मस्तिष्क गतिविधि के मेसोस्केल वाइड-फील्ड ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए एक बड़े पार्श्व क्रैनीओटमी प्रक्रिया

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Neuroscience

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Summary

यह प्रोटोकॉल माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स के अस्थायी और पार्श्विका क्षेत्रों पर एक बड़ी एकतरफा craniotomy बनाने के लिए विधि प्रस्तुत करता है। यह एक cortical गोलार्द्ध के एक विशाल क्षेत्र में वास्तविक समय इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

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Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity. J. Vis. Exp. (123), e52642, doi:10.3791/52642 (2017).

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Abstract

Craniotomy इन विवो प्रयोगों के लिए मस्तिष्क को बेनकाब करने के एक सामान्य प्रदर्शन किया प्रक्रिया है। माउस अनुसंधान में, सबसे प्रयोगशालाओं एक छोटे से craniotomy, आमतौर पर 3 मिमी x 3 मिमी का उपयोग करें। यह प्रोटोकॉल एक काफी बड़ा 7 मिमी x 6 मिमी कपाल माउस अस्थायी और पार्श्विका cortices पर एक मस्तिष्क गोलार्द्ध के सबसे उजागर खिड़की बनाने के लिए विधि का परिचय (- 4.5 मिमी, पार्श्व 0 - 6 मिमी जैसे, 2.5 bregma)। इस सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए, सिर लगभग 30 डिग्री झुका किया जाना चाहिए और लौकिक पेशी के बहुत से मुकर जाना चाहिए। हड्डी को हटाने की बड़ी राशि के कारण, इस प्रक्रिया केवल पशु शल्य चिकित्सा और प्रयोग के दौरान संज्ञाहरण के साथ तीव्र प्रयोगों के लिए करना है।

इस अभिनव बड़े पार्श्व कपाल खिड़की का मुख्य लाभ यह कॉर्टेक्स के दोनों औसत दर्जे का और पार्श्व क्षेत्रों के लिए एक साथ अभिगम प्रदान करना है। इस बड़े एकतरफा कपाल खिड़की कोशिकाओं के बीच तंत्रिका गतिकी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है,साथ ही बहु इलेक्ट्रोड electrophysiological रिकॉर्डिंग, न्यूरोनल गतिविधि (जैसे, आंतरिक या बाह्य इमेजिंग), और optogenetic उत्तेजना की इमेजिंग के संयोजन के द्वारा विभिन्न cortical क्षेत्रों के बीच के रूप में। साथ ही, इस बड़े craniotomy भी cortical रक्त वाहिकाओं के एक बड़े क्षेत्र को उजागर करता है, पार्श्व cortical वाहिका संरचना के सीधे प्रभाव के लिए अनुमति देता है।

Introduction

craniotomy एक मानक neuroscientists द्वारा इस्तेमाल होने वाली मस्तिष्क के एक हिस्से को प्रकट करने के लिए प्रक्रिया है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सुबह के बाद से, craniotomy तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में अभूतपूर्व सफलताओं अनुमति दी गई है। इलेक्ट्रोड के साथ सेरेब्रल कॉर्टेक्स के घने मानचित्रण प्रयोगों परीक्षण परिकल्पना और सिद्धांतों इन नक्शों के आधार पर करने के लिए प्रेरित किया है। हमने हाल ही में एक नए युग जहां craniotomy cortical रक्त के प्रवाह को 1, 2, 3 और न्यूरोवैस्कुलर वास्तुकला 4 में vivo इमेजिंग के लिए किया जा रहा है, उजागर क्षेत्रों 5, 6, 7 के भीतर cortical गतिविधि के वास्तविक समय दृश्य को सक्षम करने में प्रवेश किया है। हालांकि कई अध्ययनों संरचना और cortical न्यूरॉन्स, glia के समारोह, और कोर अध्ययन करने के लिए इन विवो ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के साथ संयुक्त craniotomies का उपयोग8 , 9 , टेलीक vasculature, आगे की जांच उजागर प्रांतस्था के छोटे क्षेत्रों (लेकिन देखें 10 ) द्वारा सीमित हैं।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक बड़े पार्श्व क्रैनीओटमी बनाने के लिए एक विधि प्रदान करना है, जो मस्तिष्क संबंधी कोर्टेक्स को स्क्वैमासेल हड्डी से मध्यवर्ती से उजागर करता है, और ब्रॉम्मा और लैम्ब्डा से परे का विस्तार करता है। यह बड़ी क्रानोयोटीमी एसोसिएशन cortices (रेट्रोप्लेनियल, सिंगुलेट और पिरियैटल), प्राथमिक और माध्यमिक मोटर, somatosensory, दृश्य और श्रवण प्रांतस्था के एक साथ देखने के लिए सक्षम बनाता है। इस पद्धति को पहले वोल्टेज संवेदनशील डाई इमेजिंग (वीएसडीआईआई) के साथ युग्मित किया गया है कि यह जांच करने के लिए कि सहज और उत्तेजना से प्रेरित cortical गतिविधि 5 , 11 , 12 के दौरान कितने कॉर्टिकल क्षेत्र एक दूसरे के साथ सहभागिता करते हैं। इस प्रक्रिया के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं सिर की स्थितिजानवर की, सिर प्लेट फिक्सिंग, और नकसीर से परहेज पार्श्विका हड्डी से अस्थायी मांसपेशी विभाजित किया। देखभाल भी एक परोक्ष कोण पर खोपड़ी घटता के रूप में ड्रिलिंग और खोपड़ी को हटाने की प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल Lethbridge पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय (एसीसी) दिशानिर्देशों का पालन करता है, और पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद (CCAC) के मानकों के अनुसार किया जाता है।

