Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Fastställande av verkningsmekanism av bioaktiva kemikalier är av intresse för ett brett spektrum av akademiska, läkemedels- och industriforskare. Saccharomyces cerevisiae, eller spirande jäst, är en modell eukaryot för vilken en komplett samling av ~ 6000 gen deletionsmutanter och hypomorphic väsentliga gen mutanter är kommersiellt tillgängliga. Dessa samlingar av mutanter kan användas för att systematiskt upptäcka kemiska-gen interaktioner, dvs gener som är nödvändiga för att tolerera en kemikalie. Denna information, i sin tur, rapporter om den troliga verkningsmekanism föreningen. Här beskriver vi ett protokoll för snabb identifiering av kemiska-genetiska interaktioner i knoppande jäst. Vi demonstrerar den metod som använder det kemoterapeutiska medlet 5-fluoruracil (5-FU), som har en väl definierad verkningsmekanism. Våra resultat visar att den nukleära TRAMP RNA Exosome och DNA-reparationsenzymer behövs för proliferation i närvaro av 5-FU, vilket överensstämmer med tidigare microarray baserade streckkodning kemiska genetiska metoder och den kunskap som 5-FU påverkar både RNA och DNA metabolism negativt. De erforderliga valideringsprotokoll för dessa hög genomströmning skärmar beskrivs också.
De genetiska verktyg och resurser som finns tillgängliga i modellen organismen Saccharomyces cerevisiae har möjlig storskaliga funktionell genomik studier som kollektivt ger ny insikt i hur gener fungerar som nätverk för att uppfylla kraven i biologiska system. Hörnstenen i dessa verktyg var samarbets skapa en komplett uppsättning av icke väsentliga gen deletioner av alla öppna läsramar i jäst 1,2. Ett slående observation var att endast ~ 20% av jästgener krävs för lönsamhet när den odlas som haploider under standardlaboratorieförhållanden. Detta belyser förmågan hos en cell att buffra mot iska störningar genom utnyttjande av alternativa biologiska vägar. Genetiska mutanter som är livskraftiga individuellt, men dödlig i kombination, signal anslutna eller konvergerande parallella biologiska vägar och bilda genetiska interaktionsnätverk som beskriver biologisk funktion. Med utvecklingen av villkor temperature-känsliga och hypomorphic alleler av essentiella gener tekniken inte har begränsats till studiet av icke-väsentliga gener 3,4. Detta koncept har tillämpats på genomisk skala producera en opartisk genetisk interaktion karta som visar hur gener involverade i liknande cellulära processer kluster tillsammans 5.
Kemiska störningar av genetiska nätverk härma gen strykningar (Figur 1) 6. Ställa frågor tillväxthämmande föreningar mot en hög densitet rad radering stammar för överkänslighet identifierar en kemisk-genetisk interaktion profil, dvs en lista med gener som krävs för att tåla kemisk påfrestning. Liksom genetiska interaktioner, har storskaliga skärmar av kemiska bibliotek visade att föreningar med en liknande verkningsmekanism kluster tillsammans 7. Därför, genom inrättandet av kemikalie genetiska interaktionsprofilen för en förening i verkningsmekanism kan härledas genom att jämföra den med larGE-skalan syntetiska genetiska och kemisk genetisk interaktion Dataset 8,9.
Storskaliga kemiska-genetiska skärmar, där mängder av föreningar förhördes, har utförts av streckkod konkurrensanalyser. I detta tillvägagångssätt är den poolade samling av radering stammar odlas en masse för flera generationer i en liten volym av media som innehåller en kemikalie. Eftersom varje deletionsmutant hyser en unik genetisk streckkod, är lönsamheten / tillväxt av individuella mutanter inom pool av radering stammar spåras av microarray eller hög genomströmning sekvense 10.
Att utgå fitness genom att övervaka koloni storlek fysiskt klädd mutanter odlas på fast agar innehåller en bioaktiv förening är också en effektiv metod för att identifiera kemisk-genetiska interaktioner 11,12. Denna metod ger ett kostnadseffektivt alternativ till konkurrensbaserad screening och är väl lämpad för att analysera små bibliotek av kemikalier.Skiss här är en enkel metod för att producera en lista med kemisk-genetiska interaktioner i S. cerevisiae som inte förlitar sig på molekylärbiologiska manipulationer eller infrastruktur. Det kräver bara en jäst radering samling, en robot eller manuell fastlåsning apparat, och fritt tillgänglig bildanalys mjukvara.
Beskrivs här är en metod för att generera kemisk-genetiska interaktionsprofiler. Metoden är enkel: genom att jämföra koloni storlekar av varje stam i omfattande gendeletion samlingar i närvaro och frånvaro av en kemikalie, är alla gener som behövs för att tolerera en kemisk förolämpning identifierad. Notering anrikning analys av den resulterande listan över känsliga stammar kan sedan användas för att ge en inblick i en kemikalie verkningsmekanism. Även om detta protokoll har optimerats för blivande j?…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i CJN labbet stöds av driftsbidrag från NSERC, den kanadensiska Cancerfonden Research Institute (CCSRI), och den kanadensiska Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
Alternative Pinning Tools: | |||
Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |