En enkel og rimelig metode for å bestemme Cold Følsomhet og Adaptation i Mus

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Måling kald respons hos gnagere er viktig for å øke forståelsen av de potensielle mekanismer for kaldt følsomhet hos mennesker under begge normale og patologiske tilstander. Den kalde plantar Assay (CPA), som opprinnelig ble utviklet for noen år siden en er utformet for å generere reproduserbare, entydige murine atferdsmessige respons til en kald stimulus levert ved RT. Flere nylige forbedringer av denne analysen har tillatt reproduserbar måling av kaldt følsomhet ved et vidt temperaturområde 2. Begge varianter er også utformet for å være forholdsvis høy gjennomstrømning, og billig å bruke.

En stor del av det er gjort framskritt i å forstå mekanismene for kaldt følsomhet med andre atferds metoder. En metode er aceton fordampning test, som innebærer dabbing eller sprøyting aceton på musen labben og måling av mengden av tid som musen bruker på å smekke labben 3,4. Dessverre,svarene på aceton fordampning blir forvirret av den våte følelsen og lukten av aceton. Dessuten kan den kalde stimulus som blir anvendt i aceton fordampning test variere basert på mengden av anvendt aceton, og det er vanskelig å kvantifisere. Endelig uskadde mus har minimal respons på aceton ved baseline, noe som gjør det umulig å måle analgesi i fravær av overfølsomhet med denne metoden.

En annen klassisk analyse for kalde responser er halen flick assay, hvor ventetid til uttak måles etter at halen er nedsenket i kaldt vann 5,6. Mens de atferdsmessige responser i denne analysen er entydige og analysen måler svar på en bestemt temperatur, må dyrene være tilbakeholdne under testing, noe som kan endre kald respons gjennom godt beskrevet stressrelaterte smertestillende mekanismer 7.

En annen vanlig brukt verktøy er kald plate test som måler atferdsresponser hos mus etter at de er plassert på en Peltier-avkjølt plate 8-10. Mens dette verktøyet gir informasjon om dyre svar på bestemte temperaturer, har det også blitt inkonsekvent brukt; ulike grupper har målt ulike typer tiltak, inkludert antall hopp 8,11, ventetid til første reaksjon 8,11- 13, og antall labb løfter 11,13,14 med svært forskjellige resultater. Den kalde plate assay er også relativt lav gjennomstrømning som bare ett dyr kan testes på en gang, og det krever en kostbar og skjør Peltier-enhet.

Den 2-plate temperatur preferanse test er en ofte brukt derivat av den kalde plate test som måler den relative mengden av tid som dyr bruker på 2 sammenhengende plater av forskjellige temperaturer 9,15- 17. En annen lignende som vanligvis brukes assay er den termiske gradient assay, hvor den tid som mus tilbringer i ulike temperatursonersom varierer mellom 5 ° C og 45 ° C på en lang metallplate blir målt 16. Mens disse analysene tillate sammenligning av temperaturer, er det uklart om atferden representerer temperatur aversjon eller til temperatur preferanse.

Endelig har det dynamiske kald plate assay blitt brukt til å måle hvor musene reagere på endringer i omgivelsestemperaturer 18. Denne metoden innebærer å plassere mus på en RT peltier-enhet og ramping det ned til 1 ° C mens måle hvor mye mus hoppe eller slikke sine poter på forskjellige plate temperaturer. Mens dette tester hvordan mus tilpasse seg en avkjølende miljø, gir den ikke en måte å teste hvordan mus svare på en kald stimulans i innstillingen av en kjøligere temperatur. I tillegg, det krever dyrt utstyr for å utføre og gir ikke en måte å akklimatisere mus til testing av utstyr før måling sine kalde følsomhet.

For å komplettere disse analysene, tester CPA den acclimated svar på en veldefinert kaldt stimulus på en rekke temperaturområder, eller i løpet av prosessen med å tilpasse seg kalde temperaturer. Det kan teste opp til 14 mus i en tid med de nåværende apparater, med mulighet for å bli billig skalert opp for high-throughput testing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muse protokoller var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Animal Studies Committee of Washington University School of Medicine (St. Louis, Missouri).

1. Klar Testing Plate og kabinetter

  1. Rengjøre av glassflaten.
  2. Sikre T-type filament termo sonden til overflaten i midten av den glassplate med laboratoriebånd.
  3. Plasser dyret vedlegg på glassplaten i en enkelt linje langs midten av platen.
  4. Tråd termokoblingsproben gjennom sentrum dyr kabinett og plugge inn i datalogger. Slå dataloggeren på mens deaktivere auto-shutdown funksjonen, og legge ved dataloggeren til datamaskinen med den medfølgende kabelen.
    1. Hvis du tar opp tallerkenen temperatur under forsøket, åpne data logger programvare for å begynne innspillingen plate temperaturer.
    2. Juster om nødvendig programvare for å reledningen platetemperatur gang hvert sekund.
    3. Begynne innspillingen temperaturer ved hjelp av programvaren som følger med termisk datalogger.
  5. Separer kabinettet med svarte setter inn for å hindre visuell interaksjon mellom mus.
  6. Posisjon speil under glasset slik at undersiden av kabinettene er synlig fra en komfortabel sittestilling.

2. Oppvarming / Kjøling glassplaten

  1. Fyll aluminiumbokser med oppvarmet vann, våt is eller tørris og plassere dem på riktig måte på glassplate (aluminium folie pakker fylt med tørris kan også brukes til å avkjøle glasset; figur 1) 2.
    1. For testing ved 30 ° C, plassere aluminiumsbokser ca 0,25 '' vekk fra dyret vedlegg (figur 2B) 2.
      1. Still et oppvarmet vannsirkulasjonspumpe på hver side av glassplaten. Still sirkulasjonspumpe til 45 - 60 ° C, og osse den til å fylle aluminiumbokser med en jevn strøm av varmt vann (figur 1C) 2.
      2. Plasser sirkulatorer, slik at varmt vann fra aluminiumbokser drenerer direkte tilbake til reservoaret av sirkulatoren på hver side (figur 1C) 2.
    2. For testing ved RT, la boksene tomt (figur 2) 2.
    3. For testing ved 17 ° C, plasserer boksene ca 0,25 '' vekk fra dyret vedlegg på hver side og fyll med våt is (figur 2) 2.
    4. For testing ved 12 ° C, plasserer boksene ca 1,25 '' unna kabinetter på hver side og fyll med tørris (figur 2) 2.
    5. For testing ved 5 ° C, plasserer boksene ca 0,25 '' unna kabinetter på hver side og fyll med tørris (figur 2) 2.
      1. Når kjøling glasset med tørris, sørge for at det er tilstrekkelig ventilasjon for å forhindre CO 2 buildup i rommet.
  2. Vent til glasset for å nå ønsket temperaturområde.
  3. Legg musene til vedleggene på tallerkenen.
    MERK: En hvit støygenerator kan anvendes for å redusere støyforstyrrelser.
  4. Vent til mus for å akklimatisere seg.
    MERK: I anlegget vårt dette tar ca 2,5 time, men dette kan variere betydelig basert på dyr bolig og håndteringsforhold.
  5. Opprettholde glasset i ønsket temperaturområde ved å sikre at boksene holdes full av oppvarmet vann, våt is eller tørris.
    MERK: Med vår apparat boksene må fylles med is omtrent hvert 90 min.
    MERK: For 17 ° C tilstand, er det nyttig å tømme det meste av vannet fra aluminiumsbokser gjennom dreneringshull før du fyller det med is. Dette vil stabilisere temperaturen bedre, og PRhendelse overløp
    MERK: Den nøyaktige mengden av tørris vil variere sesongmessig, men generelt holde boksene flere enn ¼ fulle langs hele lengden av boksen vil holde temperaturen konstant.

3. Testing musene på Faste Temperaturer

  1. Utsiden av atferds rom, fylle en isbøtte omtrent halvfull av tørris.
  2. Ved hjelp av en hammer eller klubbe, knuse tørris til et fint pulver.
    MERK: Overfylling av bøtte vil gjøre det vanskelig å fullt knuse tørris til pulver.
  3. Ved hjelp av en rett barberblad eller saks, kuttet toppen av en 3 ml sprøyte.
  4. Ved å bruke en 21 G nål, rote tre hull på motsatte sider av sprøyten (totalt 6 hull).
    MERK: Disse hullene vil minske trykket som genereres ved sublimering, mens komprimering av tørris. Cut-off sprøyte kan gjenbrukes for flere eksperimenter.
  5. Ta sprøyten, tørris pulver, og en håndholdt stoppeklokke inn i atferds rom.
  6. Fyll sprøyten kammeret halvfull av tørris pulver. Hold den kappede enden av sprøyten mot en flat gjenstand, og fast komprimere pulveret ved hjelp av stempelet. Vær forsiktig; plast stempelet kan bøyes eller brekke fra trykket. Hvis dette skjer, må du skifte stempelet fra en ny sprøyte.
  7. Forlenge spissen av komprimerte tørris pellets forbi kanten av sprøyten.
  8. Test mus som er fullt i ro.
    1. Ved 30 ° C, 23 ° C og 17 ° C, test mus som har alle fire labber på glasset og ikke flytting, men ikke fullt sover 19.
    2. Ved 12 ° C og 5 ° C, test mus som er på to poter eller fire poter og ikke beveger seg eller hopping.
  9. Ved hjelp av speil for målretting, forsiktig, men bestemt trykk på flat pellet flush mot glassoverflaten under muse bakpote (figur 1A) 2. Starte hånden utløseren.
  10. Stoppe tidtakeren og fjern pellet når musen beveger seg bort fra den avkjølte glass.
    MERK: Tilbaketrekningen bevegelse kan være vertikal eller horisontal.
    1. Hvis musen beveger seg svært raskt på labben og deretter går den tilbake til kjøleflate, fortsetter timing og stimulere til musen gjør en permanent overgang bort.
      MERK: Vår lab bruker maks stimulans tid på 20 sek for mus i de fleste tilfeller.
  11. Gjenta denne testprosedyre før minst tre verdier på hver pote av hvert dyr er samlet. Separate utprøvning motsatte labbene på samme mus med minst 7 min, og separate påfølgende forsøk på noen enkelt pote med minst 15 min.
  12. Hvis det er nødvendig, bruker ulike tykkelser av glass for å generere ulike satser for kjøling (figur 3) 1.
    MERK: kjølehastigheten er omvendt korrelert med tykkelsen av glasset.

4. Teste Mus Under Cold Adaptation

MERK: Dette er en alternativ protokoll som tillater testing som glasset plate kjøler, heller enn en gang platen har stabilisert seg og at mus har fullt tilpasset til kalde omgivelser.

  1. Følg instruksjonene oppført i punkt 1 for å sette opp apparatet.
  2. Følg instruksjonene som er oppført i avsnitt 3 for å ta basismålinger ved RT (figur 7A) 2.
  3. Pre-kjøle aluminiumbokser med tørris.
  4. Når baseline abstinensventetider har blitt målt, plassere forkjølte boksene på plate ca 1,25 '' unna kabinetter på hver side (figur 7A, pil merket "Tørris lagt") 2.
  5. Følg instruksjonene som er oppført i avsnitt 3 for å ta målinger som glassplaten kjøler, ta målinger så ofte som mulig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De atferdsrespons oppnådd fra mus som starter ved 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C og 12 ° C er meget reproduserbar (figur 4A) 20. For å måle den kalde stimulus blir generert under bakpote, ble musene bedøvet med en ketamin / xylazin / acepromazin cocktail og potene ble sikret på glass på toppen av en T-type filament termo (Figur 4B) 20. Glasset ble avkjølt eller oppvarmet til den ønskede testområdet. Selv om platen avkjøles jevnt langs lengden av platen (figur 5A) 2, bør det bemerkes at en kald gradient er generert på tvers av atferds kabinettene (Figur 5B) 2. De delene av kabinettet som er nærmere den tørris på hver side av kabinettene er kjøligere, mens de sentrale delene er litt varmere (Figur 5B) 2. I de kaldeste temperaturene used, musene tilbringer mesteparten av sin tid i de sentrale delene av kabinettet. Når glassplaten temperaturen hadde stabilisert seg, ble en fokal tørris stimulus plassert på glasset under labben / thermode. Basert på temperatur spor tatt opp fra dette oppsettet, er det klart at de kalde stimuli generert ved hjelp av CPA er svært reproduserbare ved hvert temperaturområde (Figur 4C) 20.

Den kalde stimulus generert i CPA ble også målt ved anvendelse av tre forskjellige tykkelser av glass for å variere intensiteten av kjølingen (figur 3). Kjølehastigheten er omvendt relatert til tykkelsen av glasset, og noen av disse tykkelser kan brukes til å måle kald sensitivitet etter behov (figur 3).

Tidligere arbeid har vist at CPA kan detektere analgesi og hypersensitivitet i mus. 30 minutter etter subkutan injeksjon av 1,5 mg / kg av morfin, mus har vesentlig longer ventetid til tilbaketrekking enn mus som fikk subkutane injeksjoner av saltvann (Figur 6A: 2-veis ANOVA viktigste effekten * p <0,05 med Bonferroni post-hoc test, 30 min ** p <0,01; n = 12 per gruppe) 1. Ved 60 minutter etter morfin / saltløsning, er det ingen forskjell mellom saline- og morfin-injiserte grupper, som er i overensstemmelse med frekvensen av morfin metabolisme hos mus.

Komplett Freund adjuvans (CFA) har tidligere vist seg å føre til betennelse og overfølsomhet etter bakpote injeksjon 21. Etter CFA injeksjoner, de CPA abstinensventetider reduseres to og tre timer etter injeksjon (Figur 6B: 2-veis ANOVA viktigste effekten p <0,001 med Bonferroni post-hoc test, to timers * p <0,05, 3 t ** p <0,01 n = 12 per gruppe). 4 timer etter at CFA injeksjon ble musene gitt subkutane injeksjoner av 1,5 mg / kg morfin. 30 min etter morfin injeksjon, hadde både CFA- og saltvann-injisert mus økt withdrAwal ventetider i forhold til sine ventetider på 3 timer (Figur 6B: 1-veis ANOVA med Dunnetts post-hoc test, CFA 3 hr vs. CFA 4,5 hr $$$ p <0,001, saltvann 3 hr vs. saltvann 4,5 hr $$$ p <0,001). En time senere, når morfin var blitt metabolisert, CFA-injiserte mus en gang hadde lavere uttaksventetider enn saltvann-injiserte kontrollmus (Figur 6B: 2-veis ANOVA med Bonferroni post hoc-test; ** p <0.01) 1.

De fleste pattedyrarter har evnen til å tilpasse sin temperaturfølsomhet som møter deres miljø. In vitro studier har foreslått at dette tilpasningsprosessen er avhengig av PIP to hydrolyse 22- 24, men tidligere atferds verktøy ikke var i stand til å validere denne hypotesen in vivo. Den CPA er i stand til å kvantifisere denne tilpasningen på to forskjellige måter. Ved å teste tilbaketrekking latens hos mus som glasset er avkjølt ( to. Under normale forhold tilbaketrekking ventetid er uendret som plate kjøler, noe som tyder på at kald tilpasning skjer raskere enn det som kan kvantifiseres med CPA (Figur 7B: 0 min = 12.13 ± 0,8 sek, 30 min = 12,1 ± 1,6 sek, 60 min = 13.2 ± 1,1 s, 90 min = 10,8 ± 1,2 sek en-veis ANOVA med Bonferroni post hoc-test p <0,05, n = 6) 2. Men når mus er gitt ålen injeksjoner av fosfolipase-C hemmer U73122 25 før platen er avkjølt (figur 7C) sine abstinensventetider er redusert, noe som tyder på at tilpasningen er svekket (Figur 7D: baseline = 11.29 ± 0.53 sek, 30 min = 8.09 ± 1.17 sekunder; en-veis ANOVA med Dunnetts post-hoc test, hoved effekt p = 0,02, individuell baseline vs. 30 min p = 0,02, n = 9).

CPA kan også måle ability å tilpasse seg kalde temperaturer over lange tidsperioder. Når vill-type mus blir testet ved hjelp av CPA etter å ha blitt akklimatisert i 3 timer ved 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C eller 12 ° C til tilbaketrekning ventetid er den samme på alle utgangstemperaturer, noe som tyder på at villtype- mus tilpasset den kaldere omgivende temperatur (Figur 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 sek, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 sek, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 sek, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 sek, 1- veis ANOVA med Bonferroni post-hoc-test, p> 0,05 n = 6 til 30 ° C, n = 15 til 23 ° C, 17 ° C og 12 ° C) 20. I motsetning til de villtype mus, som utgangstemperaturen synker abstinensventetider av TRPM8-KO mus avta, noe som tyder på at de ikke klarer å tilpasse sine svar terskel for å passe deres miljø (Figur 8: 1-veis gjentatte tiltak ANOVA med Bonferroni post- hoc test; hanner viktigste effekten p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C, p = 6 x 10 -5, 17 ° C sammenlignet med 23 ° C, p = 0,004; hunner viktigste effekten p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 9.25 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 hanner og 11 hunner) 20.

Figur 1
Figur 1. Cold Plantar analysen (CPA) apparat to. (A) Skjematisk for å utføre CPA. Mus er akklimatisert på en glassplate i plast atferds kabinetter til de er i ro. En tørris pellets tilføres til undersiden av glasset under bakpote, og latensen til å trekke seg fra kjøle glasset blir målt. (B) Bilde av CPA apparat, i konfigurasjonen for å kjøle plate til 5 ° C. Den termiske datalogger er i sentrum av kabinetteneOg aluminiumsbokser flanke kabinettet på hver side. (C) Bilde av CPA apparat, i konfigurasjon for å varme platen til 30 ° C. Vannet sirkulator strømmer varmt vann inn i aluminiumboksen, som deretter strømmer ut i avløp på siden tilbake i reservoaret i sirkulatoren. Gjenbrukes med tillatelse fra Brenner et al. 2014 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Temperaturen av glassplaten under CPA 2. (A) fordelt temperatur tracings av glassplaten under atferdsmessige eksperimenter i CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C, n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) Skjematiske diagrammer DEMonstrating hvordan å generere de forskjellige temperaturforhold i CPA. Gjenbrukes med tillatelse fra Brenner et al. 2014 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Glasstykkelsen er inverst korrelert med graden av kjøling 1. (A) Skjematisk diagram av eksperimentell design (BD). Temperaturen i kaldt plantar stimulus under poten ble målt på alle tre glass tykkelser under normale forhold, og som Styrofoam avstandsstykker propping labben bort fra glassoverflaten. I alle tilfeller, propping labben bort fra glasset forårsaket en dramatisk reduksjon i den kalde stimulus måles på poten (n = 6 per glasstykkelse). ( et al. 2012 1 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. CPA abstinensventetider er konsistente 20. (A) Gjennomsnittlig uttak ventetid for mus med start fra 23 ° C, 17 ° C eller 12 ° C. (B) Configuration å måle CPA kaldt stimulans. Labben av en bedøvet mus er sikret på glassplaten med laboratorie tape på toppenav en T-type filament termo. CPA stimulus er plassert på undersiden av glasset under både labben og termoelement. (C) temperaturer som genereres i CPA fra 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C eller 12 ° C. De svarte pilene representerer den gjennomsnittlige uttaksventetider for våken mus i hver tilstand. Gjenbrukes med tillatelse fra Brenner et al. 2014 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Glassplate temperaturer er konsistent i CPA-2. (A) Termoelement t1 (sort) ble plassert i sentrum av platen. Termoelement t2 (rød) ble plassert i atferds kabinett nærmest den høyre kanten av tallerkenen. Temperatur tracings og grafen til høyre (T1-T2) viser nesten identiske temperaturer på t1 og t2 i løpet av eksperimentet. (B) Termoelement t1 (sort) ble plassert i sentrum av platen. Termoelement t2 (rød) ble plassert i den sentrale atferds kabinett, ved veggen nærmere de tørre isfylte aluminiumbokser. Temperatur tracings og grafen lengst til høyre (T1-T2) viser at det er en omtrent 3 ° C forskjell mellom t1 og t2 når platen har nådd en stabil temperatur. Gjenbrukes med tillatelse fra Brenner et al. 2014 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. CPA kan måle analgesi og overfølsomhet en. (A) Subcutaneous injeksjon av 1,5 mg / kg morfin øker tilbaketrekking ventetid på mus 30 minutter etter injeksjon (2-veis ANOVA med Bonferroni post hoc-test; 30 min etter injeksjon ** p <0,01). 60 minutter etter injeksjon, er det ingen signifikant forskjell mellom morfin-injisert med saltløsning og injisert mus. (B) injeksjon i fotsålen på 10 ul komplett Freunds adjuvans (CFA) senker tilbaketrekking latens hos mus 2 og 3 timer etter injeksjon (2-veis ANOVA med Bonferroni post hoc-test; * p <0,05, ** p <0,01). Alle mus ble gitt subkutane injeksjoner av morfin i 4 timer, og alle uttaks latenstid på 4,5 timer var signifikant høyere sammenlignet med 3-t (1-veis ANOVA med Dunnet post-hoc-test; $$$ p <0,001). 5,5 time etter injeksjonen av CFA (1,5 timer etter morfininjeksjon), CFA-injiserte mus fortsatt hadde lavere uttaksventetider enn saltvann-injiserte mus (2-veis ANOVA med Bonferroni post hoc-test; ** p <0,01). Gjenbrukes med tillatelse fraBrenner et al. 2012 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Måling av kald tilpasning som glassplaten dynamisk kjøler 20. (A) Skjematisk for utførelse av CPA som glassplaten er kjøling. Grunnlinje temperaturer måles ved RT, tørris beholdere legges til platen, og tilbaketrekningen latens blir målt som glassplaten er avkjølt. (B) Vill-type mus har den samme uttaks latens som glassplaten er avkjølt, noe som tyder på at de tilpasser seg kjøletemperaturer raskere enn det som kan måles med CPA (Baseline = 12,8 ± 0,3 sek, 30 min = 13,67 ± 0,9 s, 60 min = 11.03 ± 1,0 sek, 90 min = 11.31 ± 0,6 sek, n ​​= 3 mus; En-veis ANOVA med Bonferroni post-hoc test, ingen signifikante forskjeller mellom noen grupper). (C) Skjematisk for utførelse av CPA som glassplaten er kjøling, etter ålen injeksjoner av PLS-inhibitor U73122 eller kontrollforbindelsen U73343. (D) Mus har betydelig lavere uttaks latenstid mens platen avkjøling etter U73122-injeksjon, noe som tyder på at U73122 interfererer med evnen til å tilpasse seg til avkjøling omgivelsestemperaturer. Gjenbrukes med tillatelse fra Brenner et al. 2014 20. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra International Association for Study of Pain (IASP). Figuren kan ikke gjengis til andre formål uten tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 8. TRPM8-KO mus ikke tilpasse seg miljø kjøling 20 TRPM8-KO mus har høyere uttaksventetider enn villtype kullsøsken på alle start temperaturer målt (to-veis ANOVA med Bonferroni post-hoc test;. *** P < 0,001). Tilbaketrekking latency av TRPM8-KO mus også reduseres når start temperaturen synker (en-veis ANOVA med Bonferroni post-hoc test, ## p <0,01, ### p <0,001), mens det er ingen vesentlig endring i uttaket latens av vill-type kullet som utgangs temperaturen synker. Gjenbrukes med tillatelse fra Brenner et al. 2014 20. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra International Association for Study of Pain (IASP). Figuren kan ikke gjengis til andre formål uten tillatelse. Vennligst CLICk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics