Bioconjugation और के Radiosynthesis

Chemistry

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Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

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Abstract

एंटीबॉडी के असाधारण आत्मीयता, विशिष्टता, और चयनात्मकता उन्हें ट्यूमर लक्षित पीईटी radiopharmaceuticals के लिए असाधारण आकर्षक वैक्टर बनाते हैं। कारण उनके बहु दिन जैविक आधा जीवन के लिए, एंटीबॉडी अपेक्षाकृत लंबे शारीरिक क्षय आधा जीवन के साथ पोजीट्रान उत्सर्जन रेडिओन्युक्लिआइड साथ लेबल किया जाना चाहिए। परंपरागत रूप से, पोजीट्रान उत्सर्जन आइसोटोप 124 मैं (टी 1/2 = 4.18 डी), 86 वाई (टी 1/2 = 14.7 मानव संसाधन), और 64 घन मीटर (टी 1/2 = 12.7 एचआर) के लिए एंटीबॉडी लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है पीईटी इमेजिंग। हाल ही में, हालांकि, क्षेत्र प्रतिरक्षी आधारित पीईटी इमेजिंग एजेंट पोजीट्रान उत्सर्जन radiometal 89 Zr के उपयोग में एक नाटकीय वृद्धि देखी गई है। यह एक भौतिक आधा पास के रूप में 89 ZR, immunoconjugates साथ पीईटी इमेजिंग के लिए लगभग एक आदर्श रेडियो आइसोटोप है एंटीबॉडी के vivo फार्माकोकाइनेटिक्स साथ संगत है और एक अपेक्षाकृत कम ईन उत्सर्जन करता है कि -life (टी 1/2 = 78.4 घंटा)उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन है कि rgy पोजीट्रान। इसके अलावा, एंटीबॉडी straightforwardly siderophore व्युत्पन्न chelator desferrioxamine (डीएफओ) का उपयोग कर 89 Zr के साथ लेबल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन झिल्ली को लक्षित एंटीबॉडी J591 वर्णन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा (1) एक एंटीबॉडी, (2) radiosynthesis और एक 89 Zr- की शुद्धि के लिए-आइसोथियोसाइनेट डीएफओ bifunctional chelator के bioconjugation कैंसर का एक murine मॉडल में एक 89 ZR-डीएफओ-mAb radioimmunoconjugate साथ डीएफओ-mAb radioimmunoconjugate, और (3) में विवो पीईटी इमेजिंग।

Introduction

कारण उनके उल्लेखनीय संवेदनशीलता, आत्मीयता, और चयनात्मकता के लिए, एंटीबॉडी लंबे समय से कैंसर की कोशिकाओं को radioisotopes की डिलीवरी के लिए होनहार वैक्टर विचार किया गया है। हालांकि, पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग में अपने आवेदन पत्र उनके लेबलिंग के लिए एक उपयुक्त पोजीट्रान उत्सर्जन रेडियो आइसोटोप की कमी के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। Radioimmunoconjugates के डिजाइन में सबसे महत्वपूर्ण कारणों में से 1-3 एक भौतिक क्षय मेल खाता है आधा एंटीबॉडी के vivo फार्माकोकाइनेटिक्स करने के लिए रेडियो आइसोटोप का जीवन। अधिक विशेष रूप से, एंटीबॉडी अक्सर अपेक्षाकृत लंबे, बहु-दिन जैविक आधा जीवन है और इसलिए तुलनीय शारीरिक आधा जीवन के साथ radioisotopes के साथ लेबल किया जाना चाहिए। पीईटी इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, एंटीबॉडी परंपरागत रूप से 64 घन मीटर (टी 1/2 = 12.7 मानव संसाधन), 86 वाई (टी 1/2 = 14.7 घंटा), या 124 मैं (टी 1/2 = 4.18 घ)। 4 के साथ radiolabeled किया गया है, 5 हालांकि, प्रत्येक कीइन radioisotopes नैदानिक ​​इमेजिंग के लिए उनकी उपयुक्तता आसानी और क्षमता है कि महत्वपूर्ण सीमाओं के पास। 86 वाई और 64 घन मीटर के साथ लेबल radioimmunoconjugates पूर्व नैदानिक ​​जांच में होनहार सिद्ध कर दिया है, वहीं दोनों आइसोटोप मनुष्यों में इमेजिंग के लिए प्रभावी होने के लिए बहुत कम कर रहे हैं कि शारीरिक आधा जीवन के पास है। 124 मैं, इसके विपरीत, के लिए लगभग एक आदर्श शारीरिक आधा जीवन है एंटीबॉडी के साथ इमेजिंग, लेकिन यह महंगा है और अपेक्षाकृत कम संकल्प नैदानिक ​​छवियों के लिए नेतृत्व कि उपअनुकूलित क्षय लक्षण है। इसके अलावा, 124 मैं लेबल radioimmunoconjugates, vivo में ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि गतिविधि अनुपात कम कर सकते हैं एक प्रक्रिया है जो dehalogenation के अधीन किया जा सकता है। 6,7

ड्राइव 64 घन मीटर, 86 वाई उखाड़ना एक पोजीट्रान उत्सर्जन रेडियो आइसोटोप को खोजने के लिए, और radioimmunoconjugates में 124 मैं 89 ZR-लेबल वाले एंटीबॉडी पर अनुसंधान के क्षेत्र में हाल ही में वृद्धि ईंधन है। 8-12 टी89 Zr के आगमन के लिए वह कारण सरल है: radiometal नैदानिक ​​पीईटी radioimmunoconjugates में उपयोग के लिए पास-आदर्श रासायनिक और भौतिक गुणों के पास 13 89 Zr 89 वाई (पी, एन) एक का उपयोग कर एक साइक्लोट्रॉन पर 89 Zr प्रतिक्रिया के माध्यम से उत्पादन किया है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और 100% प्राकृतिक रूप से प्रचुर मात्रा में 89 वाई लक्ष्य। 14,15 radiometal, 23% की एक पोजीट्रान उपज है 78.4 घंटा की एक आधा जीवन के साथ decays, और 395.5 कीव (चित्रा 1) के अपेक्षाकृत कम ऊर्जा के साथ positrons उत्सर्जन करता है। 13,16,17 यह 89 Zr भी एक उच्च ऊर्जा का उत्सर्जन करता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है, 909 कीव γ-रे 99% दक्षता के साथ। इस उत्सर्जन उत्सर्जित 511 कीव फोटॉनों साथ उर्जा हस्तक्षेप नहीं करता है, यह परिवहन, हैंडलिंग, और dosimetry के संबंध में अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इस चेतावनी के बावजूद, इन क्षय विशेषताओं अंततः 89 Zr एक और अधिक अनुकूल ज है कि न केवल मतलबघन 86 वाई और 64 से एंटीबॉडी के साथ इमेजिंग के लिए Alf-जीवन, लेकिन यह भी उच्च 687 और 975 कीव की ऊर्जा के रूप में अच्छी तरह से की 100-150 कीव के भीतर ऊर्जा के साथ फोटॉनों की संख्या के साथ positrons का उत्सर्जन करता है, जो 124 की तुलना में मैं उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन कर सकते हैं 511 कीव पोजीट्रान बनाया फोटॉनों। 13 इसके अलावा, 89 Zr अपने रेडियोआयोडीन समकक्ष से अधिक प्रभावी ढंग से भी ट्यूमर में, संभाल करने के लिए सुरक्षित करने के लिए उत्पादन कम खर्चीला है, और residualizes है। 89 Zr की 18,19 एक संभावित सीमा है कि यह जरूरी नहीं है कि है एक चिकित्सकीय isotopologue, उदाहरण के लिए, 86 वाई (पीईटी) बनाम 90 वाई (चिकित्सा)। यह उनकी चिकित्सीय समकक्षों के लिए dosimetric स्काउट्स के रूप में नियोजित किया जा सकता है कि रासायनिक समान, सरोगेट इमेजिंग एजेंट का निर्माण precludes। उस ने कहा, जांच में 89 ZR-लेबल वाले एंटीबॉडी 90 वाई और 177 लू लेबल immunoconjugates के लिए इमेजिंग surrogates के रूप में संभावित है कि क्या सलाह देते हैं।20,21

एक रासायनिक दृष्टि से, एक समूह चतुर्थ धातु के रूप में, 89 Zr जलीय घोल में एक चार केशन के रूप में मौजूद है। Zr 4 + आयन अत्यधिक, अपेक्षाकृत बड़े (प्रभावी आयनिक त्रिज्या = 0.84 ए) का आरोप लगाया है, और एक "" मुश्किल केशन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। जैसे, यह आठ मुश्किल है, ऋणात्मक ऑक्सीजन दाताओं के लिए ऊपर असर ligands के लिए एक प्राथमिकता दर्शाती है। आसानी से 89 ZR-लेबल किया radioimmunoconjugates में सबसे आम उपयोग chelator desferrioxamine है (डीएफओ), तीन hydroxamate समूहों असर एक siderophore व्युत्पन्न, अचक्रीय chelator। ligand के stably जैविक रूप से प्रासंगिक पीएच स्तर पर आरटी पर जल्दी और सफाई Zr 4 + कटियन निर्देशांक, और जिसके परिणामस्वरूप ZR-डीएफओ जटिल खारा, रक्त सीरम में कई दिनों के पाठ्यक्रम पर स्थिर बनी हुई है, और पूरे रक्त। 22 कम्प्यूटेशनल पढ़ाई दृढ़ता से सुझाव डीएफओ धातु केंद्र तीन neut करने के लिए समन्वित है जिसमें Zr 4 + के साथ एक hexacoordinate जटिल है कि रूपोंRAL और ligand के तीन ऋणात्मक ऑक्सीजन दाताओं के साथ ही दो बहिर्जात पानी ligands (चित्रा 2)। 23,24 89 ZR-डीएफओ संयुग्मन पाड़ रोजगार radioimmunoconjugates के vivo व्यवहार आम तौर पर उत्कृष्ट रहा है। हालांकि, कुछ मामलों में, इमेजिंग और तीव्र biodistribution पढ़ाई 89 ZR-लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ इंजेक्शन चूहों की हड्डियों में ऊंचा गतिविधि का स्तर, Zr 4 + कटियन बाद में vivo में chelator से जारी किया जाता है और 89 osteophilic mineralizes कि पता चलता है कि डेटा से पता चला है हड्डी में। आठ ऑक्सीजन दाताओं साहित्य में दिखाई दिया है साथ 25 हाल ही में, उपन्यास 89 Zr 4 + chelators के विकास में जांच की एक संख्या विशेष रूप से, वर्तमान में, फिर भी 24,26,27। ligands डीएफओ सबसे व्यापक रूप से कार्यरत chelator है 89 में एक व्यापक मार्जिन द्वारा radioimmunoconjugates ZR-लेबल। अलग से एक किस्मbioconjugation रणनीतियों bioorthogonal क्लिक रसायन विज्ञान, एंटीबॉडी में cysteines साथ constructs thiol प्रतिक्रियाशील डीएफओ की क्या प्रतिक्रिया है, और एस्टर असर डीएफओ एंटीबॉडी में lysines साथ constructs सक्रिय की प्रतिक्रिया सहित, एंटीबॉडी के लिए डीएफओ संलग्न करने के लिए नियोजित किया गया है। 4,28- 30 आसानी से सबसे आम रणनीति, हालांकि, 22 विवेकशीलतापूर्वक यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध bifunctional chelator। डीएफओ, डीएफओ-NCS के एक आइसोथियोसाइनेट असर व्युत्पन्न का उपयोग (चित्रा 2) दिया गया है और मज़बूती से lysines के साथ स्थिर, सहसंयोजक Thiourea लिंकेज रूपों गया है एंटीबॉडी (चित्रा 3)।

पिछले कुछ वर्षों में, 89 ZR-डीएफओ लेबल radioimmunoconjugates की एक विस्तृत विविधता साहित्य में सूचना दी गई है। पूर्व नैदानिक ​​जांच ऐसे CD105-लक्ष्य टी के रूप में सेटुक्सीमब, bevacizumab, और त्रास्तुज़ुमाब अधिक गूढ़ एंटीबॉडी के लिए और अधिक अच्छी तरह से जाना जाता है, से लेकर एंटीबॉडी की विशेषता है, विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में कर दिया गया हैRC105 और 5A10 fPSA-लक्ष्य। 30-36 हाल ही में, 89 ZR-डीएफओ लेबल एंटीबॉडी का उपयोग जल्दी चरण नैदानिक ​​परीक्षणों की एक छोटी संख्या साहित्य में उभरा है। 89 ZR-डीएफओ-cmAb U36, 89 ZR-डीएफओ-ibritumomab tiuxetan, और 89 ZR-डीएफओ-त्रास्तुज़ुमाब। 21,32,37 इसके अलावा, 89 के साथ अन्य नैदानिक ​​परीक्षणों की एक श्रृंखला को रोजगार विशेष रूप से, नीदरलैंड में समूहों को प्रकाशित किया है परीक्षणों ZR-लेबल किया radioimmunoconjugates प्रोस्टेट कैंसर इमेजिंग के लिए PSMA-लक्ष्य 89 ZR-डीएफओ-J591 और स्तन कैंसर इमेजिंग के लिए HER2-लक्ष्य 89 ZR-डीएफओ-त्रास्तुज़ुमाब का उपयोग कर मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर में यहां जांच सहित, वर्तमान में चल रहे हैं। 23 radiolabeled एंटीबॉडी सबसे आम 89 ZR-लेबल किया radiopharmaceuticals रहते हैं, जबकि इसके अलावा 30, radiometal भी तेजी से पेप्टाइड्स, प्रोटीन, और nanomaterials सहित अन्य वैक्टर, साथ नियोजित किया गया है। 38-43

इस 89 ZR-डीएफओ लेबलिंग कार्यप्रणाली की प्रतिरूपकता एक जबरदस्त परिसंपत्ति है। बायोमार्कर-लक्ष्य एंटीबॉडी के प्रदर्शनों की सूची कभी विस्तार, और इन निर्माणों का उपयोग vivo पीईटी इमेजिंग में प्रदर्शन में ब्याज शीघ्रता से बढ़ रही है। एक परिणाम के रूप में, हम और अधिक मानकीकृत प्रथाओं और प्रोटोकॉल के विकास के क्षेत्र फायदा हो सकता है कि विश्वास करते हैं। डीएफओ-NCS विकार और 89 Zr radiolabeling के लिए एक उत्कृष्ट लिखा प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पहले से ही Vosjan द्वारा प्रकाशित किया गया है, एट अल। 22 हम इस काम के द्वारा प्रदान की जाने वाली दृश्य प्रदर्शन आगे इन तकनीकों के लिए नए जांचकर्ताओं की मदद कर सकता है कि लग रहा है। हाथ में प्रोटोकॉल में, प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन झिल्ली को लक्षित एंटीबॉडी J591 वर्णन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा (1) एक एंटीबॉडी के लिए डीएफओ-आइसोथियोसाइनेट bifunctional chelator के bioconjugation, 89 (2) के radiosynthesis और शुद्धि ZR-डीएफओ-mAb radioimmunoconjugate,और (3) में कैंसर का एक murine मॉडल में एक 89 ZR-डीएफओ-mAb radioimmunoconjugate साथ विवो पीईटी इमेजिंग। 23,44,45

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Protocol

वर्णित vivo में पशु प्रयोगों के सब एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के लिए और मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के नैतिक दिशा निर्देशों के तहत अनुसार प्रदर्शन किया गया।

J591 के लिए डीएफओ-NCS के 1. संयुग्मन

  1. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, 1x फॉस्फेट बफर खारा (7.4 पीएच) या 0.5 एम HEPES बफर (7.4 पीएच) या तो एक मिलीलीटर में J591 के 2-5 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है।
  2. 5-10 मिमी (3.8-7.6 मिलीग्राम / एमएल) के बीच एक एकाग्रता में शुष्क DMSO में डीएफओ-NCS भंग। Sonicate या भंवर पूरा विघटन की सुविधा के लिए आदेश में अच्छी तरह से समाधान।
  3. छोटे aliquots 0.1 एम ना 2 की (<10 μl) कं 3 जोड़कर 8.8-9.0 को J591 समाधान के पीएच को समायोजित करें।
  4. एंटीबॉडी समाधान सही पीएच पर है एक बार, bifunctional chelator के 3-4 गुना दाढ़ अतिरिक्त करने के लिए इसी डीएफओ-NCS समाधान की एक मात्रा जोड़ें।
    1. परीक्षा के लिएमिसाल, एक 2 मिलीग्राम / एमएल J591 एंटीबॉडी समाधान के 1 मिलीलीटर (13.3 nmol J591) के लिए एक 10 मिमी (7.6 मिलीग्राम / एमएल) डीएफओ-NCS समाधान (40.4 nmol डीएफओ-NCS) के 4-5 μl जोड़ें। अंतिम जलीय प्रतिक्रिया मिश्रण में DMSO के राशि 2% वी / वी अधिक नहीं होनी चाहिए।
  5. 350 rpm पर एक आंदोलनकारी हीटिंग ब्लॉक पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के बाद, eluent के रूप में 0.5 एम HEPES बफर (7.4 पीएच) का उपयोग कर एक 50,000 आणविक वजन कट ऑफ के साथ एक पूर्व पैक डिस्पोजेबल आकार अपवर्जन desalting स्तंभ का उपयोग जिसके परिणामस्वरूप immunoconjugate शुद्ध। यह चरण पूरा J591-डीएफओ निर्माण के 2 मिलीलीटर समाधान निकलेगा।
  7. एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर निर्माण J591-डीएफओ की एकाग्रता उपाय।
  8. निर्माण के एक उच्च एकाग्रता वांछित है, एक 50,000 आणविक वजन कट ऑफ के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग कर J591-डीएफओ समाधान ध्यान केंद्रित।
  9. अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर पूरा J591-डीएफओ immunoconjugate का समाधान स्टोर।

89 Zr साथ 2. Radiolabeling J591-डीएफओ

चेतावनी: प्रोटोकॉल के इस कदम से निपटने और रेडियोधर्मिता का हेरफेर शामिल है। इन चरणों का प्रदर्शन या उनके घर संस्था के विकिरण सुरक्षा विभाग के साथ परामर्श करना चाहिए रेडियोधर्मिता शोधकर्ताओं के साथ किसी अन्य काम के प्रदर्शन से पहले। सभी संभव कदम विकिरण के लिए जोखिम कम करने के लिए लिया जाना चाहिए।

नोट: उचित radiochemical नोट रखने के हित में, नमूने में रेडियोधर्मिता की मात्रा को एक खुराक अंशशोधक का उपयोग करके मापा और पहले दर्ज किया जाना चाहिए और नीचे प्रोटोकॉल में कदम 2.2-2.13 के बाद। इस radiochemical पैदावार और विशिष्ट गतिविधियों की सटीक दृढ़ संकल्प के साथ मदद मिलेगी।

  1. 0.5 एम HEPES बफर, पीएच 7.5 के 200 μl में J591-डीएफओ का 0.5-2.0 मिलीग्राम की एक समाधान तैयार है।
  2. की एक मात्रा पिपेट <एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक पेंच टोपी microcentrifuge ट्यूब में 1.0-6.0 एमसीआई (37-222 MBq) के लिए इसी (आमतौर पर 1.0 एम oxalic एसिड में आपूर्ति) समर्थन> 89 Zr 4 + शेयर समाधान। 1.0 एम oxalic एसिड का उपयोग करते हुए कुल 300 μl करने के लिए इस समाधान की मात्रा समायोजित करें।
  3. 1.0 एम ना 2 सीओ 3 का उपयोग 6.8-7.5 करने के लिए 89 Zr 4 + समाधान के पीएच को समायोजित करें। वांछित पीएच प्राप्त करने के लिए आधार की aliquots छोटे (<10 μl) जोड़ने के बाद में 89 Zr 4 + समाधान के लिए सीओ 3 1.0 एम ना 2 के 250 μl जोड़कर शुरू और।
  4. 2.1 कदम में तैयार J591-डीएफओ समाधान के लिए पीएच-समायोजित 89 Zr 4 + समाधान के वांछित राशि जोड़ें।
  5. यह 6.8-7.5 के वांछित सीमा के भीतर गिर जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए radiolabeling प्रतिक्रिया मिश्रण का पीएच की जाँच करें।
  6. 350 rpm पर एक आंदोलनकारी हीटिंग ब्लॉक पर आरटी पर 60 मिनट के लिए radiolabeling प्रतिक्रिया सेते हैं।
  7. ऊष्मायन के 60 मिनट के बाद, रेड मापनेरेडियो-टीएलसी का उपयोग कर प्रतिक्रिया की उपज iolabeling।
    1. यह अंत करने के लिए, एक सिलिका गर्भवती टीएलसी पट्टी पर radiolabeling प्रतिक्रिया मिश्रण का एक μCi हाजिर। 50 मिमी DTPA (5.5 पीएच) के एक eluent का उपयोग कर टीएलसी चलाने के लिए, विभाज्य सूखे की अनुमति दें और एक रेडियो-टीएलसी स्कैनर का उपयोग कर टीएलसी पट्टी का विश्लेषण। 89 Zr 4 + मूल में दिखाई देगा J591-डीएफओ का निर्माण करने के लिए बाध्य (आर <Zr 89 मुक्त 4 + फैटायनों DTPA द्वारा chelated किया जाएगा और विलायक फ्रंट (आर एफ के साथ elute होगा, जबकि 0.1),> 0.9) च।
    2. , Radiochromatogram को एकीकृत वक्र के अंतर्गत कुल क्षेत्र द्वारा 0.0-0.1 R से वक्र के तहत क्षेत्र को विभाजित है, और 100 से गुणा करके प्रतिक्रिया की radiolabeling उपज की गणना।
  8. Radiolabeling उपज पर्याप्त (आमतौर> 2 एमसीआई / मिलीग्राम की एक सैद्धांतिक विशिष्ट गतिविधि) है, तो 50 मिमी DTPA, पीएच 5.5 से 5 μl के साथ प्रतिक्रिया बुझा लेते हैं।
  9. जिसके परिणामस्वरूप immunoconjugate यूएसआई शुद्धएनजी 5 मिलीग्राम / एमएल gentisic एसिड के साथ 5 मिलीग्राम / एमएल gentisic एसिड या 0.25 एम सोडियम एसीटेट (5.5 पीएच) के साथ 0.9% बाँझ खारा या तो एक eluent का उपयोग कर एक 50,000 आणविक वजन कट ऑफ के साथ एक पूर्व पैक डिस्पोजेबल आकार अपवर्जन desalting स्तंभ । यह चरण पूरा कर 89 ZR-डीएफओ-J591 radioimmunoconjugate के 2 मिलीलीटर समाधान निकलेगा।
  10. कदम 2.7 में वर्णित के रूप में शुद्धिकरण के बाद, रेडियो-टीएलसी का उपयोग कर 89 ZR-डीएफओ-J591 के radiochemical शुद्धता को सत्यापित।
  11. शुरू में शुद्ध 89 ZR-डीएफओ-J591 radioimmunoconjugate के साथ अलग रेडियोधर्मिता की मात्रा से एंटीबॉडी समाधान के लिए जोड़ा गतिविधि की राशि को विभाजित करके प्रतिक्रिया के समग्र radiolabeling उपज की गणना।
  12. Radiolabeling प्रतिक्रिया में डीएफओ-J591 के प्रारंभिक जन द्वारा शुद्ध 89 ZR-डीएफओ-J591 radioimmunoconjugate के साथ अलग गतिविधि की राशि को विभाजित करके अंतिम विशिष्ट गतिविधि की गणना।
  13. एक उच्च एकाग्रता वांछित है, वें ध्यान केंद्रितई 89 एक 50,000 आणविक वजन कट ऑफ के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग कर ZR-डीएफओ-J591 समाधान।
    नोट: अंतिम शुद्धि कदम में इस्तेमाल किया gentisic एसिड की वजह से radiolysis के लिए एंटीबॉडी की गिरावट को कम करने के लिए नियोजित एक रेडियो-protectant है 46 जबकि 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 89 ZR-डीएफओ-J591 radioimmunoconjugate का भंडारण। संभव है, यह अनुशंसित नहीं है। Radioimmunoconjugate संग्रहित किया जा रहा है, हाइपोक्लोराइट की मध्यस्थता radiolysis के जोखिम को कम करने के लिए भंडारण बफर के रूप में 5 मिलीग्राम / एमएल gentisic एसिड के साथ 0.25 एम सोडियम एसीटेट (5.5 पीएच) का उपयोग करें। 47

89 ZR-डीएफओ-J591 के साथ vivo पीईटी इमेजिंग में 3.

चेतावनी: प्रोटोकॉल की धारा 2 के रूप में, प्रोटोकॉल के इस कदम से निपटने और रेडियोधर्मिता का हेरफेर शामिल है। इन चरणों का प्रदर्शन से पहले शोधकर्ताओं ने उनके घर संस्था के विकिरण सुरक्षा विभाग के साथ परामर्श करना चाहिए। सभी possibLe चरणों विकिरण के लिए जोखिम कम करने के लिए लिया जाना चाहिए।

  1. पुरुष athymic नग्न चूहों, subcutaneously 5 एक्स 10 6 LNCaP प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और इन (3-4 सप्ताह टीका के बाद) एक 100-150 मिमी 3 xenograft को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। 44 में
  2. 0.9% बाँझ खारा में 1.0 एमसीआई / एमएल के एक एकाग्रता के लिए 89 ZR-डीएफओ-J591 radioimmunoconjugate पतला।
  3. 89 ZR-डीएफओ-J591 समाधान (200 μCi; 7.4 MBq) के 200 μl इंजेक्षन। Xenograft असर चूहों के पार्श्व पूंछ नस में 48
  4. वांछित इमेजिंग समय बिंदु पर (जैसे, 12, 24, 48, 72, 96, या 120 घंटा बाद इंजेक्शन), एक दो isoflurane% के साथ माउस anesthetize: ऑक्सीजन गैस मिश्रण।
  5. छोटे जानवर पीईटी स्कैनर के बिस्तर पर माउस प्लेस, और एक एक isoflurane% का उपयोग कर स्कैन के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखने: ऑक्सीजन गैस मिश्रण। स्कैनर बिस्तर पर पशु रखने से पहले, पैर के अंगूठे चुटकी विधि और Appl का उपयोग कर संज्ञाहरण सत्यापितसंज्ञाहरण के दौरान सुखाने को रोकने के लिए माउस की आँखों को y नेत्र मरहम। 49
  6. 350-700 कीव के एक ऊर्जा खिड़की और 6 NSEC की एक संयोग समय खिड़की का उपयोग कर 40 लाख संपाती घटनाओं की एक न्यूनतम के साथ एक स्थिर स्कैन के माध्यम से माउस के लिए पीईटी डेटा मोल। 50
  7. छवि का अधिग्रहण पूरा करने के बाद, नायाब माउस छोड़ नहीं है और इसे होश आ गया है जब तक अन्य चूहों के साथ एक पिंजरे में जगह नहीं है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल एंटीबॉडी के लिए डीएफओ-NCS के विकार में पहला कदम आम तौर पर काफी मजबूत और विश्वसनीय है। आम तौर पर, शुद्ध, chelator संशोधित immunoconjugate> 90% उपज में प्राप्त किया जा सकता है, और प्रारंभिक संयुग्मन प्रतिक्रिया में डीएफओ-NCS के तीन दाढ़ समकक्ष का उपयोग कर एक डिग्री के-लेबलिंग लगभग 1.0-1.5 की chelator डीएफओ का निकलेगा / mAb। प्रक्रिया का 89 Zr radiolabeling और शुद्धि चरणों इसी तरह सीधा कर रहे हैं। ऊपर प्रोटोकॉल में उल्लिखित सांद्रता,> 80% की radiolabeling पैदावार और> 2.0 एमसीआई / मिलीग्राम की इस प्रकार विशिष्ट गतिविधियों पर आरटी पर 60 मिनट के बाद विशिष्ट हैं। कच्चे तेल की radiolabeling मिश्रण का रेडियो-टीएलसी वर्णलेख संभावना विलायक फ्रंट (चित्रा -4 ए) में elutes कि कुछ DTPA बाध्य 89 Zr 4 + खोलेगा। हालांकि, radioc DTPA साथ प्रतिक्रिया शमन और 89 ZR-डीएफओ-mAb आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से निर्माण सफ़ाई के बादशुद्ध, पृथक 89 ZR-डीएफओ-mAb एकत्रित की hemical पवित्रता> 95% (4B चित्रा) होना चाहिए। पृथक 89 ZR-डीएफओ-mAb एकत्रित की radiochemical पवित्रता 95% से कम है कि घटना में, शोधन प्रक्रिया से पहले किसी भी इन विट्रो प्रदर्शन करने के लिए या विवो प्रयोगों में दोहराया जाना चाहिए।

Vivo में प्रयोगों के लिए आगे बढ़ते, प्रोटोकॉल में athymic नग्न चूहों PSMA व्यक्त, LNCaP प्रोस्टेट कैंसर xenografts 89 ZR-डीएफओ-J591 के vivo व्यवहार की जांच के लिए कार्यरत थे असर, ऊपर वर्णित है। तीव्र biodistribution और पीईटी इमेजिंग प्रयोगों दोनों 89 ZR-डीएफओ-J591 स्पष्ट रूप से उत्कृष्ट छवि के विपरीत और उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि गतिविधि अनुपात (चित्रा 5) के साथ प्रोस्टेट कैंसर xenografts रूपरेखा बनाती है कि पता चला। ट्यूमर में radioimmunoconjugate के तेज जल्दी 24 घंटा (5.6% आईडी / जी ± 20.9%), और गतिविधि के रूप में के रूप में स्पष्ट है96 घंटा के बाद इंजेक्शन में 5.3% आईडी / जी ± 57.5% की एक अधिकतम करने के लिए ट्यूमर बढ़ता में एकाग्रता। Radioimmunoconjugates के लिए विशिष्ट है के रूप में, radiotracer की एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता से अधिक रक्त में रेडियोधर्मिता की मात्रा में एक धीमी गति से कमी के बाद जल्दी समय अंक (9.1% 24 घंटा में ± 5.3% आईडी / छ), कम से रक्त में मौजूद है प्रयोग के पाठ्यक्रम। उच्चतम गतिविधि एकाग्रता के साथ गैर लक्ष्य ऊतक संभवतः osteophilic कटियन 89 Zr 4+ के vivo रिहाई का एक परिणाम के रूप में, प्रयोग के दौरान 10% आईडी / जी के आसपास तेज मूल्यों प्रदर्शित जो हड्डी था। दिल, फेफड़े, जिगर, तिल्ली, पेट, बड़ी और छोटी आंत, गुर्दे, और अपेक्षाकृत कम गतिविधि सांद्रता प्रदर्शित मांसपेशी, अक्सर अच्छी तरह से नीचे 5% आईडी / जी सहित अन्य सभी अंगों। एक नियंत्रण के रूप में, चूहों की एक अतिरिक्त पलटन प्रतिजन तर और इस तरह चयनात्मक अवरुद्ध उदाहरण देकर स्पष्ट करने के क्रम में सह इंजेक्शन 300 माइक्रोग्राम प्रति लेबल हटाया गया डीएफओ-J591 इंजेक्शन थे। Criti बड़ी सफाई, अवरुद्ध प्रयोग स्पष्ट रूप से 89 ZR-डीएफओ-J591 चुनिंदा अपने लक्ष्यों का संकेत है कि, 72 घंटा के बाद इंजेक्शन पर 11.1% आईडी / जी ± 23.5% से 9.3% आईडी / जी ± 48.9% से ट्यूमर में radioimmunoconjugate के तेज उतारा प्रतिजन।

चित्र 1
चित्रा 1. (ए) एक सरलीकृत क्षय योजना और (बी) के 89 में से कुछ मुख्य क्षय विशेषताओं Zr 13,16,17 आईटी समाजिक संक्रमण =। चुनाव आयोग = इलेक्ट्रॉन कब्जा। संशोधित और एट अल Deri, से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। न्यूक्लियर मेडिसिन और जीवविज्ञान। 40, 3-14 (2013)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2 (ए) लाल रंग का समन्वय ऑक्सीजन परमाणुओं के साथ डीएफओ-NCS के संरचना; (बी) ZR-डीएफओ समन्वय परिसर का एक एफ टी-व्युत्पन्न संरचना। संशोधित और एट अल Deri, से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। औषधीय रसायन विज्ञान के जर्नल। 57, 4849-4860 (2014)। कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन

89 ZR-डीएफओ-J591 के bioconjugation और radiolabeling चित्रा 3. योजना।एट = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
89 ZR-डीएफओ-J591 के कच्चे radiolabeling मिश्रण (ए) और शुद्ध उत्पाद (बी) के चित्रा 4. प्रतिनिधि रेडियो-टीएलसी chromatograms। रेडियो-TLCs 50 मिमी DTPA, पीएच 5.0 की एक eluent का उपयोग कर सिलिका स्ट्रिप्स पर चलाए जा रहे थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
89 ZR-डीएफओ-J591 चित्रा 5. कोरोनल पीईटी छवियों (11.1-12.9 MBq [300-345 μCi] 200 μl 0.9% बाँझ खारा में पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्शन) चमड़े के नीचे असर athymic नग्न चूहों में, PSMA व्यक्त24 और 120 घंटे के बाद इंजेक्शन के बीच LNCaP प्रोस्टेट कैंसर xenografts (सफेद तीर)। संशोधित और, एट अल Zeglis से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। Bioconjugate रसायन विज्ञान। 24, 1057-1067 (2013)। कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

निर्माण, radiolabeling, और इमेजिंग 89 की ZR-डीएफओ-चिट्ठा radioimmunoconjugates एक नहीं बल्कि सीधा प्रक्रिया आम तौर पर है, यह प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के दौरान मन में कुछ महत्वपूर्ण बातों को रखने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, शायद प्रक्रिया का संयुग्मन कदम के दौरान चिंता का सबसे संभावित कारण संयुग्मन प्रतिक्रिया के दौरान एंटीबॉडी का एकत्रीकरण है। यह समस्या सबसे अधिक बार डीएफओ-NCS शेयर समाधान के बाद इसके अलावा संयुग्मन प्रतिक्रिया के गरीब मिश्रण का एक उत्पाद है। जब ऐसा होता है, डीएफओ-NCS के गैर समरूप वितरण के साथ स्थानीय प्रतिक्रिया की जरूरत से ज्यादा उच्च स्तर के कारण हो सकता है 22 बदले में एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो एंटीबॉडी। यह समस्या अपेक्षाकृत आसानी से एक temperatur पर प्रतिक्रिया मिश्रण को अच्छी तरह से डीएफओ-NCS के बाद इसके अलावा प्रतिक्रिया मिश्रण मिश्रण, (<5 μl) छोटे aliquots में डीएफओ-NCS शेयर समाधान जोड़ने, और आंदोलनकारी ने उन्हें धोखा दिया जा सकता हैई-नियंत्रित प्रकार के बरतन। इसके अलावा, डीएफओ-mAb निर्माण के विकार और शुद्धि के बाद, यह ठीक प्रत्येक mAb संयुग्मित डीएफओ की संख्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एंटीबॉडी प्रति डीएफओ से chelates की संख्या से भरा लक्षण वर्णन हॉलैंड द्वारा प्रदर्शन उन लोगों के समान radiometric समस्थानिक कमजोर पड़ने प्रयोगों का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, एट अल। और एंडरसन, एट अल।, MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री है, हालांकि एक व्यवहार्य विकल्प। 14,23 , radiolabeling चरण के दौरान 30,51,52, आसानी से सबसे आम समस्या कम उम्मीद से radiolabeling पैदावार है। अप्रत्याशित रूप से कम पैदावार परिश्रम से ऊपर प्रोटोकॉल के बाद बावजूद होते हैं, तीन अलग अलग समस्या निवारण रणनीतियों उपलब्ध हैं: (1) समय की लंबी राशि के लिए radiolabeling प्रतिक्रिया incubating (जैसे, 2-3 घंटा); (2) प्रतिरक्षी के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग कर radiolabeling प्रतिक्रिया दोहरा; या (3) वें के एक उच्च दाढ़ अतिरिक्त का उपयोग करते हुए प्रारंभिक डीएफओ-NCS संयुग्मन प्रतिक्रिया दोहराई bifunctional chelator।

डीएफओ-NCS संयुग्मन सतही और मजबूत होती है, वहीं इसकी नकारा नहीं जा सकता कमजोरियों में से एक यह साइट विशेष नहीं है: डीएफओ-NCS की परवाह किए बिना अपनी स्थिति के एंटीबॉडी में उपलब्ध lysines साथ Thiourea लिंकेज रूपों। नतीजतन, यह chelators जिससे प्रतिकूल 89 ZR-डीएफओ लेबल एकत्रित की immunoreactivity को प्रभावित करने, एंटीबॉडी के प्रतिजन बाध्यकारी क्षेत्र से संलग्न हो सकता है कि संभव है। इसलिए, एक अच्छा संतुलन 89 ZR-लेबल किया radioimmunoconjugates के निर्माण में मारा जाना चाहिए: एंटीबॉडी प्रति chelators की अधिक संख्या उच्च विशिष्ट गतिविधियों की सुविधा है, लेकिन लेबलिंग के उच्च डिग्री भी निर्माण के immunoreactivity कोई समझौता के जोखिम को बढ़ा सकते हैं। अंत में, लक्ष्य सरल है: immunoreactivity समझौता किए बिना आवश्यक के रूप में के रूप में कई chelators देते हैं। शुद्ध 89 ZR-डीएफओ-mAb radioimmunoconjugate प्राप्त करने के बाद, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है vivo में प्रयोग करने से पहले निर्माण के लिए इन विट्रो immunoreactivity। यह अंत करने के लिए, हम Lindmo द्वारा प्रकाशित इन विट्रो तरीकों का उपयोग करने की सलाह देते निर्माण के immunoreactivity से कम 80-90% है, एट अल। 53,54, यह संयुग्मन प्रतिक्रिया में लौटने और कम डीएफओ moieties संलग्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है एंटीबॉडी प्रति। शुद्ध 89 ZR-डीएफओ-mAb की immunoreactivity अधिक है (> 90%) और उच्च विशिष्ट गतिविधियों वांछित हैं अगर वैकल्पिक रूप से, यह immunoreactivity के घटते बिना एंटीबॉडी के लिए और अधिक chelators संलग्न करने के लिए संभव हो सकता है।

अंत में, एक 89 ZR-डीएफओ लेबल एंटीबॉडी के vivo व्यवहार एंटीबॉडी की पहचान और कार्यरत ट्यूमर मॉडल दोनों पर अत्यधिक निर्भर है, ज़ाहिर है, है। यहाँ प्रस्तुत मॉडल प्रणाली में, ट्यूमर में अधिकतम तेज मूल्य लगभग 60% आईडी / छ पहुंचता है; हालांकि, अधिकतम ट्यूमर तेज V के लिए साहित्य में रिपोर्ट करता हैalues ​​80-90% आईडी / ग्राम के रूप में के रूप में उच्च के रूप में कम 15-20% के रूप में पहचान पत्र / जी से लेकर 33,44,55-57 इसी तरह, गैर लक्ष्य ऊतकों में तेज की राशि -। जिगर और तिल्ली में विशेष रूप से - एंटीबॉडी / प्रतिजन प्रणाली का अध्ययन किया जा रहा है के आधार पर व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं। 89 ZR-डीएफओ लेबल एंटीबॉडी की विशिष्ट गतिविधि vivo में प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। 89 ZR-डीएफओ-Mabs की विशिष्ट गतिविधियों के लिए साहित्य मूल्यों आम तौर पर 1-6 एमसीआई / मिलीग्राम (37-222 mBq / मिलीग्राम) से लेकर। 8,10 आम तौर पर वे अनजाने की संभावना कम है, के रूप में उच्च विशिष्ट गतिविधियों, बेहतर कर रहे हैं प्रतिजन (यानी, आत्म अवरुद्ध) की संतृप्ति। यह निचले स्तर प्रतिजन अभिव्यक्ति के साथ सिस्टम में विशेष रूप से सच हो जाता है। भले ही एंटीबॉडी / प्रतिजन प्रणाली की, एक 89 ZR-डीएफओ लेबल इमेजिंग एजेंट का कोई vivo में जांच चयनात्मकता के एक प्रदर्शन के बिना पूरा हो गया है। इस का उपयोग कर प्रयोगों को अवरुद्ध के माध्यम से हासिल किया जा सकता हैलेबल हटाया गया बायोमोलिक्यूल या प्रश्न में प्रतिजन व्यक्त नहीं करता है कि एक सेल लाइन के उपयोग की बड़ी मात्रा में। इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया में, पूर्व नियोजित किया गया था, लेकिन 89 ZR-डीएफओ-J591 के चयनात्मकता भी PSMA नकारात्मक PC3 प्रोस्टेट कैंसर xenografts का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया है। 23

यह अपनी स्पष्ट लाभ के बावजूद, इस डीएफओ-NCS-आधारित सिंथेटिक कार्यप्रणाली सही नहीं है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। हम चर्चा की है, डीएफओ 89 Zr 4 + के लिए एक आदर्श chelator नहीं है, और संयुग्मन प्रतिक्रिया के गैर-साइट-विशिष्ट प्रकृति बोझिल साबित हो सकता है। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, रोमांचक प्रयासों के लिए नए chelators विकसित करने के लिए 89 Zr 4 + और ​​साइट विशेष radiolabeling के तरीके में वर्तमान में चल रहे हैं, अभी तक इन नई प्रौद्योगिकियों अभी भी अनुकूलित और प्रयोगशाला और क्लीनिक दोनों में मान्य किया जा करने की जरूरत है। 24,26,27, 29,44 अंत में, के निर्माण के लिए डीएफओ-NCS कार्यप्रणाली89 ZR-डीएफओ लेबल एंटीबॉडी radioimmunoconjugates के संश्लेषण के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली उपकरण साबित हो और चिकित्सकीय उपयोगी radiopharmaceuticals की एक विस्तृत विविधता बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है गया है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों उपयोगी बातचीत के लिए प्रो थॉमस रेनर, डॉ याकूब ह्यूटन, और डॉ सर्ज Lyaschenko धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

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