1. तैयारी

  1. लंबे समय तक अध्ययन अवधि के लिए, सभी खोला शल्य आपूर्ति आटोक्लेव और यह सुनिश्चित करें कि बाँझपन सर्जरी भर बनाए रखा है। कई सर्जरी की आवश्यकता होती है, तो सर्जरी के बीच आटोक्लेव।
  2. सुनिश्चित करें हाथ पर मस्तिष्क बफर के बहुत सारे (कम से कम 50 एमएल) है। समाधान 134 मिमी सोडियम क्लोराइड, 5.4 मिमी पोटेशियम, 1 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate, 1.8 मिमी कैल्शियम क्लोराइड dihydrate, और 5 मिमी HEPES सोडियम, 5 एम हाइड्रोजन क्लोराइड के साथ पीएच 7.4 करने के लिए संतुलित के शामिल है।
  3. एक प्रेरण कक्ष में माउस रखें और 3 के साथ anesthetize - 4 isoflurane%। सर्जरी के दौरान रखरखाव के लिए 2.0% isoflurane - 1.0 के साथ पालन करें। इमेजिंग के दौरान 0.8% - इसके अलावा जितनी कम 0.4 को कमरों = "xref"> 5, 13, 14, 15, प्रदान की उचित संज्ञाहरण बनाए रखा है। संज्ञाहरण के इन निम्न स्तर माउस (लगभग हर 5 मिनट) के सतर्क और लगातार निगरानी की आवश्यकता होती है यह दर्दनाक उत्तेजनाओं को areflexic रहता है सुनिश्चित करने के लिए।
    ध्यान दें: निर्जलीकरण माउस की मात्रा के अनुपात के उच्च सतह की वजह से समस्या पैदा करने वाले हो जाते हैं और isoflurane की लंबे समय तक उपयोग भी बढ़ सकता है।
    1. 2 घंटे - नमक की चमड़े के नीचे इंजेक्शन, प्रति 10 ग्राम शरीर के वजन 0.1 एमएल, हर 1 का प्रयोग करें। 2 घंटे - जब पर्याप्त रूप से हाइड्रेटेड, माउस एक बार हर 1 पेशाब होगा।
  4. बारीकी से माउस की निगरानी सर्जरी और इमेजिंग में एक जैसा संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए। माउस पहुंच से बाहर छोड़ने के लिए और ध्यान रखना है कि यह होश आता है कभी नहीं है।
  5. सिर धारक सेट अप और एक थर्मामीटरों को विनियमित हीटिंग पैड 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पर जगह पर anesthetized माउस स्थानांतरित करें। ऊपरी teet सुरक्षितएक दांत धारक में एच।
  6. बाईं ओर माउस के सिर घुमाएँ लगभग 30 डिग्री सिर के दाहिने पार्श्व पक्ष बेनकाब करने के लिए और कान सलाखों (चित्रा 1 ए) के कुंद अंत के साथ माउस के सिर सुरक्षित है।
  7. कॉर्निया सुखाने को रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
  8. प्रमस्तिष्क फुलाव को कम करने के डेक्सामेथासोन (4 मिलीग्राम / किग्रा) पेशी इंजेक्षन।
  9. 4% chlorhexidine (3 बार) और 70% इथेनॉल (3 बार) में डूबा हुआ कपास के फाहे साथ शल्य क्षेत्र में त्वचा साफ कर लें। केवल एक बार प्रत्येक कपास पट्टी का उपयोग करें।
  10. डॉन शल्य दस्ताने और साथ चिपकने वाला प्लास्टिक रैप पशु कवर किया। subcutaneously craniotomy साइट पर; - (2% एपिनेफ्रीन 10 मिलीग्राम / किग्रा 8) lidocaine के इंजेक्शन लगाने के द्वारा स्थानीय संवेदनाहारी प्रदान करें। 5 मिनट के लिए दवा के ऊतकों में अवशोषित किया जा करने के लिए - 3 प्रतीक्षा करें।

2. त्वचा निकाल रहा है और खोपड़ी से स्नायु को वापस लेना

  1. एक के तहत खोपड़ी को देखते हुए इन प्रक्रियाओं के लगभग सभी को पूरा करेंचीर-फाड़ माइक्रोस्कोप (जैसे, 0.7 - 4.5X बिजली, स्थिति के आधार पर)।
  2. संदंश के साथ त्वचा 1 मिमी मध्य रेखा (सिर्फ कान के पीछे) के बाएँ उठाकर शल्य कैंची के साथ एक छोटे से क्षैतिज चीरा बनाने।
  3. 6 मिमी दाएं कान की ओर पार्श्व कटौती, और फिर सिर के व्याख्यान चबूतरे वाला अंत में कटौती - एक 5 बनाओ।
  4. प्रारंभिक चीरा बिंदु पर, कैंची डालें और 10 मिमी rostrally काटा।
  5. दाएं कान के आसपास की त्वचा कट और दाईं आंख के पास खोपड़ी और लौकिक पेशी के दाईं ओर बेनकाब करने के लिए। सुनिश्चित करें कि संपर्क में क्षेत्र के सबसे चौड़े हिस्से में कम से कम 7 मिमी है। त्वचा आगे ट्रिम शल्य क्षेत्र बढ़ाया जा करने की जरूरत है।
  6. खोपड़ी और त्वचा के बीच ब्यूटाइल cyanoacrylate गोंद की कुछ बूँदें डाल कर चीरा के आसपास की त्वचा को ठीक करें। ऊतक सुनिश्चित करें कि पहले कपास टिप applicators या लुढ़का ऊतकों के साथ सूखे की गई है चिपकने वाला की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए।
  7. एक कपास पट्टी का उपयोग करना, सतह रगड़नाएक परिपत्र गति में खोपड़ी की खोपड़ी से periosteum दूर करने के लिए। सुनिश्चित करें कि कोई भी खोपड़ी पूरी तरह से सुखाने से बनी हुई है।
  8. वसंत कैंची और संदंश का प्रयोग, खोपड़ी से अस्थायी मांसपेशियों को अलग; कटौती और पार्श्व मांसपेशियों वापस लेना squamosal हड्डी (चित्रा 1C) तक पहुंच गया जब तक। अत्यधिक ध्यान सतही लौकिक नस कि आंख के पास squamosal हड्डी के स्तर के साथ चलाता नुकसान न ले लो, नहीं तो हो सकता है ख़ून का बहाव।
  9. नियंत्रण जेल फोम मस्तिष्क बफर में पूर्व भिगो के साथ खून बह रहा है। गंभीर hemorrhaging के लिए एक गर्मी cauterizer का उपयोग करें। गर्मी cauterizer साथ उपचार के बाद खून बह रहा है साइटों पर ब्यूटाइल cyanoacrylate गोंद ड्रॉप। सुनिश्चित करें क्षेत्र कपास टिप applicators या लुढ़का ऊतकों का उपयोग कर चिपकने वाला की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए द्वारा पहले से सुखाया जाता है।

3. Craniotomy

ध्यान दें: सर्जन खोपड़ी को हटाने के दौरान मेहनती रहना चाहिए औरड्यूरा अनावश्यक जटिलताओं से बचने के। समस्या निवारण चरण चाहिए जटिलताओं उठता शामिल किए गए हैं।

  1. मार्क या तो एक ठीक टिप मार्कर के साथ या एक छोटा त्रिकोणीय टुकड़ा टेप में कटौती करने और (चित्रा 2A) शीर्षस्थान पर एक कोने बात अंतर्निहित मस्तिष्क क्षेत्रों उन्मुख करने के लिए शीर्षस्थान के स्थान।
  2. सिर प्लेट affixing से पहले यह सुनिश्चित खोपड़ी पूरी तरह से सूखा है। खोपड़ी जल्दी से सूखी हवा जेल फोम मस्तिष्क बफर में भिगो के आवेदन के बाद, अगर अधिक सुखाने की जरूरत है, कपास टिप के फाहे का प्रयोग करेंगे। यह कदम सिर प्लेट निर्धारण (चित्रा 1 बी) के लिए महत्वपूर्ण है।
    नोट: यदि खोपड़ी पर periosteum बाईं है, या अगर खोपड़ी सिर प्लेट पर चिपकाने से पहले सूखी नहीं है, यह अलग होने की संभावना होगी। यदि ऐसा होता है, धीरे सिर प्लेट हटा दें और फिर शुरू करें। इस प्रक्रिया के दौरान हो सकता है रक्त स्राव; यह जमाने के लिए कुछ मिनट दें, और फिर धीरे से हटा दें। इस प्रक्रिया को दो बार से अधिक दोहराया जाना अनुशंसित नहीं है।
  3. <Li> सिर प्लेट 16 के नीचे के किनारे एथिल cyanoacrylate गोंद को लागू करें, और craniotomy क्षेत्र ( चित्रा 1 डी और चित्रा 2 ए ) पर सिर की थाली गोंद करें।
  4. खोपड़ी और सिर की थाली के बीच के उद्घाटन के स्थान को दंत सिमेंट के साथ भर दें, जिसमें केवल कर्कशिकी क्षेत्र उजागर हो। दंत सिमेंट के लिए सूखी और कठोर होने की प्रतीक्षा करें, आम तौर पर 5-10 मिनट ( चित्रा 2 बी )
    1. सीमेंट सेट हो जाने के बाद, मस्तिष्क के बफर के साथ संक्षेप में भरें और 3-5 मिनट के लिए सोख करने की अनुमति दें। ड्रिलिंग से पहले मस्तिष्क बफर को निकालने के लिए एक लुढ़का ऊतक का प्रयोग करें ( चित्रा 2C )।
  5. एक दंत ड्रिल के साथ खोपड़ी की सतह को हल्के ढंग से स्कोरिंग करके सर्जिकल क्षेत्र की रूपरेखा करें। एक वायवीय ड्रिल (अधिकतम 20 एसएसआई) का प्रयोग करें, जिसमें एफजी ¼ बोरर होता है, और एक चर गति पैर पेडल के साथ नियंत्रित होता है।
  6. धीरे से गहरा करने के लिए मूल स्कोरिंग के साथ ड्रिल का पता लगाएं, ईड्रिल के निशान को खोपड़ी के माध्यम से मस्तिष्क में नहीं घुसना ( चित्रा 2 डी )। ड्रिलिंग और खोपड़ी की सतह को सिकुड़ने वाले ऊतकों के साथ डब करने के बीच हर कुछ मिनट लगें। यह यांत्रिक घर्षण और लंबे समय तक एक्सपोज़र से खोपड़ी के हीटिंग और सुखाने को कम करेगा।
    नोट: गीले जेल फोम के आवेदन के बाद खोपड़ी जल्दी शुष्क हो जाएगी। अगर अधिक सुखाने की आवश्यकता होती है, तो कपास की टिप स्वादों का उपयोग करें
    सावधानी: मोटाई में खोपड़ी असमान है। उदाहरण के लिए, पार्श्विक-अस्थायी रिज सबसे ज्यादा क्षेत्र है, जबकि मिडलाइन और स्क्वैमोजल स्थल के पास स्थित खोपड़ी क्षेत्रों अपेक्षाकृत पतली हैं।
  7. ड्रिलिंग के दौरान, समय-समय पर खोपड़ी को ढकने की जांच करें ताकि धीरे-धीरे संदंश या गैर-चलती ड्रिल बिट के साथ दबाएं। जब हड्डी बकसुआ करने लगती है, ड्रिलिंग बंद करो और मस्तिष्क बफर में पूरी खिड़की को विसर्जित कर दें।
    नोट: यदि रक्त किसी क्षेत्र से बाहर जाता है, तो यह सुझाव दे सकता है कि ड्यूरा क्षतिग्रस्त हो गया है। यदि यह मामला है, तो एक sem रखेंi-गीला क्षेत्र पर जेल फोम और रक्त को सोखने के लिए, जबकि धीरे एक कपास टिप पट्टी के साथ जेल फोम के लिए दबाव लागू करने का प्रयास करें।
  8. खोपड़ी हटाने से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें हड्डी नरम करने के लिए और ड्यूरा हड्डी के लिए चिपके की संभावना को कम करने के लिए, खोपड़ी को हटाने की प्रक्रिया को सरल बनाने की।
  9. जबकि खोपड़ी मस्तिष्क बफर में डूबे हुए है खोपड़ी को हटाने की प्रक्रिया को पूरा करें।
    नोट: खोपड़ी के एक हिस्से को हठ जुड़ा रहता है, एक # 11 स्केलपेल ब्लेड धीरे खोपड़ी स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। खोपड़ी के माध्यम से और मस्तिष्क में ब्लेड पंचर नहीं करने के लिए चरम ख्याल रखना।
  10. पूर्वकाल किनारे से शुरू करते हुए, धीरे ड्यूरा संदंश का उपयोग करने से ढीला खोपड़ी जिज्ञासा।
    नोट: खून बह रहा है की एक छोटी राशि खोपड़ी को हटाने की प्रक्रिया के दौरान होता है, एक हस्तांतरण पिपेट या सिरिंज के साथ बफर निकालने के लिए, और फिर नए बफर के साथ बदलें।
  11. एक बार हड्डी ढीला है और ड्यूरा पर "चल", मजबूती से पकड़ संदंश के साथ हड्डी और से हड्डी उठाड्यूरा। सुनिश्चित करें हड्डी कभी नहीं मस्तिष्क में प्रवेश।
  12. खून बह रहा नियंत्रण करने के लिए, एक बिंदु में एक ऊतक के कोने रोल और कपाल अच्छी तरह से बफर के सबसे को हटा दें। जबकि एक कपास टिप पट्टी के साथ बहुत हल्का दबाव जोड़ने जल्दी, जेल फोम, बफर में पूर्व भिगो लागू खून बह रहा है क्षेत्र के लिए।
    नोट: खून बह रहा है आम तौर पर हड्डी या ड्यूरा की सतह के किनारे से आता है, दोनों ही मामलों सामान्य हैं और खून बह रहा है जल्दी से बंद हो जाएगा अगर कोई बड़ी रक्त वाहिकाओं क्षतिग्रस्त हो रहे हैं। खून बह रहा है जारी है, रक्त पूरी विंडो भर सकते हैं, इमेजिंग क्षेत्र में एक थक्का चादर के गठन।
    1. थक्का चादर हटाने के लिए, ध्यान से, जबकि खून का थक्का उठी रक्त वाहिका के स्रोत के आसपास बरकरार छोड़ने इमेजिंग क्षेत्र से पका हुआ खून के टुकड़े को लेने के लिए। ब्लीड स्रोत से खून का थक्का को निकालना ही नहीं के रूप में यह और भी अधिक रक्त हानि हो सकती है ख्याल रखना। मस्तिष्क बफर के साथ मस्तिष्क की सतह की सिंचाई किसी भी रक्त दूर धोने के लिए।
    2. छू से बचने के लिए ध्यान रखनानाजुक मस्तिष्क के ऊतकों या मस्तिष्क के लिए विदेशी सामग्री जोड़ने; दोहराते रहें जब तक खून बह रहा है लगभग 2 के लिए, बंद कर दिया है - 5 मिनट (चित्रा 2 ई)।
      नोट: इस बिंदु पर, craniotomy कपाल खिड़की तैयार करने के लिए तैयार है (देखें चरण 5)। यदि आवश्यक हो, कपाल खिड़की (चरण 4 देखें) दाखिल करने से पहले ड्यूरा को हटा दें।

4. ड्यूरा हटाने

नोट: ड्यूरा हटाने अत्यधिक ध्यान की आवश्यकता है और अधिक 15 मिनट लग सकते हैं।

  1. craniotomy से अतिरिक्त बफर दूर आकर्षित। एक नम सतह को बनाए रखते हुए, संदंश के साथ ड्यूरा का एक छोटा टुकड़ा हड़पने और धीरे ड्यूरा आंसू।
  2. संदंश और वसंत कैंची का प्रयोग धीरे आंसू और दूर ड्यूरा कटौती करने के लिए।
  3. ड्यूरा तैरने लगते हैं और यह मस्तिष्क से अलग करने में मदद करने मस्तिष्क की सतह पर अधिक मस्तिष्क बफर ड्रॉप। जब तक सभी ड्यूरा कपाल खिड़की साइट से हटा दिया जाता है जारी रखें। जब सही ढंग से प्रदर्शन किया मस्तिष्क अलग बीएल के साथ बहुत साफ दिखाई देंगेओओडी जहाजों और कोई धब्बा ( 2 एफ के साथ चित्रा 2 ई की तुलना करें)
    सावधानी: दुरा के कुछ क्षेत्रों में मस्तिष्क की सतह पर छोटे खगोलीय पदार्थों से जुड़ी होती है ( उदाहरण के लिए , पार्श्विका सम्बद्ध क्षेत्र के लिए समीक्षस्थल मिडलाइन के निकट), और इस तरह के हटाने से धमनी को टूट सकता है। ऐसे मामलों में, धमनी के शीर्ष पर एक छोटा टुकड़ा छोड़ दिया जाना बेहतर हो सकता है। वीएसडी उस छोटे क्षेत्र में प्रवेश नहीं कर सकता है, लेकिन यह प्रमुख खून बह रहा होने के लिए प्राथमिकता है।
  4. मस्तिष्क की सतह को ठीक करने के लिए agarose में जल्द से जल्द फिसलन से आंदोलन को कम करने और आगे सूजन को रोकने के लिए (चरण 5 देखें)।

5. क्रैनिअल विंडो की तैयारी

  1. 70% इथेनॉल के साथ आवरण कांच स्प्रे करें और धीरे से सूखा करने के लिए एक हवा के कनस्तर का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कांच पूरी तरह से कोई स्पॉट या धूल से मौजूद नहीं है।
  2. 15 मिलीलीटर मस्तिष्क बफर में भंग होने वाले 200 मिलीग्राम agarose पाउडर को ताप कर 1.3% agarose तैयार करें। माइक्रोवे सेट करेंएक समय में 15 है, धीरे बीच में सरगर्मी, जब तक सभी अगर भंग हो जाता है - उच्च और 10 के लिए गर्मी के लिए AVE।
    ध्यान दें:, सुनिश्चित करें कोई बुलबुले या कण मौजूद हैं के रूप में इन इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा।
  3. गर्म agarose में एक थर्मामीटर रखें और agarose को ठंडा सिर्फ तापमान solidifying ऊपर (~ 40 डिग्री सेल्सियस)।
    नोट: agarose कंटेनर के बाहर से अधिक ठंडे पानी चल रहा है ठंडा करने की प्रक्रिया में तेजी लाने सकता है। धीरे कोई बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए लगातार हलचल या कण मौजूद हैं।
  4. इसके तत्काल बाद अगर लागू करने से पहले, कपाल अच्छी तरह से मस्तिष्क बफर हटा दें। एक हस्तांतरण पिपेट साथ agarose आकर्षित और मस्तिष्क पर सीधे agarose ड्रॉप। जल्दी सतह पर कवर स्लिप जगह है और जकड़ना agarose के साथ कवर स्लिप कोनों पर चला जाता है।

6. इच्छामृत्यु

नोट: हमारे अनुभव में, इस प्रक्रिया का अनुभव लेता सर्जन कम से कम 3 - 4 अभ्यास सर्जरी 90% से अधिक प्राप्त करने के लिएसफलता दर। कम अनुभवी सर्जन और भी अधिक अभ्यास की आवश्यकता हो सकती। craniotomy या durotomy के दौरान मस्तिष्क में इस तरह करता है, तो मस्तिष्क में हड्डी के माध्यम से ड्रिल घूंसे के रूप में नुकसान, सहन कर सकते हैं। craniotomy के किनारे पर कुछ मामूली नुकसान की अनुमति हो सकती है। हालांकि, अगर मस्तिष्क चमकदार लाल undamaged रक्त वाहिकाओं और सफेद कॉर्टेक्स के साथ "क्लीन" नहीं लगती है, प्रयोग समाप्त किया जा करना पड़ सकता है। गरीब तैयारी के उदाहरण मृत रक्त वाहिकाओं के साथ उन लोगों या में शामिल हैं, कॉर्टेक्स फटे या क्षतिग्रस्त रक्त वाहिकाओं के साथ चिह्नित है जब। इन संकेतों के किसी भी मौजूद हैं, प्रयोग की संभावना नहीं उच्च गुणवत्ता वाले डेटा निकलेगा। चाहे सर्जरी / प्रयोग सफल था या नहीं, मानवता का प्रयोग के पूरा होने पर माउस euthanize।

  1. गहराई से कम से कम 3.5 isoflurane% के साथ anesthetize। फिर, 300 मिलीग्राम / किग्रा में सोडियम pentobarbital के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन दे। आदर्श रूप में, अगर सुई जिगर में डाला जाता है, मृत्यु बहुत तेजी से (<1 मिनट) हो जाएगा।
  2. छिड़काव की आवश्यकता है, तो सत्यापित करें कि पशु आगे बढ़ने (कदम 1.3 देखें) से पहले गहरा anesthetized है।
  3. या फिर, यदि छिड़काव की आवश्यकता नहीं है, 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए इंतजार और फिर सत्यापित करें माउस मर चुका है कि। श्वसन, दिल की धड़कन के अभाव, साथ ही दर्द वापसी और कॉर्निया सजगता की कमी की पुष्टि करें। इसके अलावा, पैरों की पीला नीला / सफेद रंग और प्रांतस्था से अधिक रक्त वाहिकाओं के काला के लिए निरीक्षण।

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Representative Results

6 मिमी पार्श्व - एक गोलार्द्ध के भीतर cortical क्षेत्रों के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए, हम एक बड़े सैजिटल साइनस और 5 फैली craniotomy इस्तेमाल किया। यह कपाल खिड़की शामिल प्राथमिक (मोटर, somatosensory, दृश्य, श्रवण), माध्यमिक (मोटर, दृश्य), और संघ (retrosplenial, सिंगुलेट, पार्श्विका संघ) सही मस्तिष्क गोलार्द्धों (चित्रा 3 ए) के cortices। इस काम के लिए हम वोल्टेज संवेदनशील डाई (VSD) इमेजिंग, जो झिल्ली क्षमता 3 में परिवर्तन को दर्शाता है इस्तेमाल किया। यह प्रोटोकॉल भी अन्य बाह्य (जैसे, कैल्शियम 17 और ग्लूटामेट 18 इमेजिंग) या आंतरिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयोगी होगा। जब hindlimb, अग्र- अंग, मूंछ, दृश्य, या 0.5% isoflurane का उपयोग हल्के से संज्ञाहरण चूहों के श्रवण प्रणाली उत्तेजक, हम cortical विध्रुवण की सहमति पैटर्न मनाया (> चित्रा 3 बी)। पिछला अध्ययन 5 , 1 9 , 20 , 21 , 22 के अनुरूप, हमने पाया कि सी 2 बैरल कॉर्टेक्स के संक्षिप्त स्पर्श उत्तेजना से कार्यात्मक रूप से संबंधित क्षेत्रों के भीतर प्राथमिक सोमासोसेंसरी क्षेत्रों के सक्रियण और साथ ही "द्वीपों" की प्रतिक्रियाएं बढ़ गईं। उदाहरण के लिए, प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (एम 1) या सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स का द्वितीयक प्रतिनिधित्व (एस 2; चित्रा 3 बीआई )। एक एकल एमएस टोन पीप (25 kHz) उत्तेजना ने श्रवण उत्तेजना ( चित्रा 3 बीआई ) के बाद लगभग 20 एमएस प्राथमिक श्रवण प्रांतस्था (ए 1) के सक्रियण को जन्म दिया । अगले कुछ मिलीसेकंडों में, विध्रुवण, श्रवण प्रांतस्था में फैल गया और पड़ोसी माध्यमिक सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स के पास गया। टोन की शुरुआत के बाद लगभग 25 एमएस, एक माध्यमिक कर्टिकल विध्रुवण, उभर आएगा, 1.0 स्थित होगा7; 0.2 मिमी औसत दर्जे का और 1.9 ± 0.1 मिमी पीछे रिश्तेदार bregma करने के लिए (एन = 9 चूहों)। यह लगभग पार्श्विका संघ क्षेत्र (पीटीए) का स्थान है। वी एस डी संकेत तो मध्य रेखा ऐसा क्षेत्र है जहां अन्य cortical संघ क्षेत्रों retrosplenial (राज्यसभा) सहित स्थित हैं और सिंगुलेट प्रांतस्था (सीजी) को प्रचारित किया। इसलिए, श्रवण उत्तेजना दो अलग-अलग फोकल क्षेत्रों की सक्रियता, जिसमें से वी एस डी विध्रुवण प्रसार की यात्रा तरंगों मध्य रेखा प्रांतस्था के भीतर एक बड़े क्षेत्र के लिए नेतृत्व किया। एक 1 एमएस हरे रंग के साथ contralateral आंख की फोकल उत्तेजना एलईडी नाड़ी, 40 एमएस (चित्रा 3Bv) के भीतर प्राथमिक दृश्य कोर्टेक्स की सक्रियता के लिए नेतृत्व किया। दृश्य कोर्टेक्स की यह प्राथमिक सक्रियण के बाद किया गया: पड़ोसी मध्यवर्ती स्थित क्षेत्रों में वी एस डी विध्रुवण (1) के स्थानिक विस्तार, पार्श्व, और प्रारंभिक सक्रिय क्षेत्र के लिए पूर्वकाल; (2) एक दूसरे औसत दर्जे का cortical क्षेत्र के विध्रुवण लगभग 50 एमएस उत्तेजना (एन = 8 प्रयोगों) सा किनारे स्थित के बाद gittal टांका। यह अग्र- अंग का संवेदी stimulations (चित्रा 3Biii), hindlimb (चित्रा 3Biv), सी 2 गलमुच्छा, या ऑडिशन के समान था। उत्तेजना के बाद 40 एमएस - अग्र- अंग, hindlimb या ऑडिशन का संवेदी उत्तेजना से पैदा VSDI प्रतिक्रियाओं शुरू में संबंधित प्राथमिक संवेदी cortices, गतिविधि का एक अनिसोट्रोपिक प्रसार, साथ ही 20 के आसपास कॉर्टेक्स के मध्य रेखा सक्रियण के बाद सक्रिय। इस परिणाम दृश्य और गलमुच्छा उत्तेजना से प्रतिक्रिया के समान था। सहज गतिविधि 6 से इन मध्य रेखा मार्गों और एक ही क्षेत्र के लगातार सक्रियण साथ संवेदी पैदा की गतिविधि के प्रसार का सुझाव दे सकते कि इन क्षेत्रों माउस कॉर्टेक्स के कनेक्शन कोर, जिसमें संवेदी जानकारी सहज cortical गतिविधि के साथ एकीकृत कर सकते हैं का केंद्र रहे हैं।

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चित्रा 1। सर्जिकल सेटअप और तैयार करना। (ए) माउस सिर मुंडा कर रहा है, शुद्ध, पार्श्व प्रदर्शन के लिए लगभग 30 डिग्री घुमाया, और कान सलाखों के कुंद अंत के साथ हासिल किया। Isoflurane संवेदनाहारी नाक टुकड़ा और दांत धारक के माध्यम से वितरित किया जाता है। माउस के साथ वृद्धि हुई बाँझपन और गर्मी के लिए स्वयं चिपकने वाला प्लास्टिक रैप कवर किया जाता है। (बी) के करीब दिखा त्वचा और पार्श्विका खोपड़ी प्लेट से हटा दिया periosteum, अस्थायी मांसपेशी अछूता है। (सी) अस्थायी मांसपेशी अस्थायी प्लेट और squamosal हड्डी उजागर निकाल दिया जाता है ध्यान दें सतही नस undamaged है। (डी) निर्धारण करने से पहले, सिर प्लेट मोम के साथ सही स्थान में स्थित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्र 2। चरण-दर-चरण सर्जिकल प्रक्रिया। (ए) सिर प्लेट पूर्वकाल और पीछे स्थानों पर एथिल cyanoacrylate गोंद के साथ खोपड़ी से जुड़ा हुआ है। शीर्षस्थान के स्थान (त्रिकोणीय टेप के काले टुकड़ा) ध्यान दें। (बी) के कपाल खिड़की सिर प्लेट और खोपड़ी के बीच गाढ़ा दंत सीमेंट लगाने से तैयार किया जाता है। ध्यान दें कि शीर्षस्थान और squamosal स्थलों दृश्यमान रहती हैं। (सी) सीमेंट के सूखने के बाद, मस्तिष्क बफर खोपड़ी नरम करने के लिए और ड्यूरा के आसंजन को रोकने के लिए जोड़ा गया है। एक लुढ़का ऊतक मस्तिष्क बफर ड्रिलिंग से पहले दूर करने में मदद मिलेगी। (डी) craniotomy के किनारों रन बनाए किया गया है। नोट वाहिका संरचना और अधिक आसानी से दंत सीमेंट के किनारों के पास पतला हड्डी के माध्यम से देखा जाता है। (ई) पार्श्विका और लौकिक खोपड़ी प्लेटों remov किया गया हैएड और ड्यूरा दिख रहा है। नाबालिग से खून बह रहा से ड्यूरा, जो सामान्य है पर खून की blemishes ध्यान दें। 2 के अंतर्गत सावधान परीक्षा - 4 एक्स आवर्धन रक्त वाहिकाओं की दो परतों, ड्यूरा में एक और पिया के अन्य का पता चलता है। (एफ) ड्यूरा एक प्राचीन प्रांतस्था खुलासा हटा दिया है। Pial वाहिका वर्तमान कोई blemishes के साथ चमकदार लाल है। कपाल खिड़की के किनारों पर सफेद रंग का ड्यूरा की आवारा टुकड़े पर ध्यान दें। इस उदाहरण में, वहाँ कपाल खिड़की है, जो जल्दी पका के पीछे हिस्से में एक छोटी सी Dural ब्लीड था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3 चित्र। संवेदी उत्तेजना की विभिन्न विधियां दौरान अद्वितीय और आम सहमति सक्रियण पैटर्न। < / strong> (ए) योजनाबद्ध एकतरफा craniotomy के imaged cortical क्षेत्रों को दर्शाता है। (बी) प्रत्येक छवि में सफ़ेद वृत्त ने संकेत दिया शीर्षस्थान साथ विस्तृत एकतरफा craniotomy के सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। cortical सक्रियण के पैटर्न एक माउस isoflurane (0.5%) के बाद (i) उत्तेजना contralateral सी 2 गलमुच्छा के (stim), (ii) श्रवण उत्तेजना (iii) contralateral अग्र- अंग उत्तेजना, (iv) contralateral hindlimb उत्तेजना और साथ संज्ञाहरण में दिखाया जाता है (v) एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के साथ contralateral आंख के दृश्य उत्तेजना। प्राथमिक संवेदी प्रांतस्था सक्रियण के बाद 25 एमएस - संवेदी उत्तेजना के सभी रूपों (सफेद तीर) 10 पर के बाद मध्य रेखा सक्रियण हुई थी। प्रतिक्रियाओं 20 परीक्षणों के मतलब है। छवि दूसरी ओर से दूसरी पंक्ति (ii) में छोड़ दिया पूर्वकाल (ए), पीछे (पी), औसत दर्जे का (एम) और पार्श्व (एल) दिशाओं इंगित करता है। Mohajerani, एट अल।, 2013 से अनुमति के साथ संशोधित।p_upload / 52,642 / 52642fig3large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक बड़ी कपाल खिड़की के लिए यह नवीन प्रोटोकॉल सेरेब्रल कॉर्टेक्स के अस्थायी और पार्श्विका क्षेत्रों में एक साथ इमेजिंग सक्षम बनाता है। ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ संयुक्त, यह सहज और प्रोत्साहन प्रेरित गतिविधि के दौरान cortical क्षेत्रों के भीतर तंत्रिका गतिशीलता प्रकट करने के लिए कर सकते हैं। इस विशाल craniotomy भी cortical वाहिका नेटवर्क की एक बड़ी विस्तार, मध्य प्रमस्तिष्क धमनी (एमसीए) के समीपस्थ अंत सहित को उजागर करता है, रक्त प्रवाह और इस्कीमिक मॉडल के लिए पार्श्व वाहिकाओं के सीधे प्रभाव के vivo इमेजिंग में सक्षम करने से। इस तकनीक को वोल्टेज और कैल्शियम सूचक प्रोटीन 23 व्यक्त चूहों की हाल ही में विकसित लाइनों के लिए बहुत काम की हो जाएगा। इन चूहों प्रांतस्था पर वोल्टेज संवेदनशील रंगों विकासशील के लिए की जरूरत को दरकिनार करने का व्यावहारिक लाभ प्रदान करते हैं। इन बाह्य रंगों समय लेने के लिए पर्याप्त रूप से मस्तिष्क के ऊतकों घुसना करने के लिए (~ 60 - 90 मिनट) और उनके हल्के विषाक्तता द्वारा सीमित हैं। बड़े craniotomies भी हैपहले से VSDI 11 के साथ विकसित कर चूहे के मस्तिष्क का अध्ययन करने का उपयोग किया गया। नवजात चूहों एक बहुत बड़ा सिर है और वयस्क चूहों के साथ आकार में बराबर है। इस ट्रांसजेनिक चूहों के साथ, तंत्रिका विज्ञान में विकास की समस्याओं का अध्ययन करने के लिए नहीं यद्यपि एक अनूठा अवसर के साथ शोधकर्ताओं मिलता।

इस विधि के मुख्य सीमाओं पुरानी प्रयोगों के लिए अक्षमता है। खोपड़ी की वक्रता ड्रिलिंग की प्रक्रिया अधिक चुनौतीपूर्ण बना देता है और समय छोटे craniotomies से लेने वाली। इस बड़े craniotomy के लिए, यह केंद्रीय टांका और squamosal स्थलों के साथ सिर स्थिति लेंस के ध्यान केंद्रित कर विमान के समानांतर लिए महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क के कुछ विरूपण मस्तिष्क की वक्रता की उम्मीद की जाती है, तो ये कॉर्टेक्स के सतही परतों में ध्यान केंद्रित करके काबू पाने कर रहे हैं। यह समस्या आगे उत्तेजना और औसत के कई repetitions प्राप्त करने के द्वारा कम किया जाता है। सारांश में, हमारे बड़े craniotomy तकनीक का व्यापक रूप से अनुप्रयोग हैतंत्रिका जीव विज्ञान में मौजूदा समस्याओं के अध्ययन के लिए licable।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

इस काम के द्वारा एक प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) डिस्कवरी अनुदान # 40,352 समर्थित किया गया, अभिनव कार्यक्रम चेयर, एम एच एम के अलबर्टा अल्जाइमर रिसर्च प्रोग्राम के लिए कैम्पस अल्बर्टा, और NSERC BIF डॉक्टरल फेलोशिप और एम के लिए AIHS स्नातकोत्तर फैलोशिप में बनाएँ। हम इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए और शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण के लिए पु मिन वांग धन्यवाद, और बेह्रू मिर्ज़ा आगा और डि शाओ-पालन के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heating Pad FHC 40-90-2
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09
Forceps  Fine Science Tools 11251-35 2 or more pairs are recommended
Spring scissors Fine Science Tools 15000-00, 15000-10 1 pair should be designated for dura removal 
Jet tooth shade powder LANG Dental Jet Tooth Shade Powder to be mixed with the Jet Liquid
Jet tooth shade liquid LANG Dental Jet Tooth Shade Liquid to be mixed wihth the Jet Powder 
Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 Midwest Dental 385201
Agarose Powder Sigma-Aldrich A9793
Gelfoam Sinclair Dental Canada Pfizer Gelfoam
Isoflurane Western Drug Distribution Centre Ltd 124125
Lidocaine 2% Epinephrine Western Drug Distribution Centre Ltd 125299
Dexamethazone 5 mg/mL Western Drug Distribution Centre Ltd 125231
Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) Western Drug Distribution Centre Ltd 12612

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References

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