Snabb Identifiering av kemiska genetiska interaktioner i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fastställande av verkningsmekanism av bioaktiva kemikalier är av intresse för ett brett spektrum av akademiska, läkemedels- och industriforskare. Saccharomyces cerevisiae, eller spirande jäst, är en modell eukaryot för vilken en komplett samling av ~ 6000 gen deletionsmutanter och hypomorphic väsentliga gen mutanter är kommersiellt tillgängliga. Dessa samlingar av mutanter kan användas för att systematiskt upptäcka kemiska-gen interaktioner, dvs gener som är nödvändiga för att tolerera en kemikalie. Denna information, i sin tur, rapporter om den troliga verkningsmekanism föreningen. Här beskriver vi ett protokoll för snabb identifiering av kemiska-genetiska interaktioner i knoppande jäst. Vi demonstrerar den metod som använder det kemoterapeutiska medlet 5-fluoruracil (5-FU), som har en väl definierad verkningsmekanism. Våra resultat visar att den nukleära TRAMP RNA Exosome och DNA-reparationsenzymer behövs för proliferation i närvaro av 5-FU, vilket överensstämmer med tidigare microarray baserade streckkodning kemiska genetiska metoder och den kunskap som 5-FU påverkar både RNA och DNA metabolism negativt. De erforderliga valideringsprotokoll för dessa hög genomströmning skärmar beskrivs också.

Introduction

De genetiska verktyg och resurser som finns tillgängliga i modellen organismen Saccharomyces cerevisiae har möjlig storskaliga funktionell genomik studier som kollektivt ger ny insikt i hur gener fungerar som nätverk för att uppfylla kraven i biologiska system. Hörnstenen i dessa verktyg var samarbets skapa en komplett uppsättning av icke väsentliga gen deletioner av alla öppna läsramar i jäst 1,2. Ett slående observation var att endast ~ 20% av jästgener krävs för lönsamhet när den odlas som haploider under standardlaboratorieförhållanden. Detta belyser förmågan hos en cell att buffra mot iska störningar genom utnyttjande av alternativa biologiska vägar. Genetiska mutanter som är livskraftiga individuellt, men dödlig i kombination, signal anslutna eller konvergerande parallella biologiska vägar och bilda genetiska interaktionsnätverk som beskriver biologisk funktion. Med utvecklingen av villkor temperature-känsliga och hypomorphic alleler av essentiella gener tekniken inte har begränsats till studiet av icke-väsentliga gener 3,4. Detta koncept har tillämpats på genomisk skala producera en opartisk genetisk interaktion karta som visar hur gener involverade i liknande cellulära processer kluster tillsammans 5.

Kemiska störningar av genetiska nätverk härma gen strykningar (Figur 1) 6. Ställa frågor tillväxthämmande föreningar mot en hög densitet rad radering stammar för överkänslighet identifierar en kemisk-genetisk interaktion profil, dvs en lista med gener som krävs för att tåla kemisk påfrestning. Liksom genetiska interaktioner, har storskaliga skärmar av kemiska bibliotek visade att föreningar med en liknande verkningsmekanism kluster tillsammans 7. Därför, genom inrättandet av kemikalie genetiska interaktionsprofilen för en förening i verkningsmekanism kan härledas genom att jämföra den med larGE-skalan syntetiska genetiska och kemisk genetisk interaktion Dataset 8,9.

Storskaliga kemiska-genetiska skärmar, där mängder av föreningar förhördes, har utförts av streckkod konkurrensanalyser. I detta tillvägagångssätt är den poolade samling av radering stammar odlas en masse för flera generationer i en liten volym av media som innehåller en kemikalie. Eftersom varje deletionsmutant hyser en unik genetisk streckkod, är lönsamheten / tillväxt av individuella mutanter inom pool av radering stammar spåras av microarray eller hög genomströmning sekvense 10.

Att utgå fitness genom att övervaka koloni storlek fysiskt klädd mutanter odlas på fast agar innehåller en bioaktiv förening är också en effektiv metod för att identifiera kemisk-genetiska interaktioner 11,12. Denna metod ger ett kostnadseffektivt alternativ till konkurrensbaserad screening och är väl lämpad för att analysera små bibliotek av kemikalier.Skiss här är en enkel metod för att producera en lista med kemisk-genetiska interaktioner i S. cerevisiae som inte förlitar sig på molekylärbiologiska manipulationer eller infrastruktur. Det kräver bara en jäst radering samling, en robot eller manuell fastlåsning apparat, och fritt tillgänglig bildanalys mjukvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Det allmänna arbetsflödet för detta förfarande skisseras i Figur 2.

1. Fastställande av Tillväxt-hämmande dos

  1. Framställning av jäst övernattskultur
    OBS: jästextrakt-pepton-dextros tillväxtmedier (YEPD) används i detta protokoll är ett standardrecept 13.
    1. Serie ut BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celler på en YEPD-agarplatta och inkubera i 48 h vid 30 ° C eller tills synliga kolonier bildas.
    2. Förbered natt kulturer genom ympning 5 ml YEPD flytande medier i en steril odlingskärl med en enda koloni. Inkubera över natten vid 30 ° C med kontinuerlig rotation eller skakning. Kulturen kommer normalt når mättnad av morgonen (~ 2 × 10 8 celler / ml).
  2. Fast agarmedier preparat innehållande varierande kemiska doser
    1. Förbered flera lager avkemikalien som skall testas vid 100x önskade slutliga koncentrationen i ett lämpligt lösningsmedel.
      OBS: Effektiva koncentrationer kommer att bero på den kemiska och måste bestämmas empiriskt. Det är därför lämpligt att inledningsvis prova ett brett slutlig koncentrationsområde, det vill säga, från låg iM till hög mM.
    2. För varje koncentration av kemikalien som skulle testas, alikvot 3 ml smält YEPD-agar till en flera sterilt odlingsrör. Placera i 55 ° C vattenbad för att hålla från att stelna.
    3. För varje koncentration av kemikalien som skulle testas till 30 ul av 100x föreningen till smälta mediet, virvel 2-3 sek för att blanda, och pipettera 1 ml i varje par av dubbla brunnar i en 12-brunnars platta. Var noga med att inkludera ett fordon endast kontroll. Låt plattorna för att ställa över natten i rumstemperatur. Kasta någon extra medier.
  3. Sprid plätering celler
    1. Ympa 10 ml YEPD flytande medier med 2 pl av en mättad jästkultur, som odlas över natten som i steg 1.1.2.
    2. Plate 25 fil utspätt jästkultur per brunn, jämnt med användning av sterila glaspärlor eller stång, och göra det möjligt för plattan att torka under en låga. Inkubera plattan vid 30 ° C under 48 h.
    3. Utvärdera tillväxten av jäst (både totala antalet och storleken av kolonier) på plattorna. Välj en subletal koncentration av förening som inte inhiberar tillväxten med mer än 10% -15% för att utföra skärmen.

2. Systematisk Kemisk Genetisk Screen

  1. Underhåll av deletion-mutant-array (DMA) och Beredning av Source Plate
    1. För en detaljerad beskrivning på att bygga deletionsmutant arrayer från glycerol lager se Baryshnikova et al. 14. När deletionsmutanter har grupperade vid en densitet av 384 kolonier per platta, kan DMA lagras under flera månader vid 4 ° C. Replikera på YEPD agar innehållande 200 ug / ml av G418 som krävs för att förhindra kolonier från att växa in i varjeandra.
      OBS: Flera seriereplika bör undvikas för att förhindra förlust av långsamt växande raser och minimera uppkomsten av suppressor mutanter. Detta är särskilt relevant om upprätthållande samlingarna som haploider.
    2. Utför alla replika-plating steg med hjälp av en mikrobiell arraying robotsystem. Alternativt, manipulera klädd kolonier använder manuella Postar verktyg.
      OBS: Jäst radering kollektionen finns som haploider och diploider från flera kommersiella källor och är normalt levereras som glycerol lager i 96-hålsplattor.
  2. Kondensera deletionsmutanten array
    1. Bered 250 ml YEPD-agarmedia innehållande 200 ug / ml G418. Den effektiva koncentrationen av G418 kan variera och varje parti bör testas empiriskt.
    2. Bered fem YEPD agarplattor genom att hälla 50 ml YEPD-agar innehållande 200 ug / ml av G418 per platta. Gör detta en dag före kondense arrayen och tillåta plattorna att svalna vid rumstemperaturratur över natten på en plan jämn yta.
      OBS: Fyra plattor kommer att krävas för insamling vid 1536-stam täthet, är den femte plattan hälls som en extra.
    3. Ta bort de 16 Petri-skålar innehållande den mutanta samlingen deletionen vid en densitet av 384 kolonier per platta och låt komma till rumstemperatur (~ 1 h).
    4. Torka någon kondens som har bildats på locket till varje platta med hjälp av en grannlaga uppgift torka. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i vattendroppar som deponeras på matrisen och korskontaminering av klädd mutanter.
    5. Med hjälp av en mikrobiell array pinning robot, kondensera DMA från en densitet av 384 kolonier per platta (16 Petri rätter) till 1.536 kolonier per platta (4 Petri rätter). Utför detta så att 1: a koloni från plattan 1 stift till rad 1 kolumn 1 i den kondense array, den 1: a koloni av plattan 2 rad 1 kolumn 2, 1: a koloni av plattan 3 till rad 2 och kolumn 1, och 1: a koloni av plattan 4 till rad 2kolumn 2.
    6. Inkubera den konsoliderade matrisen vid 30 ° C över natten.
    7. Undersök array för att säkerställa en enhetlig överföring av kolonier från källplattor. Det kommer att finnas flera tomma positioner, avsiktinförlivade i matrisen, som tjänar som en guide för att säkerställa DMA har kondenserats på rätt sätt (Figur 4A).
      OBS: Dessa kommer att vara källplattor för replika plätering på media som innehåller testföreningen. En enda källa platta kan användas för flera pinnings. Också många robotar kommer att ha en motverkande funktion, vilket kommer att garantera liknande siffror för jäst som överförs varje gång.
  3. Replica platta deletionsmutant array
    1. Bered 700 ml kontroll (fordonet endast) och 700 ml experimentell media (kemisk-innehållande). Detta är tillräckligt för att utföra analysen i tre exemplar (12 plattor per tillstånd, plus två extra).
    2. Häll 50 ml YEPD agar innehållande testkemikalie eller kontroll per platta. Låt plattorna to svalna i rumstemperatur över natten på en plan jämn yta.
    3. Använda roboten till replika platta, ympa DMA på tre uppsättningar av plattor som innehåller kemikalier vid experimentellt bestämda koncentrationen, samt tre uppsättningar av plattor innehållande fordonskontrollen. Inkubera plattorna vid rumstemperatur under 24-48 timmar.

3. Imaging Tallrikar och dataanalys

  1. Ta bort plattorna från inkubatorn och låta dem komma till rumstemperatur (~ 1 timme) före avbildning. Detta kommer att förhindra att kondens bildas samtidigt avbildning plattorna.
  2. Bildplattor vid 24 och 48 timmar genom att ta bort locket och placera sidan nedåt på en plan bäddsskanner. Fånga bilder med en upplösning på minst 300 dpi. Alternativt kan du använda en digital kamera för att ta bilder. Om att göra så, placera tallrikar sidan upp på en mörk bakgrund och ta bort locken till bilden.
    OBS: Filformatet och placering av plåtar beror på kvantifiering program som används. Utför kvantifiering och jämförelse av arraykolonistorlekar som använder en av flera open source-program, bland annat Balony 15, SGAtools 16, och ScreenMill 17.

4. Validering av Screen

OBS: I det här skedet flera jäst strykningar mutanter kommer göra så överkänslig för kemikalien av intresse. Dessa kemiska-genetiska interaktioner måste nästa valideras på två sätt. Först identitet känsliga stammar bör bekräftas med PCR. För det andra måste kemisk känslighet oberoende gjorde. Nedan beskrivs är en kortfattad protokoll för utförande spotting analyser för att validera stam överkänslighet, en teknik som är vanlig i jäst biologi.

  1. Serie ut önskad (överkänslig) mutanter från jästen radering samling på YEPD-agar innehållande 200 ug / ml G418. Inkubera vid 30 ° C tills kolonier bildas. Verifiera genotypen av stammen genom diagnostisk PCR med primers enligttillverkarens protokoll.
  2. Inokulera 5 ml av YEPD vätska för varje stam och inkubera över natten vid 30 ° C med rotation eller skakning.
  3. Mät OD 600 och späd varje stam till OD 600 = 1 i steril dH 2 O. Dessa är nu de normaliserade jästkulturer.
  4. Dispensera 100 pl av normaliserad vildtyp jäst (BY4741) kultur till väl A1 i en 96-brunnsplatta. Dispensera 100 pl av ytterligare upp till sju stammar till brunnarna B1-H1.
  5. Använd en flerkanalspipett att fördela 90 l sterilt dH 2 O till brunnar A2-H2 via A6-H6. Slutligen förbereder en serie 1:10 utspädningar av normaliserade jästkulturer. Börja med seriellt pipettering 10 pl kolumn 1 till kolumn 2 med en flerkanalspipett, och fortsätter över 96-brunnar förrän sex spädningar görs (dvs. 10 0-10 -5).
  6. Överför 2-5 pl utspädda jästkulturer i ett rutnät med hjälp av en flerkanaligpipett på YEPD fasta medier som innehåller kemiska och fordonsstyrning. Inkubera plattorna vid lämplig temperatur under 24-48 h.
  7. Inspektera tallrikar och jämföra känsligheten hos utvalda mutanter kemisk (relativt BY4741 kontroll). Bildplattor vid 24 och 48 h såsom i steg 3.2.
    OBS: Även identifiering av flera överkänsliga stammar med tillhörande gen ontologier eller funktioner ger självförtroende att giltigheten av skärmen, omvandling av en överkänslig radering stam med en plasmid innehållande en vildtyp kopia av genen är skyldig att formellt fastställa att en gen radering av intresse (och inte dolda mutationer i andra) orsakar läkemedelskänslighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som en validering av detta tillvägagångssätt vi utförde en representativ kemisk genetisk interaktion skärmen på kemoterapeutiska medlet 5-fluorouracil (5-FU) efter de ovan skisse protokollet. 5-FU är känd för att störa tymidylatsyntas liksom DNA och RNA-metabolism 18. De kemiska genetiska interaktioner av 5-FU är väl studerade och har undersökts av jäst streckkod microarray teknik som använder både heterozygota och homozygota radering samlingar 8,19. Här visar vi att liknande resultat kan erhållas genom jämförande kvantifiering av mutant kolonistorlek.

Det bör noteras att skärmen utförs utnyttjar den icke-essentiella haploid samling gendeletion. Denna typ av skärm kan även utföras med hjälp av diploida stammar, mutanter temperaturkänsliga och hypomorphic alleler, vilket gör att införandet av viktiga mutanter gen. En fördel med att använda den haploida samlingen rader är ökad drog Känsatt av mål- vägar, med tanke på den fullständiga avsaknaden av genprodukten. Men två betydande nackdelar är att väsentliga gen överkänslighet inte kan söka, och den haploida kollektionen är benägen att spontana suppressormutationer som väljs ut för över flera generationer. Detta kan leda till en försämring av samlingen. Således finns det en inneboende kompromiss mellan integritet och bredden i arrayen och känslighet för läkemedelseffekt. Detta måste beaktas och det mest lämpliga mutant samlingen väljas baserat på den önskade applikationen.

Först den lämpliga under dödlig koncentration av 5-FU som ska användas på skärmen bestämdes till 10 ^ M genom att växa BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celler på att öka koncentrationen av 5-FU och visuellt utvärdera jästkolonitillväxt ( Figur 3A). Alternativt kan liknande resultat erhållas genom att odla yeast i mikrotiterplattor i flytande kultur och frekvent övervakning av kulturer optisk densitet med hjälp av en mikroplattläsare (Figur 3B), som den beskrivs av tidigare grupper 10,20.

Använda Singer ROTOR ades jästen DMA replik vid 1536 kolonier per platta densitet på media innehållande 10 pM 5-FU eller ett dimetylsulfoxid (DMSO) kontroll (Figur 4A). Dessa plattor inkuberades under 24 h vid rumstemperatur och avbildas på en plan bädd skanner. Colony storleksmätning för varje mutant på både experimentella och kontrollplattor utfördes med användning av Balony bildanalys motor 15. Den Balony mjukvaran beräknar storleksförhållandet kolonier på den experimentella array förhållande att kontrollera. Användaren har möjlighet att fastställa ett tröskelvärde förhållande och om skärmen utförs i minst tre exemplar ett p-värde kommer att tilldelas för varje mutant. I våra mutanter representativa skärm som visade ett förhållande på ≤0.8 var övervägaed att vara träffar. Resultaten av koloni kvantifiering kan presenteras grafiskt genom att plotta storleksförhållandet för varje koloni på y-axeln och gendeletion beställts av matrisposition (figur 4B) eller förhållandet (fig 4C) på x-axeln.

Syntetisk sjuk / dödliga mutanter identifierats i skärmen kan grupperas utifrån funktionsbeskrivningar genom att utföra gen ontologi (GO) analys. Det finns flera offentligt tillgängliga verktyg för GO analys av listor över S. cerevisiae-gener; inklusive Funspec 21, DAVID Bioinformatik Databas 22,23, och Saccharomyces Genome Database (SGD) Go Term Finder 24. Gene strykningar att hade en ratio på mindre än eller lika med 0,8 i 5 FU skärmen användes som en ingångslista för Funspec. Funspec accepterar en lista med systematisk eller vanlig jäst gen namn och matar sammanfattningar av genen ontologier, funktionella klassifikationer, lokalisering, proteinkomplex samt othennes användbara klassificeringar som anrikas i den listan. Den representativa skärmen utförs visade en anrikning av ontologier för RNA-metabolism, inklusive tRNA vickar, uridin modifiering och RNA övervakning maskiner, och svar på DNA-skada (Tabell 1). Dessa resultat överensstämmer med tidigare studier som har visat 5-FU behandling leder till ansamling av polyadenylerade icke-kodande RNA, som behandlas av den nukleära Trf / Rrp6 / Luft / Mtr4 polyadenylerings (TRAMP) Exosome 25. Således dessa resultat överensstämmer med tidigare kemiska genetiska skärmar och den kända mekanismen av 5-FU bioaktiviteten 8,19.

Som med alla hög genomströmning funktionella iska metoder är det nödvändigt att validera resultaten. För att validera kemiska genetiska interaktioner jästmutanter bör först PCR-valideras med primers som hybridiserar inom målet genens promotor och kanMX störningar kassett. Val av stammar för giltigtation är något godtyckliga, men prioriterar mutanter som visar en stark fenotyp och grupp ger funktionellt en bra utgångspunkt. Därefter överkänslighet mot en kemikalie bekräftas med spotting analyser, en gemensam strategi för att mäta lämplighet jästmutanter. För detta ändamål är serieutspädningar av jäststammar spotted i ett rutnät på media innehållande lämpliga kemiska dosen samt en kontroll. Som ett exempel, vi bekräfta den kemiska genetiska interaktionen av 5-FU med Air1 och trf5 mutanter av TRAMP komplexet (figur 5). Dessa gener kodar komponenter av TRAMP nukleär Exosome. Vi noterar att rrp6 stam, som saknar kärna 3'-5 'exonukleasaktiviteten av TRAMP, förlorades i vårt labb höga densitet DMA samling. På att få en ny rrp6 mutant vi bekräftar att rrp6 och 5-FU visa också en kemisk genetisk interaktion, som fastställer att TRAMP aktivitet krävs att tolerera 5-FU. Detta illustreraratt integriteten för stora radering samlingar kan bli nedsatt under tiden, vilket gör ordentlig DMA underhåll och validering stam kritisk.

Vår skärm identifierade också mutanter i flera DNA-reparationsenzymer (inklusive RAD50, rad52 och mre11) som 5-FU känslig. Poängsättning av kolonistorlek indikerade relativa lämplighet av dessa mutanter den 10 iM 5-FU som 0,7, 0,65, och 0,42 jämfört med vildtypen. Utifrån våra bekräftande spotting-analyser (Figur 5), dessa värden är en underskattning sannolikt på grund av den begränsade dynamiska området för fitness mätning av kolonistorlek scoring. Detta belyser en andra anledning att självständigt bekräfta interaktioner genom seriespotting: storleken på vissa kemiska genetiska interaktioner kan underskattas i primärdataanalys. Våra resultat visar att en tillväxtbaserad kemisk genetisk skärm utförs med ~ 4.800-stam haploid radering samling, i tre exemplar, ger tillräcklig resol mepannor att tryggt isolera specifika kemiska genetiska interaktioner.

Figur 1
Figur 1: Schematisk. Representation av kemiska Genetiska Interaktioner Gene deletioner som resulterar i överkänslighet mot kemiska störning möjliggör identifiering av biologiska processer som omfattas av en kemikalie. (A) Convergent vägar kan störas av endera gendeletion (genea) eller kemiskt (geneB). Individuellt kan dessa cellulära förolämpningar tolereras på grund av den inneboende redundans i biologiska vägar. Men i kombination cellviabiliteten äventyras vilket resulterar i antingen en syntetiskt sjuk eller dödlig fenotyp. (B) Strykning av gener (geneC) kritiska för att mildra kemiskt inducerad spänning också orsaka överkänslighet och ange biologiska vägar störs genom kemisk behandling. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Arbetsflöde för kemisk Genetisk Screen (A) Fastställande av sub-hämmande dos:. Föräldrajäststammar odlas till stationär fas, utspädd 1: 5000, och spridning pläterade på fasta YEPD medium innehållande ökande kemikaliedosen. Den högsta koncentrationen har inte är större än 10-15% tillväxthämning är valt för screening mot DMA. (B) Systematisk Kemisk Genetisk Screen: Med hjälp av en hög genomströmning array pinning robot S. cerevisiae DMA är replik klädd på media som innehåller lämplig koncentration av testkemikalien. Plattor inkuberas vid rumstemperatur under 24-48 h, avbildas, och relativ kolonistorlek bestämdes.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3 :. Fastställande av Sub-hämmande koncentration. (A) Tillväxt av BY4741 celler på fasta medier innehållande 5-fluouracil. Mättad BY4741 kultur utspädd 1: 5000 och ströks ut på ökande koncentrationer av 5-fluorouracil. (B) Tillväxt kurva BY4741 celler i flytande medier innehållande 5-flurouracil. ~ 4 x 10 4 celler deponerades i triplikat i ökande koncentrationer av 5-FU och OD mättes varje 10 min under 22 h.

Figur 4
Figur 4: Kemisk Genetisk Screen of 5-Fluorouracil. (A) S. cerevisiae deletionsmutant array replik på YEPD-agar innehållande 10 ^ M 5-FU (höger) och DMSO kontroll (vänster). (B) Resultat av kemiska Genetisk Screen: Relativ tillväxt av mutanter på 10 nM 5-FU jämfört med DMSO kontroll beställts av array läge. (C) Relativ tillväxt av mutanter på 10 nM 5-FU jämfört med DMSO kontroll beställts av kolonistorleksförhållande. Ett förhållande tröskel på ≤0.8 indikeras på båda grafer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5: Validering av kemiska Genetiska interaktioner. Serieutspädningar av flera isolerade mutanta stammar odlas på DMSO Kontroll (A), 10 fiM 5-FU ( C).

GO Kategori P-värde Gener identifierade (hits) # träffar Totalt av gener i GO Kategori
tRNA wobble uridin modifikation [GO: 0002098] 2,24 × 10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
transkription, DNA-beroende [GO: 0006351] 1,69 x 10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
translation [GO: 0006412] 4,28 x 10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
tRNA wobble ställning uridin tiolering [GO: 0002143] 1,88 x 10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3 5
reglering av transkription, DNA-beroende [GO: 0006355] 4,98 x 10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
protein urmylation [GO: 0032447] 6,33 x 10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
mRNA export från kärnan som svar på värmestress [GO: 0031990] 2,04 × 10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
nukleär polyadenylering beroende CUT katabol process [GO: 0071039] 2,04 × 10 -3 Air1 TRF5 MPP6 3 10
tryptofan metabola processen [GO: 0006568] 2,15 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 3
tidigt endosom till Golgi transporter [GO: 0034498] 2,75 × 10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
ribosomala lilla subenheten biogenes [GO: 0042274] 3,63 × 10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
kromatin modifikation [GO: 0016568] 3,64 × 10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
ATP metabola processen [GO: 0046034] 4,23 × 10 -3 VMA2 VMA1 2 4
vakuolär proton transporter V-typ ATPas komplex sammansättning [GO: 0070072] 4,23 × 10 -3 VMA21 VPH2 2 4
kromosom lokalisering [GO: 0050000] 4,23 × 10 -3 NUP120 NUP133 2 4
mRNA transporter [GO: 0051028] 4,59 × 10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
vakuolär försurningen [GO: 0007035] 4,89 × 10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
rRNA export från kärnan [GO: 0006407] 5,63 × 10 <sup> -3 NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A 4 27
endocytos [GO: 0006897] 6,57 × 10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 7 82
nukleär mRNA övervakning av mRNA 3'-end bearbetning [GO: 0.071.031] 6,92 × 10 -3 Air1 MPP6 2 5
ncRNA polyadenylering [GO: 0043629] 6,92 × 10 -3 Air1 TRF5 2 5
nukleär polyadenylering beroende snoRNA katabol process [GO: 0071036] 6,92 × 10 -3 Air1 TRF5 2 5
nukleär polyadenylering beroende snRNA katabol process [GO: 0071037] 6,92 × 10 -3 Air1 TRF5 2 5
tryptofan biosyntetiska processen [GO: 0000162] 6,92 × 10 -3 TRP5 TRP3 2 5
protein insättning i ER membran [GO: 0045048] 6,92 × 10 -3 Get1 GET4 2 5
mRNA stabilisering [GO: 0048255] 6,92 × 10 -3 ATP25 IGO1 2 5
svar på DNA-skada stimulus [GO: 0006974] 7,05 × 10 -3 MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 dEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
i "> # träffar
GO Kategori P-värde Gener identifierade (hits) Totalt av gener i GO Kategori
nukleär polyadenylering beroende rRNA katabol process [GO: 0071035] 8,46 × 10 -3 Air1 TRF5 MPP6 3 16

Tabell 1: Gene ontologi (GO) Karakterisering av 5-fluorouracil Känsliga mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beskrivs här är en metod för att generera kemisk-genetiska interaktionsprofiler. Metoden är enkel: genom att jämföra koloni storlekar av varje stam i omfattande gendeletion samlingar i närvaro och frånvaro av en kemikalie, är alla gener som behövs för att tolerera en kemisk förolämpning identifierad. Notering anrikning analys av den resulterande listan över känsliga stammar kan sedan användas för att ge en inblick i en kemikalie verkningsmekanism. Även om detta protokoll har optimerats för blivande jäst, kan det också vara anpassad för användning med andra klädd mikrobiella radering samlingar, såsom E. coli Keio kollektionen, som har använts med framgång för att sondera hundratals cellulära störningar 26,27.

Kemisk-genetiska profiler i jäst och andra organismer är väl etablerad. Majoriteten av dessa studier har förlitat sig på konkurrensanalyser som kvantifierar poolade deletionsmutanter via microarray analys eller hög genomströmning SEQUrenser av unika genetiska streckkoder. Detta tillvägagångssätt har visat sig framgångsrik i att producera robusta kemisk-genetiska profiler av stora kemiska bibliotek. Den metod som beskrivs här tillhandahåller ett användbart alternativ för kemisk-genetisk analys av ett mindre antal av testföreningar. Analysen ger en enkel avläsning som är mindre kostnadseffektivt oöverkomliga än hög genomströmning sekvense eller microarray analys och lider inte av sekvens partiskhet. Medan protokollet som beskrivs kräver ett fjärrstyrt instrument för koloni manipulation, är sådana system blir mer prisvärd och växelvis protokollet kan justeras för att användas med manuella Postar verktyg, exempel på vilka har tagits med i förteckningen över material.

Det är viktigt att vara medveten om begränsningarna med denna metod och kemisk genetiska profiler i allmänhet. För det första måste föreningen ha en effekt på lönsamheten i spirande jäst, eller den specifika organismen utnyttjas. Medan många grundläggande biologiska processeroch funktioner är väl bevarade bland eukaryoter, kan organism specifika kemiska genetiska interaktioner varierar kraftigt, liksom upptaget av kemikalier i celler. Det bör också noteras att flera stammar radering har visat sig vara känsliga för flera läkemedelsbehandlingar 8. Dessa inkluderar gener involverade i läkemedelsflödes, vakuolär funktion, och membranintegritet. Det är viktigt att ta hänsyn till multiläkemedelsresistens när du gör slutsatser avseende direkta och indirekta verkningssätt.

Skärmen som beskrivs här utfördes med hjälp av haploida radering samling, en gemensam strategi för kemisk-genetisk analys i jäst. Det finns nu flera samlingar av jästmutanter tillgängliga för ytterligare stöd vid fastställande av en kemisk förening verkningsmekanism. Detta omfattar inte bara den fullständiga homozygot och heterozygot diploida radering samlingar, men också villkortemperaturkänsliga väsentliga mutanter gen, den Decrévisar därmed Överflöd av mRNA Perturbation (DAMP) jäst mutant bibliotek och en syntetisk histon H3 och H4 mutant samling, som skulle kunna användas för att undersöka epigenetiska baserade molekylära terapier 3,4,28, Med tanke på den otroliga djupet av de verktyg som finns, hur lätt metodiken, och den begränsade infrastruktur som krävs, ger detta tillvägagångssätt ett tillgängligt format för att få tillgång rika funktionell information med avseende på mekanismen av en kemisk förening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forskning i CJN labbet stöds av driftsbidrag från NSERC, den kanadensiska Cancerfonden Research Institute (CCSRI), och den kanadensiska Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10, (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics