2
Microscope Stage Controller Ludl Electronic Products MAC 6000
Stereology software MBF Bioscience Stereo Investigator 11
Stereology software ImageJ/NIH NIH freeware
3D Reconstruction software MBF Bioscience Neurolucida Explorer
Confocal Microscope Leica TCS SP2
MRI Software
Freesurfer https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall Segmentation and Volume
ITK-Snap http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango) http://ric.uthscsa.edu/mango/ Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife Fisher Scientific NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish 
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope Leica MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin BD Bioschiences, San Jose, CA, USA 1:250
goat anti-GFAP Santa Cruz Biotechnology 1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)  Sigma-Aldrich 1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody Sigma-Aldrich 1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Life Technologies D-1306 10 µg/ml in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
  2. Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
  3. Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
  4. Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
  5. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
  6. Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. (2013).
  7. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
  8. Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
  9. Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
  10. Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
  11. Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
  12. Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
  13. Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
  14. Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
  15. Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
  16. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  17. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (2010).
  18. Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
  19. Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
  20. Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
  21. Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
  22. Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
  23. Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
  24. Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
  25. Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
  26. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  27. Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
  28. Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics