En enkel og billig metode til bestemmelse Kolde Følsomhed og tilpasning i mus

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Måling kold lydhørhed hos gnavere er vigtig for at forbedre forståelsen af ​​de potentielle mekanismer i kulde følsomhed hos mennesker under både normale og patologiske tilstande. Den kolde Plantar Assay (CPA), der oprindeligt blev udviklet for flere år siden 1, er designet til at generere reproducerbare, utvetydige murine adfærdsmæssige reaktioner på en kold stimulus leveret ved stuetemperatur. Nyere forbedringer af dette assay har tilladt reproducerbar måling af koldt følsomhed ved en lang række temperaturer 2. Begge versioner er også designet til at være relativt højt gennemløb, og billig at anvende.

En stor del af der er gjort fremskridt i forståelsen af ​​mekanismerne i koldt følsomhed ved hjælp af andre adfærdsmæssige metoder. En fremgangsmåde er acetone fordampning test, som indebærer duppe eller sprøjtning acetone på musen pote og måling af mængden af tid, som musen bruger på at stille pote 3,4. Desværresvarene til acetone fordampning er forvirret af våd fornemmelse og lugten af ​​acetone. Ligeledes kan den kolde stimulus, der anvendes i acetone fordampning test variere baseret på mængden af ​​acetone anvendes, og er vanskelig at kvantificere. Endelig uskadte mus har minimale reaktioner på acetone ved baseline, hvilket gør det umuligt at måle analgesi i fravær af overfølsomhed med denne metode.

En anden klassisk assay til kolde svar er halen svirp assay, hvor latenstiden til tilbagetrækningen er målt efter halen er nedsænket i koldt vand 5,6. Mens de adfærdsmæssige reaktioner i denne analyse er entydige og analysen måler svar på en bestemt temperatur, skal dyrene fastholdes under test, som kan ændre kold lydhørhed gennem velbeskrevne stressinducerede smertestillende mekanismer 7.

En anden almindeligt anvendt værktøj er den kolde plade test, som måler de adfærdsmæssigereaktioner af mus efter de er placeret på et Peltier-kølet plade 8-10. Mens dette værktøj indeholder oplysninger om dyr reaktioner på bestemte temperaturer, er det også blevet inkonsekvent anvendt; forskellige grupper har målt forskellige reaktioner, herunder antal hopper 8,11, latenstiden til første reaktion 8,11- 13, og antallet af pote løfter 11,13,14 med meget forskellige resultater. Den kolde plade assay er også relativt lav gennemløb som kun et dyr kan testes på et tidspunkt, og det kræver et dyrt og skrøbelige Peltier indretning.

2-plade præference temperatur test er en almindeligt anvendt derivat af den kolde plade test, der måler den relative mængde af tid, som dyrene tilbringer på 2 forbundne plader af forskellige temperaturer 9,15- 17. En anden lignende almindeligt anvendt assay er den termiske gradient assay, hvor mængden af ​​tid, at mus tilbringer i forskellige temperaturzonermellem 5 ° C og 45 ° C på en lang metalplade måles 16. Mens disse analyser kunne sammenligne temperaturer, er det uklart, om den adfærd repræsenterer temperaturen aversion eller præference temperatur.

Endelig har den dynamiske kold plade assay blevet anvendt til at måle, hvordan mus reagere på skiftende temperaturer 18. Denne metode indebærer at placere mus på en RT Peltier enhed og rampe ned til 1 ° C under måling, hvor meget musene hoppe eller slikker deres poter ved forskellige plade temperaturer. Mens dette tester hvordan mus tilpasse sig et kølende miljø, betyder det ikke en måde at teste, hvordan mus reagere på en kold stimulus i fastsættelsen af ​​en køligere omgivende temperatur. Derudover kræver dyrt udstyr til at udføre og giver ikke en måde at akklimatisere mus til det udstyr, før måling af deres kolde følsomhed.

For at supplere disse analyser, CPA tester acclimated svar på et veldefineret koldt stimulus på en række temperaturområder, eller i løbet af processen med tilpasning til kolde temperaturer. Det kan teste op til 14 mus ad gangen med vores aktuelle apparat med potentialet til at blive billigt opskaleres for high-throughput test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus protokoller var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og er blevet godkendt af Animal Studies Udvalg Washington University School of Medicine (St. Louis, MO).

1. Forberedelse af Test Plate og kabinetter

  1. Tør glasoverfladen.
  2. Fastgør T-typen filament termoelementprobe til overfladen i midten af ​​glaspladen med laboratorium tape.
  3. Placer indhegninger på glaspladen på en enkelt linje langs midten af ​​pladen.
  4. Tråd termoelement sonde gennem centrum kabinet dyr og stik i dataloggeren. Drej dataloggeren på, mens deaktivering af funktionen auto-shutdown, og fastgør dataloggeren til computeren med det medfølgende kabel.
    1. Hvis du optager pladen temperatur under eksperimentet, skal du åbne datalogger software til at begynde at optage plade temperaturer.
    2. Om nødvendigt justeres softwaren til at reledningen pladetemperaturen gang per sekund.
    3. Begynd optagelsen temperaturer ved hjælp af softwaren, der følger med den termiske datalogger.
  5. Adskil kabinet med sorte indsatser for at forhindre visuel vekselvirkning mellem mus.
  6. Position spejle under glasset, således at undersiden af ​​kabinetter er synlig fra en behagelig siddende position.

2. Warming / Køling glaspladen

  1. Fyld aluminium kasser med opvarmet vand, våd is eller tøris og placere dem korrekt på glaspladen (aluminiumfolie pakker fyldt med tøris, kan også anvendes til at køle glasset; figur 1) 2.
    1. For test ved 30 ° C, placere aluminium kasser ca. 0,25 '' væk fra anlæg til dyr (figur 2B) 2.
      1. Indstil en opvarmet vand cirkulationspumpe på hver side af glaspladen. Indstil cirkulationspumpen til 45-60 ° C, og ose det at fylde aluminium kasser med en lind strøm af varmt vand (figur 1C) 2.
      2. Placér cirkulationspumper sådan, at det varme vand fra aluminium kasser dræner direkte tilbage i reservoiret af cirkulationspumpen på hver side (figur 1C) 2.
    2. For testning ved stuetemperatur, skal du lade felterne tomme (figur 2) 2.
    3. Til test på 17 ° C, placere kasserne ca. 0,25 '' væk fra anlæg til dyr på begge sider, og fyld med våd is (Figur 2) 2.
    4. For test ved 12 ° C, placere kasserne ca. 1,25 '' væk fra kabinetterne på begge sider, og fyld med tøris (Figur 2) 2.
    5. Til testning ved 5 ° C, skal du placere kasserne ca. 0,25 '' væk fra kabinetterne på begge sider, og fyld med tøris (Figur 2) 2.
      1. Når afkøling af glas med tøris, så sørg for at der er tilstrækkelig ventilation for at forhindre CO 2 oprustning i rummet.
  2. Vent glasset at nå den ønskede temperaturområde.
  3. Tilsæt mus til kabinetter på pladen.
    BEMÆRK: En hvid støj generator kan anvendes til at mindske støj forstyrrelser.
  4. Vent på mus for at akklimatisere.
    BEMÆRK: I vores anlæg dette tager ca. 2,5 time, men kan variere betydeligt baseret på stalde og håndteringsforhold.
  5. Oprethold glasset ved den ønskede temperatur ved at sikre, at kasserne holdes fuld af opvarmet vand, våd is eller tøris.
    BEMÆRK: Med vores apparat kasserne skal fyldes med is nogenlunde hver 90 min.
    BEMÆRK: 17 ° C betingelse, er det nyttigt at tømme det meste af vandet fra aluminium kasser gennem drænhuller før genpåfyldning det med is. Dette vil stabilisere temperaturen bedre, og PRbegivenhed overløb
    BEMÆRK: Det nøjagtige beløb for tøris vil variere sæsonmæssigt, men generelt at holde kasserne mere end ¼ fuld langs hele længden af ​​æsken vil holde temperaturen konstant.

3. Test af mus ved faste temperaturer

  1. Uden for adfærdsmæssige rum, fylde en isspand omkring halvt fyldt af tøris.
  2. Ved hjælp af en hammer eller kølle, knuse tøris til et fint pulver.
    BEMÆRK: Overfyldning spanden vil gøre det vanskeligt fuldt ud at knuse tøris til pulver.
  3. Ved hjælp af en lige barberblad eller saks, klippe toppen fra en 3 ml sprøjte.
  4. Ved hjælp af en 21 G nål, stikke 3 huller på modstående sider af sprøjten (i alt 6 huller).
    BEMÆRK: Disse huller vil mindske trykket genereres ved sublimation mens komprimere tøris. Cut-off sprøjte kan genbruges til flere eksperimenter.
  5. Tag sprøjten, tøris pulver, og en håndholdt stopur i adfærdsmæssige rum.
  6. Fyld sprøjte kammer halvt fuld af tøris pulver. Hold den afskårne ende af sprøjten mod en flad genstand, og fast komprimere pulveret ved hjælp af stemplet. Vær forsigtig; plast stemplet kan bøje eller knække fra trykket. Hvis det sker, skal du udskifte stemplet fra en ny sprøjte.
  7. Forlæng spidsen af ​​komprimerede tøris pille forbi kanten af ​​sprøjten.
  8. Test mus, der er fuldt i hvile.
    1. Ved 30 ° C, 23 ° C og 17 ° C, test mus, der har alle 4 poter på glasset og ikke bevæger sig, men ikke helt i søvn 19.
    2. Ved 12 ° C og 5 ° C, test mus, som er på 2 poter eller 4 ben og ikke bevæger sig eller hoppe.
  9. Brug af spejle til målretning, forsigtigt, men fast trykke den flade pille flugter glasoverfladen under musen bagpote (figur 1A) 2. Start hånd-timer.
  10. Stoppe timeren og tag pillen når musen bevæger sig væk fra den afkølede glas.
    BEMÆRK: Bevægelsen tilbagetrækning kan være lodret eller vandret.
    1. Hvis musen meget kort flytter pote og derefter returnerer det til kølefladen, fortsætte timing og stimulere indtil musen gør en permanent flytte væk.
      BEMÆRK: vores laboratorium anvender en maksimal stimulus på 20 sek for mus i de fleste tilfælde.
  11. Gentag denne test procedure indtil mindst 3 værdier på hver pote af hvert dyr opsamles. Separate forsøg afprøver modsatte poter på samme mus med mindst 7 min, og særskilte træk forsøg på en enkelt pote med mindst 15 min.
  12. Hvis det er nødvendigt, bruge forskellige tykkelser af glas til at generere forskellige satser for afkøling (figur 3) 1.
    BEMÆRK: afkølingshastigheden er omvendt korreleret med tykkelsen af ​​glasset.

4. Test af mus under Cold Tilpasning

BEMÆRK: Det er en alternativ protokol, som giver mulighed for prøvning som glasset plate køler, snarere end når pladen er stabiliseret og musene har fuldt tilpasset den kolde omgivelser.

  1. Følg anvisningerne i afsnit 1 til at oprette apparatet.
  2. Følg anvisningerne i afsnit 3 at tage basisliniemålinger ved stuetemperatur (figur 7A) 2.
  3. Pre-køle aluminium kasser med tøris.
  4. Når baseline tilbagetrækning ventetid er blevet målt, placere kølet kasser på pladen ca. 1,25 '' væk fra kabinetter på hver side (figur 7A, pil mærket "Tøris tilføjet") 2.
  5. Følg anvisningerne i afsnit 3 for at tage målinger som glaspladen køler, idet målinger så ofte som muligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De adfærdsmæssige reaktioner fremkaldt fra mus begyndende ved 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C og 12 ° C er meget reproducerbar (figur 4A) 20. For at måle den kolde stimulus, der genereres under bagpote blev musene bedøvet med en ketamin / xylazin / acepromazin cocktail blev sikret deres poter på glasset på toppen af en T-typen filament termoelement (figur 4B) 20. Glasset afkøles eller opvarmes til den ønskede måleområde. Selvom pladen afkøles ensartet langs længden af pladen (figur 5A) 2, skal det bemærkes, at en kold gradient genereres over indhegninger adfærd (figur 5B) 2. De dele af kabinet, der er tættere på tøris på hver side af kabinetterne er køligere, mens de centrale dele er lidt varmere (figur 5B) 2. I de koldeste temperaturer used, musene tilbringer størstedelen af ​​deres tid i den centrale del af skabet. Når glaspladen temperaturen var stabiliseret, blev fokal tøris stimulus placeres på glasset under poten / thermode. Baseret på temperaturen spor optaget fra denne opsætning, er det klart, at de kolde stimuli genereret ved hjælp af CPA er meget reproducerbar ved hvert temperaturområde (figur 4C) 20.

Den kolde stimulus genereres i CPA blev også målt under anvendelse af tre forskellige tykkelser af glas for at variere intensiteten af køling (figur 3). Afkølingshastigheden er omvendt relateret til tykkelsen af glasset, og et af disse tykkelser kan anvendes til at måle kuldefølsomhed efter behov (figur 3).

Tidligere arbejde har vist, at CPA kan detektere analgesi og overfølsomhed hos mus. 30 minutter efter subkutane injektioner af 1,5 mg / kg morfin, har mus betydeligt longer latency til tilbagetrækning end mus, der fik subkutane injektioner af saltvand (figur 6A: 2-vejs ANOVA hovedvirkning * p <0,05 med Bonferroni post-hoc test 30 min ** p <0,01; n = 12 pr gruppe) 1. Ved 60 min efter morfin / saltvand, er der ingen forskel mellem saline- og morfin-injicerede grupper, som er i overensstemmelse med hastigheden af ​​morfin metabolisme i mus.

Komplet Freunds adjuvans (CFA) er tidligere blevet vist at forårsage inflammation og hypersensitivitet efter bagpote injektion 21. Efter CFA injektioner af tilbagetrækning CPA latenstider falde 2 og 3 timer efter injektion (figur 6B: 2-vejs ANOVA vigtigste virkning p <0,001 med Bonferroni post-hoc test; 2 hr * p <0,05, 3 hr ** p <0,01 n = 12 pr gruppe). 4 timer efter CFA injektion blev musene givet subkutane injektioner af 1,5 mg / kg morfin. 30 minutter efter morfininjektion havde både CFA- og saltvandsinjicerede mus øget withdrAwal latenstider i forhold til deres ventetid på 3 timer (figur 6B: 1-vejs ANOVA med Dunnetts post-hoc test CFA 3 timer vs. CFA 4.5 HR $$$ p <0,001, saltvand 3 timer vs. saltvand 4,5 timer $$$ p <0,001). En time senere, når morfin var blevet metaboliseret, CFA-injicerede mus havde igen mindre tilbagetrækning latenstider end saltvandsinjicerede kontrolmus (figur 6B: 2-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test; ** p <0,01) 1.

De fleste pattedyrarter har evnen til at tilpasse deres temperatur følsomhed til at matche deres miljø. In vitro undersøgelser har antydet, at denne tilpasningsproces er afhængig af PIP 2 hydrolyse 22- 24, men tidligere adfærdsmæssige værktøjer var ude af stand til at validere denne hypotese in vivo. Den CPA er i stand til at kvantificere denne tilpasning på to forskellige måder. Ved at teste tilbagetrækning latenstid af mus som glasset køler ( 2. Under normale forhold tilbagetrækning latenstid er uændret som pladen er afkølet, hvilket antyder, at kold tilpasning sker hurtigere end kan kvantificeres med CPA (Figur 7B: 0 min = 12.13 ± 0,8 sek, 30 min = 12,1 ± 1,6 sek, 60 min = 13,2 ± 1,1 sek, 90 min = 10,8 ± 1,2 sek 1-vejs ANOVA med Bonferroni post hoc test p> 0,05, n = 6) 2. Men når musene gives intraplantar injektioner af phospholipase-C inhibitor U73122 25 før pladen afkøles (Figur 7C) deres tilbagetrækning ventetid er faldet, hvilket tyder på, at tilpasningen er svækket (Figur 7D: baseline = 11,29 ± 0,53 sek, 30 min = 8,09 ± 1,17 sek 1-vejs ANOVA med Dunnetts post-hoc test, væsentligste virkning p = 0,02, individuel baseline vs. 30 min p = 0,02, n = 9).

CPA kan også måle ability at tilpasse sig kolde omgivelsestemperaturer over lange perioder. Når vild-type mus testes efter at være akklimatiseret i 3 timer ved 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C eller 12 ° C ved hjælp af CPA tilbagetrækning latenstid er den samme på alle udgangsmaterialer temperaturer, hvilket tyder på, at vildtype- mus tilpasset til koldere omgivelsestemperatur (figur 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 sek, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 sek, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 sek, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 sek, 1- ANOVA med Bonferroni post-hoc test, p> 0,05 n = 6 for 30 ° C, n = 15 for 23 ° C, 17 ° C og 12 ° C): 20. I modsætning til de vildtypemus, som udgangspunkt temperaturen falder den tilbageholdelsesperiode latenstider af TRPM8-KO-mus falde, hvilket tyder på, at de ikke er i stand til at tilpasse deres tærskel svar, der passer til deres omgivelser (Figur 8: 1-vejs gentagne målinger ANOVA med Bonferroni post hoc test; hanner vigtigste virkning p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,004; hunner vigtigste virkning p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 hanner og 11 hunner) 20.

Figur 1
Figur 1. Den kolde Plantar Assay (CPA) apparatet 2. (A) Skematisk til udførelse af CPA. Musene akklimatiseres på en glasplade i plast adfærdsmæssige kabinetter, indtil de er i hvile. Et tøris pellet påføres undersiden af ​​glasset under bagpote, og latenstiden til at udtræde af afkøling glas måles. (B) Billede af CPA apparatet i konfiguration til at afkøle pladen til 5 ° C. Den termiske datalogger er i midten af ​​kabinetterneOg aluminium kasser flankerer kabinettet på begge sider. (C) Billede af CPA apparatet i konfiguration til at opvarme pladen til 30 ° C. Vandet cirkulationspumpe strømmer varmt vand i aluminium feltet, som derefter strømmer ud i afløbet på den side tilbage ind i reservoiret af cirkulatoren. Genbrugt med tilladelse fra Brenner et al. 2014 2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Temperatur af glaspladen under CPA 2. (A) i gennemsnit temperatur tracings af glaspladen under adfærdsmæssige forsøg i CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) Skematisk tegning DEMonstrating hvordan du genererer forskellige temperaturforhold i CPA. Genbrugt med tilladelse fra Brenner et al. 2014 2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Tykkelsen glas er omvendt korreleret med graden af køling 1. (A) Skematisk diagrammer det eksperimentelle design (BD). Temperaturen under kolde plantar stimulus under poten blev målt på alle tre glas tykkelser under normale forhold, og som Styrofoam afstandsstykker magten poten væk fra glasoverfladen. I alle tilfælde afstive poten væk fra glasset forårsagede en dramatisk nedgang i den kolde stimulus målt ved pote (n = 6 pr glastykkelse). ( et al. 2012 1 Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Tilbagetrækning CPA ventetid er konsekvente 20. (A) Gennemsnitlig tilbagetrækning latenstid for mus startende fra 23 ° C, 17 ° C eller 12 ° C. (B) Configuration til at måle CPA kolde stimulus. Den pote af en bedøvet mus er fastgjort på glaspladen med laboratorium tape på toppenaf en T-typen filament termoelement. CPA stimulus er placeret på undersiden af ​​glasset under både pote og termoelement. (C) temperaturer genereret i CPA startende fra 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C eller 12 ° C. De sorte pile repræsenterer de gennemsnitlige tilbagetrækning ventetid for vågne mus i hver tilstand. Genbrugt med tilladelse fra Brenner et al. 2014 2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Glasplade temperaturer er konsistente i CPA 2. (A) termoelement T1 (sort) blev anbragt i midten af pladen. Termoelement t2 (rød) blev anbragt i den adfærdsmæssige kabinet tættest på den højre kant af pladen. Temperaturen tracings og grafen længst til højre (T1-T2) viser næsten identiske temperaturer på T1 og T2 under hele forsøget. (B) termoelement T1 (sort) blev anbragt i midten af pladen. Termoelement t2 (rød) blev anbragt i den centrale adfærdsmæssige kabinet, på væggen tættere tørisen fyldt aluminium bokse. Temperaturen tracings og grafen længst til højre (T1-T2) viser, at der er en ca. 3 ° C forskel mellem T1 og T2, når pladen har nået en stabil temperatur. Genbrugt med tilladelse fra Brenner et al. 2014 2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6
Figur 6. CPA kan måle analgesi og overfølsomhed 1. (A) Subcutaneous injektion af 1,5 mg / kg morfin øger tilbagetrækning latenstid af mus 30 minutter efter injektion (2-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test; 30 min efter injektion ** p <0,01). 60 min efter injektion, er der ingen signifikant forskel mellem morfin-injiceret og saltvandsinjicerede mus. (B) Intraplantar injektion af 10 ul komplet Freunds adjuvans (CFA) nedsætter tilbagetrækning latenstid af mus 2 og 3 timer efter injektion (2-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test; * p <0,05, ** p <0,01). Alle mus blev givet subkutane injektioner af morfin på 4 timer, og alle tilbagetrækning latenstider på 4,5 timer var signifikant højere sammenlignet med 3 timer (1-vejs ANOVA med Dunnet post-hoc test; $$$ p <0,001). 5,5 timer efter injektion af CFA (1,5 timer efter morfin injektion) CFA-injicerede mus havde stadig mindre tilbagetrækning latenstider end saltvandsinjicerede mus (2-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test; ** p <0,01). Genbrugt med tilladelse fraBrenner et al. 2012 1. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Måling kold tilpasning som glaspladen dynamisk køler 20. (A) Skematisk til udførelse af CPA som glaspladen afkøling. Baseline temperaturer måles ved stuetemperatur, de Tøriscontainerne tilsat til pladen, og tilbagetrækningen latenstiden måles som glaspladen afkøler. (B) vildtypemus har samme tilbagetrækning latenstid som glaspladen afkøler, tyder på, at de tilpasser sig køletemperaturer hurtigere kan måles end med CPA (Baseline = 12,8 ± 0,3 sek, 30 min = 13,67 ± 0,9 sek, 60 min = 11,03 ± 1,0 sek, 90 min = 11,31 ± 0,6 sek, n ​​= 3 mus; 1-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test, ingen signifikante forskelle mellem nogen grupper). (C) Skematisk til udførelse af CPA som glaspladen afkøling efter intraplantar injektioner af PLC-hæmmeren U73122 eller kontrol forbindelsen U73343. (D) Mus har en markant lavere tilbagetrækning latenstider mens pladen køling efter U73122 injektion, hvilket tyder på, at U73122 interfererer med evnen til at tilpasse sig køling omgivelsestemperaturer. Genbrugt med tilladelse fra Brenner et al. 2014 20. Denne figur er gengivet med tilladelse fra IASP (IASP). Tallet må ikke gengives til andre formål uden tilladelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

"Figur Figur 8. TRPM8-KO-mus ikke tilpasse sig miljøet køling 20 TRPM8-KO-mus har højere latency tilbagetrækning end vildtype-kuld på alle starttemperaturerne målte (2-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test. *** P < 0,001). Tilbagetrækningen latenstid af TRPM8-KO-mus også falder, når starttemperaturen aftager (1-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test ## p <0,01, ### p <0,001), mens der ikke er nogen væsentlig ændring i tilbagetrækning latens af vildtype kuld som udgangsmateriale temperaturen falder. Genbrugt med tilladelse fra Brenner et al. 2014 20. Denne figur er gengivet med tilladelse fra IASP (IASP). Tallet må ikke gengives til andre formål uden tilladelse. Venligst klikk her for et større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics