Vurdering overførbar spongiform encephalopati artsbarrierer med en

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Overførbare spongiforme encephalopatier (TSE, prionsygdomme) er en gruppe af dødelige neurodegenerative sygdomme med udvidede inkubationstid, der påvirker en lang række dyr og mennesker. Den formodede ætiologiske agens for TSE består af en misfoldet isomer af værten prionprotein (PrP), som er i stand til selv-formering af template-driven omdannelse af normale cellulære form af PrP (PrP C) i en infektiøs, sygdom-associeret formular (PrP TSE), der ophobes i centralnervesystemets væv i den inficerede vært 1. Smitsomme pattedyr prioner generelt transmittere fra host-til-vært i en artsspecifik måde, der har givet anledning til begrebet "TSE artsbarrieren" begrænsende interspecies transmission begivenheder 2. De biologiske determinanter for prion artsbarrieren er ikke godt forstået. Aminosyresekvens-lighed mellem det infektiøse PrP TSE og værten PrP C cen stor indflydelse, om konvertering finder sted 3-5, men er fortsat utilstrækkelig til at forklare alle prion transmission begivenheder observeret in vivo 6,7.

Således har karakterisering af TSE artsbarrierer stort set påberåbes dyr challenge studier: udsætter naive dyr fra en given art til prioner fra en anden og måle den resulterende inkubationstid til sygdomsdebut og angribe sats som indikatorer for transmission effektivitet. Mus, der udtrykker PrP C fra heterologe arter også anvendes til denne type undersøgelse 8. Omkostningerne i forbindelse med transgene mus produktion og langvarige prion bioassays, samt etiske overvejelser for anvendelse af dyr, er hindringer for eksperimentel undersøgelse af TSE artsbarrierer. Vurdering af den menneskelige art barriere for TSE afhængig mus manipuleret til at udtrykke humant PrP C. Disse mus kræver lang inkubationstid at bukke under for menneskelige TSE eller modifikationer til than humane PrP C molekyle til hurtig sygdomsstart 9. Inkubationsperioderne for ikke-human TSE hos disse mus kan strække sig ud over den normale mus levetid gør fortolkning af negative resultater udfordrende. Ikke-menneskelige primater er også blevet anvendt som stedfortrædere for at studere menneskelige barrierer arter, men disse undersøgelser er behæftet med de samme udfordringer som andre typer dyreforsøg og ikke-menneskelige primater må ikke præcist rekapitulere sygdom, da det fortsætter i den menneskelige vært.

Animal bioassays forbliver "gold standard" metode til måling af følsomhed på en art til en TSE, men de hindringer, omkostninger og etik i disse levende dyreforsøg har tvunget undersøgelse alternativer. En række af in vitro assays, baseret på vurdering af omdannelsen af værten PrP C til en proteinase K (PK) resistent tilstand (PrP res) når podet af PrP TSE, er blevet udviklet og anvendt til at undersøge TSE species barrierer 10-12. Eksempler på in vitro-analyser omfatter cellefrie konvertering assays, protein misfoldning cyklisk forstærkning (PMCA), og virkningsgraden ratio (CER) assay 10-14. Selv om ingen af ​​disse analyser tager hensyn perifere faktorer involveret i artsbarrierer efter naturlig infektion, kan alle være nyttigt at identificere potentielt modtagelige værter for TSE.

Her præsenterer vi den protokol for CER assay, hvor to denaturerede PrP C substrater afledt fra normale hjernehomogenater anvendes i bænk top prion omdannelsesreaktioner (figur 1) 13. PrP C i substratet denatureret ved pH 7,4 kan kun omdannes til PrP res af PrP TSE podet i reaktionen i fravær af en art barriere 14. I modsætning hertil denaturering af PrP C i det andet substrat ved pH 3,5 gør det muligt at blive konverteret til PrP res efter inkubationmed PrP TSE fra alle arter og tjener som en kontrol for konvertering. Forholdet mellem omdannelse af PrP C til PrP res i pH 7,4 substratet i forhold til den for pH 3,5 substrat tilvejebringer et mål af arten barriere. Vi har fundet, at CER analysen forudser kendte arter barrierer af laboratoriemus til forskellige former for TSE og har brugt analysen i bestræbelserne på at forudsige arten barriere af mange arter pattedyr, herunder bighornfår, at chronic wasting disease (CWD) og andre former for TSE 14, 15. Efterforskere interesseret i et værktøj som muliggør en hurtig screening af TSE artsbarrierer eller vurdering af PrP C -til-PrP res konvertering vil finde denne metode nyttig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal arbejde udført på USGS National Wildlife Health Center blev udført i overensstemmelse med NIH Office of Laboratory Animal Welfare retningslinjer og under institutionel Dyrepleje og brug udvalg protokol # EP080716. Væv fra Hunter-høstet dyr var gaver fra Wisconsin eller Michigan Afdelinger af naturressourcer.

1. Fremstilling af opløsning

BEMÆRK: De løsninger, der er anført nedenfor er nødvendig for at udarbejde CER assay substrat i afsnit 2 nedenfor. Forbered hver af disse opløsninger fra højere koncentration stamopløsninger; anbefalede koncentrationer for stamopløsninger vil blive givet i parentes efter hver respektive kemiske navne på listen. Forbered alle løsninger frisk på forberedelse af underlaget og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.

  1. For lyseringspuffer, udarbejde en løsning af følgende i 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 stamopløsning anbefales): 100 mm sodium chlorid (NaCl, 1 M stamopløsning), 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 stamopløsning), 0,5% NP-40 (10% stamopløsning), 0,5% deoxycholat (DOC, 10% stamopløsning ).
  2. For omdannelse buffer, fremstilles en opløsning af 0,05% natriumdodecylsulfat (SDS, 10% stamopløsning) og 0,5% Triton X-100 (10% stamopløsning) i 1 phosphatbufret saltvand (PBS, 10, pH 7,4 stamopløsning).
  3. For chaotropiske løsninger, udarbejde to 3 M opløsninger af guanidinhydrochlorid (GdnHCl, 8 M materiel) i 1x PBS (10x stamopløsning). PH indstilles en af ​​løsningerne til 3,5 ± 0,05 under anvendelse af koncentreret saltsyre (HCl). Kontroller, at pH af den anden opløsning er ved pH 7,4 ± 0,05 og justering ved hjælp af koncentreret HCl eller natriumhydroxid (NaOH), hvis nødvendigt.

2. Forbered CER Assay Substrat Pairs

  1. Opnå sund, ikke-TSE-inficeret hjernevæv fra arter af interesse og forberede en vægt pr volumen 10%(W / v) homogenat i lysebuffer ved hjælp af en af ​​følgende metoder: dounce, perle-mølle eller morter og støder homogenisering. Definer yderligere resulterende homogenater ved at underkaste dem sprøjte-og-nål homogenisering, anvendelse af nåle med stigende gauge indtil substrat kan aspireret, og udstødes med lethed gennem en 27 G kanyle.
    1. For substrater fremstillet ud fra gnavere og andre små pattedyr, homogeniseres hele hjernen (s); for substrater fremstillet af større pattedyr, brug OBEX (hjernestammen) væv til at forberede homogenater. Ved valg af mængden af ​​hjernehomogenat, forberede ikke mere end 50% af kapaciteten af ​​centrifugen anvendes til proteinudfældning i trin 2.6.
    2. Hvis kvaliteten af erhvervet hjernevæv er tvivlsom, vurdere PrP C-niveauer ved SDS-PAGE 16 og immunoblot 17 før forberedelse af underlaget.
  2. Divider hjernehomogenat i to lige store mængder i separate mærkede plastik koniske rør. Tilføj GdnHCl (3 M opløsninger i 1 PBS) ved enten pH 3,5 eller 7,4 til hvert rør i et 1: 1 volumenforhold hjernehomogenat.
  3. Kontroller pH-værdierne af de to opløsninger. PH indstilles pH 3,5 substratet til pH ± 0,05 under anvendelse af koncentreret HCI. Sikre pH af andet substrat forbliver ved pH 7,4 ± 0,05 og justere pH, hvis nødvendigt med HCl eller NaOH efter behov. Undgå overskridelse pH-værdier ved velovervejet tilsætning af syre eller base.
  4. Roter løsninger på en ende-over-ende mixer ved stuetemperatur (RT) i 5 timer.
  5. Udfælde proteinet ved tilsætning af fire volumener methanol til substratet løsninger i hver konisk rør til vortex bland godt, og inkuberes ved -20 ° C i 16-18 timer.
  6. Sedimentprøver ved centrifugering ved 13.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Dekanteres forsigtigt og kassér supernatanterne og tillade methanol at fordampe fra pillerne. Brug bomuld tippes applikatorer til at hjælpe med at absorbere methanol klæbede til indersiden af ​​røret. Lad ikke pellets at over-dry og når methanol er ikke længere synlig, skal du fortsætte til næste trin.
  7. Resuspendér protein pellets i konvertering buffer. Anvender en mængde på konvertering buffer svarende til mængden af ​​hjernehomogenat udgangsmateriale dispenseret i hvert rør i trin 2.2.
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at omdannelsen buffer anvendes til resuspendering protein pellets fra både pH 3,5 og 7,4-behandlede substrat præparater opløsningen defineret i trin 1.2 (som indeholder lave niveauer af detergenter og en fysiologisk pH).
  8. Kort soniker substrat løsninger i en cuphorn sonikator (10 sek på ~ 30% maksimal effekt), alikvot i 0,5-1,0 ml volumener i mærkede 1,5 ml mikrocentrifugerør. Udfør en kvalitetskontrol immunoblot (trin 2.9) om en portion af hvert substrat. Opbevar andre portioner ved -80 ° C indtil den er klar til at udføre CER assay (afsnit 4).
  9. Udfør kvalitetskontrol på CER substrat par før brug (figur 2). Disse trin sikrer, at CER substrater vil provide optimale resultater i konvertering undersøgelser.
    1. Sikre sammenlignelige mængder af PrP C i de to substrater. Sammenlign PrP niveauer i 10-25 pi af hvert substrat ved SDS-PAGE 16 og immunoblotting 17. Hvis protein niveauer i pH 7,4 og 3,5 substrater er inden ~ 10% af hinanden substratet par er egnet til brug i CER studier.
      BEMÆRK: PRP immunoblots må ikke vise tegn på omfattende PrP C nedbrydning. PrP immunreaktivitet skal være hovedsagelig> 20 kDa. Bands mindre end dette molekylmasse kan være nedbrydningsprodukter. Båndmønstre bør være nogenlunde svarer mellem substrat par.
    2. Som PrP C i begge substrater bør være PK følsomme, behandle 10-25 pi af hvert substrat med PK ved en slutkoncentration på 100 ug / ml og fordøje prøver ved 1.000 rpm ved 37 ° C i 1 time i termo-shaker. Vurdere eventuelle resterende PrP signal ved SDS-PAGE 16 og immunoblotting 17.Underlag med PrP res er ikke egnede til brug i CER studier.

3. Forbered TSE-agens Frø

  1. Opnå TSE-inficerede hjernevæv fra arter af interesse og forberede en 10% (w / v) homogenat i 1x PBS pH 7,4 ved hjælp af de metoder, der er anført i trin 2.1.
    BEMÆRK: Frø kan også fremstilles fra andre TSE-inficerede væv uden for det centrale nervesystem, men effektiviteten af ​​omdannelse af hjemeafledt substrater ved frø afledt fra TSE-inficerede perifere væv er endnu ikke blevet eksperimentelt vurderet i den publicerede litteratur.
  2. Alikvot resulterende homogenat (er) i 100-300 volumener pi i 0,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C indtil den er klar til at udføre CER analysen.

4. CER Assay

BEMÆRK: CER assay involverer tilsætning af en forholdsvis lille mængde PrP TSE (forudsat i "frø") fra en arttil et relativt overskud af PrP C (tilvejebragt i uinficerede hjerne "substrat") fra en anden art, som er blevet delvist denatureret ved enten pH 3,5 eller 7,4. Efter en forlænget ryster inkubationsperiode skabelon-drevet omdannelse af PrP C ved PrP TSE i hver reaktion vurderet af densitometrisk signal PrP res tilbage efter PK fordøjelse og immunoblot detektion. Sammenligning PrP res niveauer i substraterne tidligere denatureret ved pH 3,5 vs. 7,4 tilvejebringer et mål af arten barriere. En eksperimentel oversigt over dette assay procedure er tilvejebragt i figur 1.

  1. Langsomt tø inficerede CER substrat par (assay kræver lige store volumener af substrater tidligere denatureret ved både pH 3,5 og 7,4) og TSE-inficerede frø løsninger ved at placere dem oven på et leje af is (ca. 1 time tø tid).
  2. Når fuldt optøet, aspireres og derefter udvise hvert substrat løsning gennem en27 g kanyle flere gange for at re-homogenisere det. Kort sonikeres hver TSE-inficerede frø løsning til 10 sek ved ~ 30% maksimal effekt. Hold alle løsninger på is, mens forbereder konvertering reaktioner.
  3. Label 5 individuelle lave bindende, tyndvæggede PCR-rør pr TSE-agens, der testes.
  4. Forbered omdannelsesreaktioner i disse rør ved tilsætning af 5 pi af 10% TSE-inficerede frø opløsning til 95 pi (a) CER substrat fremstillet ved pH 7,4 og (b) CER substrat fremstillet ved pH 3,5.
    1. For hver eksperimentel prøve, forberede parallelle reaktioner i CER substrat par tidligere denatureret ved både pH 3,5 og 7,4.
    2. Optimer nøgletal TSE agent frø til ikke-inficerede hjerne substrat ved hjælp af empiriske beslutsomhed. Fælles frø: substrat-forhold anvendes fastholde en samlet reaktionsvolumen på 100 pi og indbefatter 1:99 pi, 2:98 pi og 5:95 pi. Til de fleste anvendelser, den 5:95 pi frø: substrat volumen-forholdet er passende, og er det, der præsenteres i ther protokol.
  5. Forbered tre kontrolprøver pr TSE-agens, der testes som følger: (a) tilsættes 5 pi 10% TSE-inficerede frø løsning til 95 pi konvertering buffer som en kontrol for input PrP res; tilsættes 5 pi konvertering buffer til 95 pi substrat forberedt på (b) pH 3,5 og (c) pH 7,4 som kontroller til ikke-specifik, ikke-template konvertering.
  6. Kort vortex hver prøve i sin lukkede PCR-rør for at blande frø og substrat godt. Følg med en momentan impuls i en lav hastighed bænk top mini-centrifuge for at fjerne enhver volumen af ​​reaktionsblandingen fanget i PCR-rør låg.
  7. Indlæs prøver i individuelt mærkede PCR-rør i en bænk top termo-shaker udstyret til at acceptere PCR-rør. Ryst prøver ved 1.000 rpm ved 37 ° C i 24 timer.
  8. Efter omrystning tilsættes sarkosyl til en endelig koncentration på 2% (w / v) og PK til en slutkoncentration på 100 ug / ml. Digest prøverne ved 1000 rpm ved 37 ° C i 1 time i termo-shaker.
    NOTE: Tilsætning af sarkosyl til prøver efter konvertering AIDS i PK fordøjelse af PrP C. Falske positive signaler i podede prøver (trin 4.5) er stort set elimineret ved tilsætning af sarkosyl.
  9. Tilføj SDS-PAGE-prøvebuffer, varme prøver til 95 ° C i 5 minutter og løse resterende PrP res i hver prøve ved SDS-PAGE 16 efterfulgt af immunoblotting 17.
    BEMÆRK: Efter tilsætning af prøvebuffer og opvarmning, prøver kan straks forarbejdes eller prøver kan opbevares ved -20 ° C eller -80 ° C forud for immunblotting. Alle data præsenteres her blev genereret ved hjælp af Novex NuPAGE gel og overførselssystemer. Individuelle prøver fra CER assay blev behandlet med prøvebuffer og reduktionsmiddel i henhold til producentens anvisninger. Prøver blev efterfølgende opvarmet ved 95 ° C i 5 minutter og 30 pi af hver prøve blev anbragt i en 12% Bis-Tris præfabrikerede geler.
  10. Beregn virkningsgraden ratio (CER) som et målarternes barriere. Måle niveauet af PrP res ved densitometri 17 og fordele det samlede tæthed af pH 7,4 prøven ved det færdige pH 3,5 prøve. Ganges med 100 for at frembringe en procentdel.
  11. Indsamle data fra uafhængige eksperimentelle gentagelser til at generere en gennemsnitlig CER ± standardafvigelse for en art med en given TSE agent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket anvendelse af CER-analysen er i vid udstrækning afhængig af kvaliteten af ​​de substrat par anvendes i omdannelsesreaktioner. Af denne grund, følgende procedurer til forberedelse CER substrat par, en kvalitetskontrol immunoblot bør udføres (figur 2). For begge substrater, assay 10-25 pi ved immunoblotting. PrP C bør være let påviselige i hvert substrat og PrP C-niveauer skal være omtrent den samme mellem de to. Immunoreaktivitet vil hovedsagelig være synlig over 20 kDa, men mindre bånd kan også være indlysende. Det er vores erfaring, at tilstedeværelsen af ​​mindre bands er arter afhængige. Hvis lavere molekylvægt produkter overholdes, bør deres tilstedeværelse bekræftes i begge substrat par.

Det er vigtigt at sikre, at CER substrater er fri endogene PrP res ved at behandle substrater med PK (figur 2). Hvis PrP res er til stede, det dyr, der anvendes til substforberedelse sats kan være TSE-inficeret eller subklinisk inficeret. Alternativt kan PrP C i substratet har misfoldet til en PK-resistent tilstand under denaturering eller udfældning procedurer. Uafhængig af grunden, CER substrat indeholdende PrP res er ikke acceptabelt til brug i konverteringen analysen.

Laboratorieundersøgelser mus er en af ​​de hyppigst anvendte forsøgsdyr i TSE-forskning; som sådan, deres følsomhed over for de fleste TSE er godt karakteriseret 8, hvilket giver en in vivo benchmark, som at teste nøjagtigheden af CER-analysen. 3A viser resultater af CER assay omdannelse af PrP C fra mus (CD1 stamme) substrat til PrP res med 1) den RML stamme af mus-passage scrapie, en agent er tilpasset musen værten 18, 2) tamfår klassisk scrapie, et middel, der kan overføre til mus efter en lang inkubationstid 18, og 3) whiTe-tailed hjorte (Odocoileus virginianus) CWD og 263K stamme af hamster-passage scrapie, agenter, som mus er minimalt eller ikke modtagelig 19,20. Resulterende PrP res niveauer var variabel tværs mus substrater denatureret ved pH 7,4 og podet med de forskellige TSE-agenser mens PrP res blev fundet i alle underlag denatureret ved pH 3,5 og podet med en TSE-agens. Konvertering nøgletal sammenligner PrP res niveauer i pH 7,4 og 3,5 substrater blev uafhængigt beregnes mindst tre gange og middelværdier ± SD er vist i figur 3B. For reaktioner podet af RML, konvertering nøgletal mellem pH 7,4 og 3,5 substrater var ca. 100%. For dem podet med scrapie, omdannelse i pH 7,4 substratet var ca. 75% af den i pH 3,5 substrat. CWD eller 263K-induceret omdannelse af pH 7,4 substrat var minimal. Kunne ikke skelne en envejs variansanalyse en forskel i konvertering nøgletal fra RML og scrapie eller CWD og 263K, dog konvertering nøgletal for RML og scrapie var signifikant forskellige fra CWD og 263K.

CER assay kan tilpasses til brug med humane væv eller med dyrearter, hvor bioassays er for udfordrende eller ikke etisk og transgene mus produktionen ikke ønsket. Vi har brugt denne analyse til at karakterisere følsomheden af ​​forskellige dyrearter til CWD. Som et eksempel på anvendelsen af dette assay præsenterer vi nogle foreløbige resultater i figur 4. Brains fra Hunter-fanget bobcats (Lynx Rufus) blev fundet stadig indeholde påviselige niveauer af PrP C og PrP nedbrydningsprodukter var ikke omfattende, tyder på, at disse væv kan være en acceptabel kilde til CER substrat (figur 4A). Substrat par genereret fra Bobcat hjernen viste PrP immunreaktivitet af en passende molekylvægt og ikke indeholder endogene PrP res (figur 4B). Når Bobcat CER substrat par genereret fra to særskilte dyr blev inkuberet med det samme hvide virginiahjorte CWD middel anvendt i muse CER assay beskrevet i figur 3, fandt vi substrater fremstillet ved pH 7,4 havde niveauer af PrP res i forhold til substrater fremstillet ved pH 3.5 (figur 4C), indikerer en minimal art barriere af bobcat PrP C til omdannelse af CWD. CER til omdannelse af hvide virginiahjorte PrP C af samme CWD isolat bruges til at konvertere bobcat PrP C her, som en positiv kontrol, er tidligere rapporteret som 95,2 ± 18,4% i Morawski et al. (2013) 15.

Figur 1
Figur 1:. Eksperimentel overblik over CER assay To assay substrater fremstilles ved delvis denaturering PrP C i ikke-prion inficeret hjernevæv wed chaotrope opløsninger ved enten pH 3,5 eller pH 7,4. Substrater podes med PrP TSE fra prion agent af interesse og eksperimentelle prøver udsættes for 24 timers inkubation med omrystning for at tillade PrP C til PrP TSE konvertering i både pH 3,5 og 7,4 substrater. Efter inkubation omdannelse vurderes ved SDS-PAGE og immunoblotting. Signal densiteter aflæses ved densitometri og CER beregnes ved forholdet mellem pH 7,4 til pH 3,5 signal tætheder for hver eksperimentelle prøve.

Figur 2
Figur 2: Kvalitetskontrol på CER substrater. (A) Før deres anvendelse i CER assay, mus substrater fremstillet ved enten pH 7,4 eller 3,5 analyseres ved immunoblot i 1) fravær af PK behandling for at vurdere PrP C indhold i hvert substrat par (PrP C-niveauer bør svare mellem pH 7,4 og 3,5 substra TES til anvendelse i CER-assay) og 2) tilstedeværelse af PK (100 ug / ml) behandling til at teste for eksisterende PrP res i væv anvendes til at fremstille underlag (eventuelle substrater, der viser præ-eksisterende PrP res ikke er egnede til anvendelse i CER assay). (B) til kontrol for ikke-specifik PrP ​​res dannelse under konverteringen assay muse PrP C substrater fremstillet ved enten pH 7,4 eller 3,5 podet med konvertering buffer, rystet i 24 timer ved 1000 rpm, 37 ° C og efterfølgende PK-behandlede (100 ug / ml) og analyseret for PrP res ved immunoblotting (højre to baner). Ikke-rystet repræsenterer ikke-PK behandlede mus substrater alt PrP C-indhold i assay-reaktioner (venstre to baner). For (B), er irrelevante baner blevet beskåret for klarhed, men hver immunoblot panel stammer fra den samme gel, membran og eksponering. Immunoblots i alle paneler anvendes monoklonalt antistof SAF 83.

"> Figur 3
Figur 3:. CER under anvendelse laboratorium mus substrat (A) Mus CER assay substrat forberedt ved enten pH 7,4 eller 3,5 blev inkuberet med RML mus tilpassede scrapie, tamfår klassisk scrapie, hvid-tailed hjorte chronic wasting disease (CWD) eller 263K stamme af hamster tilpasset scrapie i CER assay. Kontrolprøver (mærket "ingen") indeholdt kun en lige mængde smitstof og ingen mus substrat. Prøverne blev analyseret for tilstedeværelsen af PK-resistent prionprotein (PrP res) ved immunoblot med monoklonalt antistof SAF 83. Rå densitometriske værdier for hver prøve er vist nedenfor hver bane. (B) Søjlediagram angiver de gennemsnitlige forhold (± standardafvigelse) mellem pH 7,4 og 3,5 mus substrater for hver smitstof baseret på mindst 3 uafhængige assay runs. Små bogstaver refererer til statistiskhomogene delmængder (variansanalyse med Tukey-Kramer minimum betydning forskelle metode; p <0,05). Dette tal er blevet ændret fra Morawski et al. 2013 15.

Figur 4
Figur 4: Eksempel anvendelse af CER-assay til at undersøge Bobcat modtagelighed for CWD Bobcat hjernehomogenat (A) og CER assay substrat (B) blev testet ved immunblotting i fravær og nærvær af PK (100 ug / ml) for at vurdere eksisterende PrP C. niveauer og tilstedeværelsen af allerede eksisterende PrP res, henholdsvis. (C) Bobcat substrater blev podet med konvertering puffer og analyseret i CER assay til vurdering af ikke-specifik PrP ​​res formation (venstre to baner). Ikke-rystet repræsenterer ikke-PK behandlede Bobcat substrater alt PrP C-indhold i assay reaktioner (højre to baner).(D) Bobcat substrat fremstilles ved enten pH 7,4 eller 3,5 blev inkuberet med havørn hjorte CWD hjælp af CER-analysen. Kontrolprøven (mærket "ingen") indeholdt en lige mængde CWD agent, men ingen bobcat substrat. Rå densitometriske værdier for hver prøve er vist nedenfor hver bane. Immunoblots i alle paneler anvendes monoklonale antistof 3F4, som reagerer med felin prionprotein 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For en vellykket gennemførelse af denne protokol, skal man være opmærksom på PrP C-niveauer i inficerede hjernevæv anvendt til fremstilling substrat (trin 2.1.2) og frø til substrat forhold for reaktioner konvertering (trin 4.4.2). Det er vores erfaring, kan hjerner udvindes til brug som CER substrat efter en længere periode efter slagtningen, så længe PrP C er til stede ved immunoblotting (figur 4). Faktisk blev nogle autolyse observeret i hjernerne hos de Bobcats anvendes til CER studier. Alligevel inkubation af substrater afledt fra disse hjerner stadig resulterede i dannelsen af PrP res. Vi spekulere, at delvis er robustheden af ​​CER assay stammer fra denaturering af CER substrater i 1,5 M GdnHCl, som vil inaktivere mange proteaser.

Frø til substrat forhold kan være nødvendigt at være empirisk fast besluttet på at opnå acceptable PrP res signal ved immunoblotting. For meget eller for little PrP res til at udføre densitometri, høj baggrund PrP res niveauer i kontrolprøver mangler substrat og inkonsekvente konvertering nøgletal er alle grunde til at optimere frø: substrat-forhold. Variationer opretholde et samlet reaktionsvolumen på 100 pi og indbefatter 1:99 pi, 2:98 pi og 5:95 pi. På næsten alle lejligheder har vi fundet, at 5:95 pi frø: substrat volumen forholdet er optimal. Ligegyldigt hvad forholdet er ansat, der anvendes lige store mængder af TSE-agens, og analysen er internt konsistent. Men koncentrationen frø af prion-inficerede hjernehomogenat anvendes til skabelon reaktioner sandsynligvis påvirker resultatet af CER assay at varierende frø titere eller fortyndinger kan resultere i varierende niveauer af PrP C -til-PrP res konvertering. Denne virkning er blevet påvist i andre in vitro prion konvertering assays 22 og kan komplicere sammenligningen af de forskellige prion isolater. For at løse dette i CER analysen, frø could titreres i hver PrP C-substratet fremstillet ved pH 3,5 og 7,4 for at identificere en række fortyndinger skabelonen PrP C konvertering. Ideelle frø fortyndinger undgå mætte opløsningen med overskydende frø prioner og alligevel give indsigt i følsomhed omdannelsesreaktionen. Alternativt kunne måles PrP C -til-PrP res konvertering i CER assay reaktioner på flere, regelmæssige tidspunkter gennem hele analysen og plottet som rate-of-konvertering kurver, beslægtet med den udlæsninger for real-time polymerasekædereaktion ( qPCR) 23 og real-time skælven udløst konvertering (RT-Quic) 24 analyser. Sådanne udlæsninger kan tillade mere omfattende fortolkninger af artsbarrierer og er et interessant fokus i den fremtidige udvikling af denne metode.

I den protokol, der præsenteres her, bruger vi lave bindende, tyndvæggede PCR-rør, men vi har også brugt standard 1,5 ml rør i en termo-shaker udstyret tildenne type rør. Ingen anden ændring i protokollen er nødvendige for at anvende de større størrelse rør. Det er vores erfaring, har vi imidlertid haft mere PrP res produktion og mere reproducerbare resultater i lav-bindende PCR-rør i forhold til 1,5 ml rør. Mens forklaringer på forbedret ydeevne af assayet i PCR-rør er kun spekulation på dette tidspunkt, baseret på resultater indikerer, at luft-vand-grænsefladen er kritisk for PrP fibrillization 25, vi hypotesen, at de mindre rør giver en mere optimal overfladespænding for PrP konvertering.

Måske den største begrænsning for anvendelsen af CER-analysen er at forstå, hvad konvertering nøgletal repræsenterer i form af in vivo artsbarrierer determinanter såsom sygdom penetrans eller længden af inkubationsperioden. Mens øjeblikket ukendt, oversættelse mellem in vitro og in vivo arter barriere faktorer bør blive tydeligere ved fortsat brug af CER-analysen i test Additional TSE artsbarrierer, der allerede er etableret i vivo og vil bidrage til at kvalificere resultater i arter, hvor bioassaydata er ikke tilgængelige. En fordel ved CER assay sammenlignet PMCA er tilstedeværelsen af ​​en intern kontrol for PrP omdannelse, nemlig pH 3,5 substrat, som kan omdannes af en TSE agent. Denne kontrol er af værdi, når det er uklart, hvilken, om nogen, TSE-agenser forårsage misfoldning af en eksotisk værtens PrP C. Den manglende evne til en given vært substrat til at forstærke et specifikt TSE-agens i PMCA kunne fortolkes som bevis for en art barriere eller kan være på grund af tekniske fejl. Ulemper ved CER analysen sammenlignet med PMCA omfatter begrænset forstærkning af PrP res, yderligere skridt i CER forberedelse af underlaget, og ingen kendte infektivitet i PRP res produceret af CER reaktioner. Det skal bemærkes, at der i en tidligere undersøgelse, men vi fandt CER analysen resulterede i en lignende mønster af PrP res formation som for PMCA 15. Resultaterne præsenteret her viser også, at CER analysen korrekt forudsiger de artsbarrierer til transmission af forskellige TSE til laboratoriemus (figur 3), og tyder på, at Bobcats kan have tilbøjelighed til CWD (figur 4) efter aftale med rapporter om, at huskatte (Felis catus) kan erhverve prionsygdom efter eksperimentel CWD udfordring 26,27. Undersøgelser med CER-analysen kunne komplimentere PrP sekventering bestræbelser på at forstå dyreliv modtagelighed for CWD 28.

CER-analysen muliggør hurtig, billig, pålidelig vurdering af TSE artsbarrierer in vitro. Selvom det ikke er en komplet erstatning for "gold standard" af animalsk bioassay kan CER assay anvendes som en første vurdering af, at der findes en TSE arter barriere, som kan berettige eller undgå yderligere undersøgelser i levende dyr. Af denne grund, og fordi assayet beror kunpå hjernevæv, der kan erhverves fra ikke-forsøgsdyr, CER er i overensstemmelse med bestræbelserne på at erstatte, begrænse og forfine dyreforsøg procedurer 29. Ud over vurderingen artsbarrierer kan CER analysen også give en forenklet platform med til at undersøge mekanismerne i den grundlæggende begivenhed definerer prionsygdom biologi: omdannelsen af normale, funktionelle PrP C til en misfoldet form.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a006833 (2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59, (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389, (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9, (3), e89722 (2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39, (4), 32 (2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19, (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3, (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277, (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364, (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1, (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78, (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51, (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5, (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5, (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9, (6), e98753 (2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87, (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7, (12), e50623 (2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. Methuen. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics