Bioconjugation ve radiosynthesis

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

antikorların olağanüstü afinite, özgüllük ve seçicilik onlara tümör hedefli PET radyofarmasötikler için olağanüstü cazip vektörleri yapmak. Dolayı çok günlük biyolojik yarı-ömrü, antikorlar nispeten uzun fiziksel bozunma yarı ömürleri ile pozitron yayıcı radyonüklitler ile etiketlenmiş olması gerekir. Geleneksel olarak, pozitron yayan izotoplar 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y, (t 1/2 = 14.7 saat) ve 64 Cu (t 1/2 = 12.7 saat) için antikorlar etiketlemek için kullanılmıştır PET görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, ancak, saha antikor bazlı PET görüntüleme ajanları pozitron yayan radiometal 89 Zr kullanımında bir artışa şahit olunmaktadır. Fiziksel bir yarısını sahip gibi 89 Zr, immünoeşlenikler ile PET görüntüleme için neredeyse ideal bir radyoizotop antikorların in vivo farmakokinetikleri ile uyumlu olan ve nispeten düşük bir enerjini yayar Ömrü (t 1/2 = 78.4 saat)yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir rgy pozitron. Bundan başka, antikorlar doğrudan, siderofor türetilmiş kenetleme maddesi desferrioksamin (DFO) ile 89 Zr ile etiketlenebilir. Bu protokol, prostat spesifik membran antijeni hedefleyen antikor J591 göstermek için bir model sistem olarak kullanılır (1) bir antikor, (2) radiosynthesis ve 89 Zr- saflaştırılması kadar izotiyosiyanat DFO çift işlevli çelatör bioconjugation Kanser bir murin modelinde 89, Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate ile DFO mAb radioimmunoconjugate, ve (3) 'de in vivo PET.

Introduction

Dolayı belirgin bir duyarlılık, afinite ve seçicilik için, antikorlar çok kanser hücrelerine radyoizotoplar verilmesi için gelecek vaat eden vektörler olarak kabul edilmiştir. Ancak, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme başvurularının kendi etiketleme için uygun bir pozitron yayan radyoizotop eksikliği engel olmuştur. Radioimmunoconjugates tasarımında en kritik hususlar 1-3 birisi fiziksel çürüme eşleştirme yarı antikor in vivo farmakokinetik radyoizotop hayatı. Daha özel olarak, antikorlar, çoğu zaman, nispeten uzun, çok günlük biyolojik yarılanma ömürlerine sahiptir ve bu nedenle benzer fiziksel yarı ömrü olan radyoizotoplar ile işaretlenmelidir. PET görüntüleme uygulamaları için, antikorlar geleneksel 64 Cu (t 1/2 = 12.7 saat), 86 Y (t 1/2 = 14.7 saat), ya da 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4 ile radyoaktif işaretli olmuştur, 5 Bununla birlikte, her birBu radyoizotoplar klinik görüntüleme için uygunlukları engel önemli sınırlamalar sahiptir. 86 Y ve 64 Cu ile etiketlenmiş radioimmunoconjugates Klinik öncesi araştırmalarda umut verici kanıtlamış olmakla birlikte, her iki izotoplar insanlarda görüntüleme için etkili olduğu için çok kısa olan bir fiziksel yarılanma ömürlerine sahiptirler. 124 I, aksine, bir hemen hemen ideal fiziksel bir yarı ömre sahip antikorlar ile görüntüleme, ama pahalı ve nispeten düşük çözünürlüklü klinik görüntüleri neden optimal çürüme özelliklere sahiptir. Bundan başka, 124-işaretli radioimmunoconjugates, in vivo olarak tümör-zemin aktivitesi oranını düşürebilir bir işlem ite tabi olabilir. 6,7

Sürücü 64 Cu, 86 Y yerini bir pozitron yayan radyoizotop bulmak ve radioimmunoconjugates 124 Ben 89 Zr-etiketli antikorlar araştırma son dalgalanma körükledi. 8-12 T89 Zr habercisi de nedeni basittir: radiometal tanısal PET radioimmunoconjugates kullanım için ideale yakın kimyasal ve fiziksel özelliklere sahip 13 89 Zr 89 Y (p, n) bir kullanan bir siklotron 89 Zr reaksiyonu vasıtasıyla üretilir. ticari olarak temin edilebilen ve% 100 doğal olarak bol miktarda 89 Y, hedef. 14,15 radiometal,% 23 pozitron verim vardır 78.4 saatlik bir yarılanma ömrü ile azalır ve 395,5 keV (Şekil 1) nispeten düşük enerji pozitronlar neşreden. 13,16,17 Bu 89 Zr, aynı zamanda yüksek bir enerji yayar ki dikkat etmek önemlidir, 909 keV γ-ray% 99 verim ile. Bu emisyon yayılan 511 keV fotonlar ile enerjik karışmaz iken, ulaşım, taşıma, ve dozimetrisi ile ilgili ekstra dikkate gerektirir. Bu uyarı rağmen, bu çürüme özellikleri sonuçta 89 Zr daha olumlu bir h sahip değil sadece anlamınaCu 86 Y ve 64 den antikorlar ile görüntüleme için alf-hayat değil, aynı zamanda yüksek 687 ve 975 keV enerjilerin yanı sıra 100-150 keV içinde enerjiler ile fotonların sayısı ile pozitron yayan, hangi 124 Ben daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilir 511 keV pozitron oluşturulan fotonlar. 13 Dahası, 89 Zr onun radyoaktif iyot meslektaşı daha etkili de tümörlerde, işlemek için daha güvenli üretmek için daha az pahalı ve residualizes olduğunu. 89 Zr 18,19 potansiyel bir sınırlama yok ki terapötik isotopologue, örneğin, 86 Y (PET) vs 90 Y (tedavi). Bu onların tedavi meslektaşları için dozimetrik izciler olarak istihdam edilebilir kimyasal özdeş, vekil görüntüleme ajanları yapımını engeller. O dedi, araştırmalar 89 Zr-etiketli antikorlar 90 Y- ve 177 Lu-etiketli immünoeşlenikler görüntüleme suretler olarak potansiyeli var olduğunu göstermektedir.20,21

Kimyasal bir bakış, bir grup IV metal, 89 Zr, sulu çözelti içinde bir 4 katyon olarak bulunur. Zr 4+ iyon yüksek, nispeten büyük (etkin iyonlu yarıçapı = 0.84 A) doldurulur ve bir "sert" katyon olarak sınıflandırılabilir. Bu nedenle, bu sekiz sabit anyonik oksijen donör kadar taşıyan ligandlar için bir tercih sergilemektedir. Kolayca 89, Zr-etiketli radioimmunoconjugates en sık kullanılan kenetleme maddesi desferrioksamin olan (DFO), üç hidroksamat grubu taşıyan bir siderofor türetilmiş asiklik şelatör. Ligand stabil biyolojik ilgili pH seviyelerinde oda sıcaklığında hızlı ve temiz Zr 4+ katyon koordinatları ve ortaya çıkan Zr-DFO kompleksi tuz, kan serumunda birden fazla gün boyunca sabit kalır ve tam kan. 22 Hesaplamalı çalışmalar kuvvetle öneririz DFO metal merkez üç neut koordinatlanmış olan Zr 4+ bir hexacoordinate kompleks oluşturmasıRal ve ligand üç anyonik oksijen donör olarak, iki ekzojen su ligandlar (Şekil 2). 23,24 89 Zr-DFO çekimleri iskele istihdam radioimmunoconjugates in vivo davranış genellikle mükemmel olmuştur. Bununla birlikte, bazı durumlarda, görüntüleme ve akut biyolojik dağılım çalışmaları 89, Zr-etiketli antikorlar ile enjekte edilen farelerin kemik yükseltilmiş aktivite düzeylerini Zr 4+ katyon, daha sonra in vivo olarak kenetleme salınır ve 89 osteophilic mineralleşir düşündürmektedir verileri ortaya koymuştur Kemikte. sekiz oksijen donör literatürde adı geçen 25 en son, yeni 89 Zr 4+ kenetleme geliştirilmesine yönelik araştırmalardan bir dizi özel olarak, şu anda Bununla birlikte, 24,26,27. ligandları DFO en yaygın olarak kullanılan şelatördür 89 yılında bir farkla radioimmunoconjugates Zr-etiketli. Farklı bir dizibioconjugation stratejileri bioorthogonal tıklama kimya, antikorda sistein ile inşa tiol-reaktif DFO reaksiyonu ve ester taşıyan DFO antikorda bir lisin ile inşa aktif reaksiyonunu da dahil olmak üzere antikorlar DFO eklemek için kullanılmaktadır. 4,28- 30 kolayca en yaygın strateji, ancak, 22 sağlam Bu ticari olarak temin edilebilen iki fonksiyonlu kenetleyici. DFO, DFO-NCS bir izotiyosiyanat taşıyan bir türevinin kullanılması ile (Şekil 2) olan ve güvenilir bir şekilde bir lisin ile sabit, kovalent tioüre bağlar oluşturan olan antikoru (Şekil 3).

Son birkaç yıl içinde, 89, Zr-DFO-işaretli radioimmunoconjugates çok çeşitli literatürde bildirilmiştir. Klinik öncesi araştırmalar gibi CD105-hedefleme T gibi cetuximab, bevacizumab ve trastuzumab daha ezoterik antikorların daha iyi bilinen arasında değişen antikorlar içeren, özellikle bol olmuşturRC105 ve 5A10 sPSA hedefleme. 30-36 Daha yakın zamanlarda, 89, Zr-DFO etiketli antikorlar kullanılarak erken faz klinik çalışmaların az sayıda literatürde ortaya çıkmıştır. 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89, Zr-DFO-ibritumomab tiuksetan ve 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Ayrıca, 89 ile diğer klinik çalışmaların bir dizi istihdam Özellikle, Hollanda'da gruplar yayınladık çalışmalar Zr-etiketli radioimmunoconjugates prostat kanseri görüntüleme için PSMA hedefleme 89 Zr-DFO-J591 ve meme kanseri görüntüleme için HER2-hedefleme 89 Zr-DFO-trastuzumab ile Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'nde burada soruşturma da dahil olmak üzere, halen devam etmektedir. 23, Radyo-etiketli antikorlar, en çok 89, Zr-etiketli radyofarmasötik kalır Buna ek olarak, 30, radiometal da artan bir peptit, protein, ve nano malzemelerin de dahil olmak üzere başka vektörler ile kullanılmıştır. 38-43

Bu 89 Zr-DFO etiketleme metodolojisi modülerlik muazzam bir varlıktır. biyobelirtecin hedefleme antikorların repertuar sürekli genişleyen ve bu yapıları kullanarak in vivo PET görüntülemede performans ilgi hızla büyüyor olmasıdır. Sonuç olarak, biz daha standart uygulamalar ve protokollerin geliştirilmesi alanını yararlanabilir inanıyorum. DFO-NCS konjugasyon ve 89 Zr Radyoaktif için mükemmel bir yazılı deneysel protokol zaten Vosjan tarafından yayımlanmış, vd. 22 Biz bu işin tarafından sağlanan görsel gösteri daha bu tekniklerin yeni müfettişler yardımcı olabilir hissediyorum. Eldeki Protokolde, prostat spesifik membran antijeni hedefleyen antikor J591 göstermek için bir model sistem olarak kullanılır (1) bir antikora DFO-izotiyosiyanat çift işlevli çelatör bioconjugation, 89 (2) radiosynthesis ve arıtma Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate,ve (3) 'de bir kanser sıçangil modelinde 89, Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate in vivo PET görüntülemesi. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tarif in vivo hayvan deneylerinde tüm onaylanmış protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kurallar altında göre yapıldı.

J591 için DFO-NCS 1. Konjugasyon

  1. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 x fosfat tamponlu tuzlu çözelti (pH 7.4) ya da 0.5 M HEPES tampon (pH 7.4) ya da 1 ml J591 bir 2-5 mg / ml bir solüsyon hazırlanır.
  2. 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml) arasında bir konsantrasyonda kuru DMSO içinde bulunan DFO-NCS ile çözülmüştür. Sonikasyon veya girdap tamamen çözünmesini kolaylaştırmak için iyice çözelti.
  3. Az miktar 0.1 M Na-2 (<10 | il) CO 3 eklenerek 8,8-9,0 için J591 çözeltinin pH ayarlayın.
  4. Antikor çözeltisi doğru pH değerinde sonra, çift işlevli çelatör ve bir 3-4 kat molar fazlalık karşılık gelen DFO-NCS bir çözelti hacminin ilave edin.
    1. Sınavaple, bir 2 mg / ml J591 antikor çözeltisi, 1 ml (13.3 nmol J591) için 10 mM (7.6 mg / ml) DFO-NCS çözeltisi (40.4 nmol DFO-NCS), 4-5 ul ekle. Nihai sulu reaksiyon karışımı içinde DMSO miktarının% 2 v / v geçmemelidir.
  5. 350 rpm'de çalkalanarak bir ısıtma bloğu üzerinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin.
  6. 37 ° C'de 1 saat sonra, yıkama sıvısı olarak 0.5 M HEPES tampon (pH 7.4) kullanılarak, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir önceden paketlenmiş tek boyut dışlama tuz giderme kolonu kullanılarak elde edilen immünokonjugat temizler. Bu adım tamamlandıktan J591-DFO yapısının bir 2 ml solüsyon verecek.
  7. UV-Vis spektrofotometre üzerinde inşa J591-DFO konsantrasyonu ölçün.
  8. Yapının daha yüksek bir konsantrasyonu istendiğinde, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak J591-DFO çözelti konsantre edilir.
  9. Karanlıkta -20 ° C'de tamamlanan J591-DFO immünokonjügenin çözümü saklayın.

89 Zr 2. Radyo-etiketlenmesi J591-DFO

DİKKAT: protokolün Bu adım işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden veya ev kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile danışmalısınız radyoaktivite araştırmacılar ile başka bir iş yapmadan önce. Mümkün olan tüm adımlar iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınmalıdır.

NOT: Uygun radyokimyasal not tutma adına, örnekteki radyoaktivite miktarı, bir doz kalibratörü kullanılarak ölçüldü ve kaydedildi edilmelidir aşağıdaki protokol Adımlar 2,2-2,13 sonra. Bu radyokimyasal verim ve belirli faaliyetlerin doğru kararlılıkla yardımcı olacaktır.

  1. 0.5 M HEPES tamponu, pH 7.5, 200 ul J591-DFO 0.5-2.0 mg ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
  2. Hacmi Pipet <2 ml'lik plastik bir vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü içine 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) karşılık gelen (tipik olarak 1.0 M oksalik asit bulunur) destek> 89 Zr 4+ stok çözeltisi. 1.0 M oksalik asit kullanılarak toplam 300 ul bu çözümün ses seviyesini ayarlayın.
  3. 1,0 M Na-2 CO 3 ile 6,8-7,5 89 Zr 4+ çözeltinin pH ayarlayın. Istenen pH'ı elde etmek üzere bir baz alikotları daha küçük (<10 ul) ekleyin daha sonra 89 Zr 4+ çözeltisine CO 3 1.0 M Na-2 250 ul ekleyerek başlayın ve.
  4. Aşama 2.1'de elde J591-DFO çözeltisine pH ayarlı 89 Zr 4+ solüsyonunun arzu edilen miktarı ekleyin.
  5. Bu 6,8-7,5 istenen aralık içine düşmesi için emin olmak için, radyo-etiketleme, reaksiyon karışımının pH değerini kontrol edin.
  6. 350 rpm'de çalkalanarak bir ısıtma bloğu üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika süre ile, radyo-etiketleme reaksiyonu inkübe edin.
  7. Kuluçkadan 60 dakika sonra, uçucu ölçmekRadyo-TLC kullanarak reaksiyonun ürünü iolabeling.
    1. Bu amaçla, bir silis emdirilmiş TLC şeridinde, radyo-etiketleme, reaksiyon karışımının 1 uCi nokta. 50 mM DTPA (pH 5.5) bir yıkama sıvısı kullanılarak TLC çalıştırmak, kısım kurumasını bekleyin ve bir radyo-TLC tarayıcı kullanarak TLC şerit analiz. 89 Zr 4+ kökenli görünecektir J591-DFO yapı bağlı (R <Zr 89 serbest 4+ katyonlar DTPA ile şelatlı edilecek ve çözücü ön (R f ile Zehir olurken 0.1),> 0.9) f.
    2. , Radyokromatogramdır entegre eğrinin altındaki toplam alan ile 0,0-0,1 f R eğri altında kalan alan bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile reaksiyonun Radyoetiketleme verimi,.
  8. Radyoetiketleme verimi, yeterli (tipik olarak> 2 mCi / mg teorik spesifik aktivite) olması durumunda, 50 mM DTPA, pH 5.5, 5 ul ile reaksiyonun söndürülmesi.
  9. Elde immünokonjugat usi arındırınng, 5 mg / mL gentisik asit ile 5 mg / mL gentisik asit veya 0.25 M sodyum asetat (pH 5.5) ile% 0.9 steril tuzlu su ya da bir yıkama sıvısı kullanılarak bir 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir önceden paketlenmiş tek boyut dışlama kullanımlık tuz alıcı sütun . Bu adım tamamlandıktan 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate bir 2 ml solüsyon verecek.
  10. Aşama 2.7 de tarif edildiği gibi saflaştırmadan sonra, radyo-TLC kullanarak 89, Zr-DFO-J591 radyokimyasal saflığının doğrulanması.
  11. Ilk olarak saflaştırılmış 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate izole radyoaktivite miktarına göre antikor çözeltisine ilave etkinlik miktarını bölerek reaksiyonun tüm Radyoetiketleme verimi,.
  12. Radyoetiketleme reaksiyonunda DFO-J591 ilk kütle itibariyle arındırılmış 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate izole aktivitesi miktarının bölünerek nihai spesifik aktivite hesaplanır.
  13. Daha yüksek bir konsantrasyonu, arzu edildiği takdirde, inci konsantreE 89 50000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak, Zr-DFO-J591 çözeltisi.
    NOT: Son arıtma aşamasında kullanılan gentisik asit nedeniyle radyoliz antikorun zararın en aza düşürülmesi için kullanılan bir radyo-koruyucu olduğu 46 da 4 ° C 'de en fazla 48 saat için 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate depolanması. mümkün, bu tavsiye edilmez. Radioimmunoconjugate saklanabilir ise, hipoklorit aracılı radyoliz riskini en aza indirmek amacıyla, depolama tamponu olarak, 5 mg / mL gentisik asit 0.25 M sodyum asetat (pH 5.5) kullanın. 47

89 Zr-DFO-J591 ile Vivo PET Görüntüleme 3.

DİKKAT: Protokol Bölüm 2'de olduğu gibi, protokol, bu adımı işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Tüm possible adımlar iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınmalıdır.

  1. Erkek atimik çıplak farelerde deri altından, 5 x 10 6 LNCaP prostat kanser hücreleri implant ve bu (3-4 hafta, aşılamadan sonra) 100-150 mm3 xenograft büyümeye izin verir. 44 '
  2. % 0.9 steril tuzlu su içinde 1.0 mCi / ml 'lik bir konsantrasyona kadar 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate seyreltin.
  3. 89, Zr-DFO-J591 çözeltisi (200 uCi, 7.4 MBq) 200 ul enjekte edilir. Nakil doku taşıyan kobay farelerinin yanal kuyruk damarı içine 48
  4. Istenen görüntüleme zaman noktasında (örneğin, 12, 24, 48, 72, 96 ya da 120 saat sonra enjeksiyon), bir% 2 izofluran ile anestezi fare: oksijen gazı karışımı.
  5. Küçük hayvan PET tarayıcı yatakta farenizle ve% 1 izofluran kullanarak tarama sırasında anestezi korumak: Oksijen gazı karışımı. Tarayıcı yatakta hayvan yerleştirerek önce, ayak-tutam yöntem ve Uyg kullanarak anestezi doğrulamakanestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri y oftalmik merhem. 49
  6. 350-700 keV enerji penceresi ve 6 nsaniye bir tesadüf zamanlama penceresini kullanarak 40 milyon tesadüf olaylar minimum statik tarama yoluyla fare PET veri elde. 50
  7. Görüntü yakalanmasını tamamladıktan sonra, gözetimsiz fare bırakmayın ve bilinci kazanmış kadar diğer fareler ile bir kafese koymayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol antikora DFO-NCS konjugasyon ilk adım genellikle oldukça sağlam ve güvenilir. Genel olarak, saflaştırılmış, kenetleme maddesi ile modifiye edilmiş immüno>% 90 verimle elde edilebilir ve ilk birleşme reaksiyonu içinde bulunan DFO-NCS 3 mol eşdeğeri kullanılarak bir derece-of-etiketleme, yaklaşık 1,0-1,5 arasında kenetleme DFO verecek / mAb. Işlemin 89, Zr, radyo-etiketleme ve saflaştırma aşamaları aynı şekilde basittir. Yukarıdaki protokole belirtilen konsantrasyonlarda>% 80, radyo-etiketleme verim ve> 2.0 mCi / mg, böylece belirli etkinlikler de oda sıcaklığında 60 dakika sonra tipiktir. Ham Radyoetiketleme karışımı radyo-TLC kromatogramı muhtemelen çözücünün ön (Şekil 4A) ile elüt edilmektedir Bazı DTPA-bağlı 89 Zr 4+ ortaya çıkaracaktır. Ancak radioc DTPA reaksiyonu söndürmek ve 89, Zr-DFO mAb boyut dışlama kromatografisi ile inşa saflaştırılması sonrasaflaştırılmış, izole edilmiş 89, Zr-DFO mAb konjugatının hemical saflık>% 95 (Şekil 4B) olmalıdır. İzole 89, Zr-DFO mAb konjügatı radyokimyasal saflığı en az% 95 olması halinde, saflaştırma işlemi öncesinde herhangi bir in vitro performans ya da in vivo deneyler tekrarlanmalıdır.

In vivo deneyler için taşıma, protokolde atimik çıplak fareler PSMA eksprese, LNCaP prostat kanseri ksenogrefleri 89 Zr-DFO-J591 in vivo davranışlarını araştırmak için kullanıldı taşıyan, yukarıda tarif. Akut biyodağılımı ve PET görüntüleme deneyleri Hem 89, Zr-DFO-J591 açıkça mükemmel görüntü kontrastı ve yüksek tümör-zemin aktivitesi oranları (Şekil 5) ile prostat kanseri ksenograftları delineates ortaya koydu. tümör radioimmunoconjugate alımı erken 24 saat (5.6% ID / g ± 20.9%) ve faaliyet olarak bellidir96 saat sonrası enjeksiyon 5.3% ID / g ±% 57,5 ​​maksimum tümör artar konsantrasyon. Radioimmunoconjugates için tipik olarak, izleme maddesinin nispeten yüksek bir konsantrasyonu, kan içinde bulunan radyoaktivite miktarının yavaş azalma, ardından erken zaman noktalarında (% 9.1 24 saat sonra ± 5.3% ID / g), bir kan içinde bulunan Deney ders. En yüksek aktivite konsantrasyonu ile hedef olmayan doku muhtemelen osteophilic katyon 89 Zr 4+ in vivo serbest bir sonucu olarak, deney boyunca,% 10 ID / g etrafında alım değerleri gösterdi kemik oldu. Kalp, akciğer, karaciğer, dalak, mide, kalın ve ince bağırsak, böbrek, ve nispeten düşük aktivite konsantrasyonları görüntülenen kas, genellikle çok altında% 5 Kimliği / g dahil olmak üzere tüm diğer organlar. Bir kontrol olarak, farelerde ek bir kohort antijeni doyurulması ve böylece seçici bir şekilde bloke göstermek için birlikte enjekte 300 ug etiketlenmemiş DFO-J591 enjekte edildi. Great.Thanks bir biçimde, engelleme deneyi açıkça 89 Zr-DFO-J591 seçici onun hedef olduğunu belirten 72 saat sonrası enjeksiyon 11.1% ID / g ± 23.5% 9.3% ID / g ± 48,9 den% tümör radioimmunoconjugate alımını indirdi antijeni.

Şekil 1,
Şekil 1. (A) basitleştirilmiş çürüme şeması ve (B) 89 bazı belirgin özellikleri çürüme Zr 13,16,17 BT izomerik geçiş =.; AK = elektron yakalama. Modifiye ve ark Deri, izniyle. Nükleer Tıp ve Biyoloji. 40, 3-14 (2013). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2 yeniden "src =" / files / ftp_upload / 52.521 / 52521fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Şekil 2. (A) kırmızı renkli koordine oksijen atomları ile DFO-NCS yapısı; (B) Zr-DFO koordinasyon kompleksinin bir DFT-türetilmiş yapı. Modifiye ve ark Deri, izniyle. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4849-4860 (2014). Telif Hakkı 2014 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,

89 Zr-DFO-J591 ve bioconjugation ve Radyoaktif Şekil 3. Şema.et = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 4,
89, Zr-DFO-J591 ham Radyoetiketleme karışımı (A) ve saflaştırılmış bir ürün (B) Şekil 4. Örnek radyo TLC kromatogramları. Radyo-TLCs 50 mM DTPA, pH 5.0 arasında bir yıkama sıvısı kullanılarak silis kromatografisi şeritleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
89, Zr-DFO-J591 Şekil 5. koronal PET görüntüleri (11,1-12,9 MBq [300-345 uCi] 200 ul% 0.9 steril tuzlu su içinde kuyruk damarı içinden enjekte edilerek) subkutan taşıyan atimik çıplak farelerde, PSMA eksprese24 ve 120 saat sonrası enjeksiyon arasındaki LNCaP prostat kanseri ksenogrefleri (beyaz oklar). Modifiye ve diğ Zeglis izniyle. Bioconjugate Kimya. 24, 1057-1067 (2013). Telif Hakkı 2013 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Inşaat, Radyoetiketleme ve görüntüleme 89 Zr-DFO-etiketli radioimmunoconjugates oldukça basit prosedür genellikle iken, bu sürecin her aşamasında akılda birkaç önemli hususlar tutmak önemlidir. Örneğin, diyelim prosedürün konjugasyon aşamasında endişe en muhtemel nedeni birleşme reaksiyonu sırasında antikorun toplanmasıdır. Bu sorun, genellikle DFO-NCS stok çözeltisi ilave edildikten sonra birleşme reaksiyonu zayıf bir karıştırma ürünüdür. Bu durumda, DFO-NCS homojen olmayan dağılımı, yerel reaksiyon, aşırı yüksek seviyeleri neden 22 bu da toplama yol açabilir antikor. Bu sorun, nispeten daha kolay bir Temperatur üzerine, reaksiyon karışımı iyice DFO-NCS ilave edildikten sonra, reaksiyon karışımının karıştırılması, (<5 ul), küçük kısımlar halinde, DFO-NCS stok solüsyonu eklenmesi ve ajite ile bozulurE kontrollü çalkalayıcı. Buna ek olarak, DFO-mAb yapısının konjugasyon ve saflaştırma işleminden sonra, tam da her mAb konjüge DFO sayısını belirlemek için önemlidir. Antikor başına DFO şelatların sayısının tam karakterizasyon, Holland tarafından gerçekleştirilen benzer radyometrik izotopik seyreltme deneyleri kullanılarak elde edilebilir, ve ark., ve Anderson vd., MALDI-TOF kütle spektrometrisi olsa geçerli bir alternatif. 14,23 , Radyoetiketleme adım sırasında 30,51,52, kolayca en yaygın sorun beklenenden düşük-Radyoetiketleme verimi olduğunu. Beklenmedik düşük verim sinsice yukarıdaki protokolü takip rağmen oluşursa, üç farklı sorun giderme stratejileri vardır: (1) uzun zaman miktarlarda Radyoetiketleme reaksiyonu kuluçka (örneğin, 2-3 saat); (2) Antikorun daha yüksek bir konsantrasyonu kullanılarak, radyo-etiketleme reaksiyonu tekrarlamak; veya (3) th daha yüksek bir mol fazlasını kullanarak ilk DFO-NCS konjügasyon reaksiyonu tekrarlanarakE Çift işlevli çelatör.

DFO-NCS çekimi kolay ve sağlam iken, onun yadsınamaz zayıflıklarından biri bu siteye özgü değildir olmasıdır: DFO-NCS konumları ne olursa olsun antikor mevcut lysines ile tiyoüre bağlantılarını oluşturur. Bunun bir sonucu olarak, bu kenetleme maddeleri bu şekilde olumsuz 89, Zr-DFO-işaretli birleşmişi 'nin immunoreaktivitesini etkileyen, antikorun antijen-bağlayıcı bölgesi eklenmiş olabilir mümkündür. Bu nedenle, ince bir denge 89 Zr-etiketli radioimmunoconjugates yapımında vurdu gerekir: antikor başına kenetleyicilerin yüksek sayılar daha yüksek spesifik faaliyetlerini kolaylaştırmak, ancak etiketleme yüksek derece de yapının immunoreaktivitesini ödün riskini artırır. Sonunda, amaç basit: immunoreaktivitesini ödün vermeden gerektiği kadar şelatlayıcılar takın. Arıtılmış 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate aldıktan sonra, o belirlemek için önemlidir Herhangi vivo deney öncesinde yapı in vitro immünoreaktivitesi. Bu amaçla, Lindmo tarafından yayınlanan, in vitro yöntemlerle tavsiye yapının immünoreaktivitesi daha düşük% 80-90 ise, ve ark. 53,54, bu konjugasyon reaksiyonuna geri ve daha az DFO kısımları eklemek gerekebilir Antikor başına. Saflaştırılmış 89, Zr-DFO-mAb'nin immünoreaktivitesi yüksek (>% 90) ve daha yüksek spesifik aktiviteler arzu edilir, alternatif olarak, bu immunoreaktivitesini azaltmadan antikor daha şelatlar tutturulması mümkün olabilir.

Son olarak, bir 89, Zr-DFO-etiketli antikorun in vivo davranış, antikorun kimlik ve kullanılan tümör modeli iki büyük ölçüde bağlı, tabii ki,. Burada yer alan bir model sisteminde tümör maksimum alım değeri yaklaşık olarak% 60 ID / g ulaşır; Ancak, maksimum tümör alım v literatürde raporlarıedilen değerler,% 80-90 İD / g kadar yüksek düşük 15-20% ID / g arasında değişir 33,44,55-57 Benzer şekilde, hedef olmayan dokularda alım miktarı, -., karaciğer ve dalak, özellikle - antikor / antijen sistemi çalışılan bağlı olarak geniş ölçüde değişebilir. 89, Zr-DFO-etiketli antikorun spesifik aktivitesi, in vivo deneyler için önemli bir husustur. 89 Zr-DFO-mAbs'nin belirli faaliyetleri için Edebiyat değerleri tipik 1-6 mCi / mg (37-222 MBq / mg) arasında değişir. 8.10 Genellikle yanlışlıkla olasılığını azaltmak gibi, yüksek spesifik aktiviteler, tercih edilir antijen (yani, kendini engelleme) doygunluk. Bu alt seviyeleri antijen ifadesi ile sistemlerde özellikle doğrudur olur. Ne olursa olsun antikor / antijen sistemi, bir 89 Zr-DFO-etiketli görüntüleme ajanı in vivo soruşturma seçicilik bir gösteri olmadan tamamlandı. Bu kullanarak deneyler engelleme yoluyla elde edilebiliretiketlenmemiş biyomolekül veya söz konusu antijeni ifade etmeyen bir hücre kullanılması taşırlar. Bu tarifnamede tarif edilen prosedüre, eski kullanılabilir, ama 89, Zr-DFO-J591 seçiciliği PSMA negatif PC3 prostat kanseri ksenograftları kullanılarak gösterilmiştir. 23

Onun açık avantajlarına rağmen, bu DFO-NCS-bazlı sentetik metodoloji mükemmel değildir dikkat etmek önemlidir. Konuştuğumuz gibi, DFO 89 Zr 4+ için ideal bir kenetleme maddesi değildir ve konjugasyon reaksiyonu olmayan site-spesifik doğa hantal kanıtlayabilirim. Bu sorunları aşmak için, heyecan verici çabalar için yeni şelatlayıcılar geliştirmek için 89 Zr 4+ ve siteye özgü Radyoetiketleme metodolojileri halen devam etmektedir, ancak bu yeni teknolojiler hala optimize edilmiş ve laboratuar ve klinikte hem de valide edilmesi gerekir. 24,26,27, 29,44 Sonuçta, yapımı için DFO-NCS metodolojisi89, Zr-DFO-etiketli antikorlar radioimmunoconjugates sentezi için son derece güçlü bir araç olduğu kanıtlanmış ve klinik olarak faydalı radyofarmasötiklerin geniş bir çeşitlilik oluşturmak için kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar yararlı konuşmalar Prof. Thomas Reiner, Jacob Houghton, Dr. Serge Lyaschenko teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14, (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23, (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8, (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7, (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20, (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8, (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12, (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40, (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9, (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36, (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45, (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8, (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11, (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35, (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55, (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39, (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33, (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5, (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51, (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57, (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38, (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20, (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49, (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37, (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5, (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51, (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48, (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2, (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39, (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87, (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52, (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18, (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13, (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22, (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30, (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6, (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24, (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170, (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46, (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147, (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34, (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33, (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36, (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72, (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121, (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1, (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52, (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53, (1), 113-120 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics