हौसले से अलग glomeruli की Podocytes में एकल चैनल विश्लेषण और कैल्शियम इमेजिंग

1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin
Published 6/27/2015
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Biology

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Summary

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Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

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Abstract

Introduction

गुर्दे विभिन्न पदार्थों के लिए समस्थिति संतुलन बनाए रखने और कुल रक्तचाप को निर्धारित करता है कि एक तरह से रक्त की मात्रा को विनियमित। अति या हाइपोटेंशन से लेकर गुर्दे छानने का काम, पुनःअवशोषण या स्राव नेतृत्व में गड़बड़ी या साथ देने के रोग राज्यों, अंत में गुर्दा प्रत्यारोपण की आवश्यकता है कि मंच गुर्दे की बीमारी समाप्त करने के लिए। केशिका अन्तःचूचुक, तहखाने झिल्ली और उपकला कोशिकाओं के एक एकल कोशिका परत - - भट्ठा-डायाफ्राम अखंडता और समारोह 1 के रखरखाव में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं जो podocytes, गुर्दे छानने इकाई (ग्लोमेर्युल्स) तीन परतें होती हैं। Permselective केशिकागुच्छीय फिल्टर में शिथिलता ऐसे प्रोटीनमेह के रूप में अणुओं के मूत्र हानि का कारण बनता है। विभिन्न एजेंटों ग्लोमेरुली निस्पंदन बाधा की अखंडता को निर्धारित जो podocytes और उनके पैर प्रक्रियाओं, की संरचना को प्रभावित कर सकता है।

podocytes glom के रखरखाव में शामिल कर रहे हैंeruli निस्पंदन समारोह। यह podocyte द्वारा अनुचित कैल्शियम हैंडलिंग सेल चोट की ओर जाता है और nephropathies 2,3 के विभिन्न रूपों की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि स्थापित किया गया है। इसलिए, podocyte समारोह के अध्ययन के लिए सहायक होगा intracellular कैल्शियम एकाग्रता परिवर्तन का सीधा मापने के लिए अनुमति देता है जो एक मॉडल का विकास। पृथक ग्लोमेरुली पहले से एल्बुमिन प्रतिबिंब गुणांक की माप 4 और पूरे सेल electrophysiological पैच दबाना माप 5,6 में अभिन्न सेलुलर धाराओं के आकलन परिवर्तन सहित एक कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया। वर्तमान पत्र में हम, औषधीय एजेंटों के आवेदनों के जवाब में intracellular कैल्शियम एकाग्रता परिवर्तन को मापने कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम के बेसल के स्तर का अनुमान है, और व्यक्तिगत कैल्शियम चैनल गतिविधि का आकलन करने के लिए शोधकर्ता की अनुमति देता है कि प्रोटोकॉल का वर्णन। Ratometric कैल्शियम एकाग्रता मापन और पैच दबाना electrophysiology क्रमश: podocyte और चैनल गतिविधि के भीतर intracellular कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

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Protocol

पशु का उपयोग करें और कल्याण संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा समीक्षा की और मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल का पालन प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड का पालन करना चाहिए।

1. गुर्दा फ्लश

  1. (हालांकि अलग अलग उम्र और लिंग के अन्य उपभेदों उपयुक्त बदलाव के साथ प्रयोग किया जा सकता है, एक Sprague Dawley तनाव है) का सुझाव दिया 8 से 12 सप्ताह पुरानी नर चूहे का प्रयोग करें।
  2. IACUC प्रोटोकॉल द्वारा की अनुमति प्रक्रिया के अनुसार पशु anesthetize; संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखने और जानवर का निरीक्षण किया। सर्जरी का विस्तृत वर्णन 1.3 में प्रदर्शन किया जाएगा - 1.8 Ilatovskaya एट अल में पाया जा सकता है 7।
  3. उचित संज्ञाहरण के बाद, एक तापमान नियंत्रित शल्य चिकित्सा की मेज पर जानवरों की जगह (लंबाई में 3 इंच) पेट के एक midline चीरा बनाने के लिए, और रग कावा और महाधमनी उजागर।
  4. सीलिएक और बेहतर mesenteric धमनियों और पेट के आसपास संयुक्ताक्षर डालेंउन लोगों के ऊपर महाधमनी; ligate नहीं है।
  5. गुर्दे की धमनियों के नीचे उदर महाधमनी काटना, और उसके चारों ओर दो संयुक्ताक्षर जगह है, लेकिन ligate नहीं है कुंद, तो संयुक्ताक्षर से ऊपर महाधमनी दबाना और कम धागा बाँध।
  6. दबाना नीचे (पीबीएस के साथ भरा एक सिरिंज पंप से जुड़ी) एक पॉलीथीन PE50 टयूबिंग के साथ महाधमनी कैथीटेराइज़ और दूसरा संयुक्ताक्षर के साथ कैथेटर को ठीक कर; , दबाना को दूर पंप पर बारी है, और महाधमनी ligate और सीलिएक धमनियों के साथ mesenteric। जल्दी दबाव को दूर करने के लिए गुर्दे की नस में चीरा बनाते हैं।
  7. / मिनट 6 मिलीलीटर की दर से 2 या 3 मिनट के लिए पूर्व ठंडा पीबीएस के साथ महाधमनी दिखे।
  8. छिड़काव, आबकारी बंद करो और 7 गुर्दे decapsulate, और पीबीएस समाधान में बर्फ पर डाल दिया। IACUC द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार पशु euthanize।

चूहा glomeruli 2. अलगाव

  1. RPMI 1640 में 5% BSA के ताजा समाधान की 30 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. एक रेजर ब्लेड और कैंची का प्रयोग,दोनों गुर्दे की कोर्टेक्स को अलग, और उसके समरूप तक कीमा। यह प्रक्रिया पहले 7 वर्णित किया गया है।
  3. एक 100 जाली स्टेनलेस स्टील चलनी के माध्यम से पिछले चरण के दौरान कीमा बनाया हुआ ऊतक पुश एक रंग का उपयोग (बीएसए / RPMI समाधान 5% में पूर्व भिगो)। प्रवाह के माध्यम से और गुरुत्वाकर्षण बल द्वारा प्रवाह के माध्यम से एक 140 जाल चलनी के माध्यम से पारित करने की अनुमति ले लीजिए।
  4. एक पूर्व भिगो 200 जाल चलनी का उपयोग कर चलनी 140 जाल से एकत्र प्रवाह के माध्यम से फिल्टर छानना त्यागें, और 10 के साथ चलनी के शीर्ष धो - पर तलछट कि ग्लोमेरुली को इकट्ठा करने के लिए तैयार बीएसए / RPMI समाधान के 15 मिलीलीटर चलनी।
  5. अप करने के लिए 20 मिनट के लिए ट्यूब के नीचे ग्लोमेरुली तलछट एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में बर्फ पर ग्लोमेरुली युक्त बीएसए / RPMI समाधान रखो और चलो। ट्यूब के तल पर ग्लोमेरुली ध्यान केंद्रित स्पष्ट रूप से देखा जाएगा। ट्यूब में लगभग 2 मिलीलीटर छोड़ रहा है, अतिरिक्त समाधान निकालें।

3. एकल चैनल पैच दबाना एलectrophysiology

  1. मेगावाट 70,000 के साथ उन्हें कोटिंग से 5 एक्स 5 मिमी कवर कांच चिप्स तैयार - 150000 पाली ʟ Lysine, और दो सूखी। कवर कांच के अनुसार पानी में 0.01% बाँझ फ़िल्टर्ड समाधान के लगभग 30 μl का प्रयोग करें।
  2. आरटी के लिए प्रयोगात्मक समाधान गर्म और पैच दबाना कक्ष और पिपेट भरें। TRPC चैनलों की निगरानी के लिए, मिमी में एक स्नान समाधान, का उपयोग करें: 126 NaCl, 1 2 CaCl, 10 HEPES, 2 2 MgCl, 10 ग्लूकोज, पीएच 7.4; पिपेट: 126 NaCl, 1.5 2 CaCl, 10 HEPES, 10 ग्लूकोज; 7.4 पीएच।
    1. की सिफारिश की पढ़ाई (के लिए प्रासंगिक नहीं हैं जो अंतर्जात चैनलों की गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए पिपेट समाधान के लिए अवरोधकों जोड़ें रहे हैं: 100 माइक्रोन niflumic एसिड या DIDs (सीए 2 + -activated सीएल ब्लॉक करने के लिए - चैनल), 10 मिमी चाय (बाधित करने के लिए बड़े प्रवाहकत्त्व सीए 2 + - निर्भर + K चैनल), 10 एनएम iberiotoxin (,) 10 माइक्रोन nicardipine सीए 2 + -activated + K चैनलों को ब्लॉक करने के लिए (एन-प्रकार सीए ब्लॉक करने के लिए2 + सीधे पैच दबाना प्रयोग से पहले चैनल))।
  3. धीरे ग्लोमेरुली युक्त समाधान मिश्रण है, और फिर पाली ʟ lysine लेपित कवर कांच चिप्स के लिए यह लगभग 50 μl लागू होते हैं। ग्लोमेरुली लगभग 5 मिनट के लिए देते हैं।
  4. पैच दबाना कक्ष स्नान समाधान पहले से ही भरे करने ग्लोमेरुली के साथ कांच चिप्स ले जाएं; स्वाधीन ग्लोमेरुली के हटाने सुनिश्चित करने के लिए 1 मिनट के लिए / मिनट 3 मिलीलीटर की दर से चैम्बर छिड़कना।
  5. एक सेल संलग्न मोड 7 में एक पारंपरिक पैच दबाना प्रयोग आचरण। एक गिलास विंदुक के साथ (7-10 MΩ पिपेट प्रतिरोध) एक पिपेट और कोमल चूषण (पृथक ग्लोमेर्युल्स की सतह पर एक podocyte से जुड़ी एक पिपेट लगाने से एक podocyte झिल्ली के बीच एक उच्च प्रतिरोध मुहर फार्म पर, चित्रा 2 में दिखाया गया है बाएं)।
  6. सेल संलग्न माप के लिए, एक आठ पोल बेसल फिल्टर द्वारा 300 हर्ट्ज पर धाराओं कम से गुजरती हैं।
  7. यू6 घंटा - एसई से 4 तक के लिए पैच दबाना प्रयोगों में ग्लोमेरुली को अलग किया। बर्फ पर शेयर ग्लोमेरुली अंश रखें।

Podocytes में intracellular कैल्शियम एकाग्रता 4. ratiometric confocal प्रतिदीप्ति माप

  1. शंक्वाकार ट्यूब 0.5 मिलीलीटर में (2.5 में वर्णित) ग्लोमेरुली अंश के 500 μl प्लेस और कैल्शियम रंगों Fura लाल, AM और Fluo-4, एएम जोड़ें। 2 मिमी और (DMSO में भंग -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर,) Fura लाल, AM और Fluo-4 बजे, क्रमशः के 1 मिमी शेयर सांद्रता का प्रयोग करें और ग्लोमेरुली अंश के 500 μl के लिए प्रत्येक डाई के 2.5 μl का उपयोग करें। इसके तत्काल बाद रंगों के बाद इसके अलावा एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर किया।
  2. आरटी पर 1 घंटे के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर प्लेस ट्यूबों।
    नोट: औषधीय एजेंटों इस कदम के दौरान जोड़ा जा सकता है।
  3. , कांच coverslips तैयार करें पाली ʟ-लाइसिन के साथ उन्हें कवर और 70 डिग्री सेल्सियस पर गरम थाली सेट का उपयोग कर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. कैल्शियम रंगों की लोडिंग complet है एक बारई, पाली ʟ-लाइसिन लेपित coverslips का हल युक्त ग्लोमेरुली के 100 μl लागू करते हैं और उनके बारे में 5 मिनट के लिए सतह के लिए छड़ी करते हैं। एक इमेजिंग चेंबर में ग्लोमेरुली संलग्न coverslips के माउंट, और स्नान समाधान (() मिमी में युक्त: 2 MgCl 145 NaCl, 4.5 KCl, 2, 10 HEPES, पीएच 7.35) के साथ छिड़कना 3 मिलीलीटर की दर से / मिनट दूर करने के लिए स्वाधीन ग्लोमेरुली और शेष रंजक।
  5. एक 488 एनएम तरंगदैर्ध्य उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर (क्रमशः Fluo-4 और Fura लाल के लिए 525/25 और 650/25 एनएम,) करने के लिए लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग सेट करें। एक वांछित आवृत्ति और संकल्प इमेजिंग सॉफ्टवेयर सेट करें।
  6. Brightfield में ग्लोमेरुली का पता लगाएं और फिर प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने पर बारी। संकेत के संतृप्ति से बचने के लिए प्रत्येक डाई के लिए लेजर की तीव्रता को समायोजित करें। सीधे गिलास से जुड़े होते हैं जो podocytes साथ फोकल हवाई जहाज़ चुनें। इस दवा के जवाब में एक ग्लोमेर्युल्स के संकुचन के कारण प्रभाव को कम करता हैआवेदन। पसंद का ग्लोमेर्युल्स अच्छी तरह से कांच से जुड़ा हुआ है कि दोहरी जांच;
  7. पसंद के फोकल हवाई जहाज़ इमेजिंग शुरू, (उच्च संकल्प छवि के लिए एक 60X / 1.4 एनए या इसी तरह के उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें। तेजी से सीए 2 + क्षणिक परिवर्तन कल्पना करने के लिए 4 सेकंड पर सेट आवृत्ति के साथ 512 x 512 छवियों लेने के लिए) ब्याज की दवाओं को लागू और प्रतिक्रिया रिकॉर्ड है।
    1. (ग्लोमेर्युल्स की सतह पर podocytes की इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप में कांच की सतह के करीब के रूप में) एक वांछित फोकल हवाई जहाज़ का चयन करें। Fluo4 और FuraRed चैनलों पर प्रतिदीप्ति की तीव्रता की जाँच करें, और ग्लोमेर्युल्स स्पष्ट रूप से brightfield में देखा जाता है कि सुनिश्चित करें।
    2. इमेजिंग शुरू करो। किसी भी दवाओं के आवेदन से पहले, आधारभूत प्रतिदीप्ति का रिकॉर्ड कम से कम 1 मिनट के संकेत (वहाँ कोई अचानक आई उछाल कर रहे हैं या संकेत के लुप्त होती) स्थिर है सुनिश्चित करने के लिए।
    3. एक micropipette की मदद से वांछित दवाओं लागू करें; सावधान रहना होगा और दवा अच्छी तरह फैलाना करने में सक्षम था सुनिश्चित करने और glomer तक पहुँचनेULUS। यदि आवश्यक हो तो, चयनित फोकल हवाई जहाज़ पर नजर रखने और इसकी वजह यह दवा आवेदन के ध्यान से बाहर कदम नहीं था कि जाँच धीरे स्नान समाधान मिलाएं।
    4. Fluo4 और FuraRed संकेतों के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन रिकॉर्ड। रिकॉर्डिंग संकेत पठार स्तर तक पहुँच जाता है या एक चरम पर पहुंचता है और फिर आधारभूत करने के लिए रिटर्न जब तक इंतज़ार कर रही द्वारा, लंबे समय पर्याप्त है सुनिश्चित करें। यदि आवश्यक हो तो समाधान परिवर्तन या किसी भी अन्य दवाओं के अलावा प्रदर्शन करते हैं।
    5. रिकॉर्डिंग बंद करो, और सॉफ्टवेयर के मूल स्वरूप में फ़ाइल सहेजें।

कैल्शियम माप के लिए 5. छवि विश्लेषण

  1. देशी ND2 प्रारूप में छवियों को आयात करने की अनुमति देता है कि एन डी उपयोगिता प्लगइन के साथ सुसज्जित ImageJ का खुला सॉफ्टवेयर के साथ छवि विश्लेषण करते हैं।
  2. छवि अनुक्रम आयात; चैनलों विभाजित है और एक hyperstack स्केल मोड का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. ओ ImageJ सॉफ्टवेयर में विश्लेषण → उपकरण → आरओआई प्रबंधक पथ का पालन करेंकलम एक रॉय प्रबंधक विंडो। एक अंडाकार चयन उपकरण और रॉय प्रबंधक में "जोड़ें (टी)" समारोह का उपयोग ब्याज (podocytes) के कई क्षेत्रों का चयन करें। पिछले आरओआई के रूप में, पृष्ठभूमि में क्षेत्र का चयन करें; (बचाने के लिए और अधिक →) चयनित ROIs बचाने के लिए।
  4. विश्लेषण के लिए चयनित चैनल युक्त विंडो को हाइलाइट करें। , रॉय प्रबंधक में मल्टी उपाय समारोह → और अधिक उपयोग बाहर चबूतरे बातचीत में कहा कि "एक पंक्ति टुकड़ा प्रति" बॉक्स चिह्नित करें, और उसके बाद OK। चयन, सेट माप → मेनू विकल्प परिणामों में दर्ज 'ग्रे मूल्य मतलब "और में प्रदर्शित किया जाएगा, जिसमें प्रत्येक रॉय, के लिए पिक्सेल तीव्रता मूल्यों की गणना: परिणाम विंडो में स्थापित किया जा सकता है कि प्रारूप में दिखाया जाएगा प्रत्येक रॉय के लिए अलग से कॉलम में परिणाम विंडो।
  5. वरीय डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्रत्येक चैनल (Fluo-4 और Fura लाल) के लिए मापा आरओआई तीव्रता मूल्यों प्रति; प्रत्येक डैट से घटाना पृष्ठभूमि तीव्रता मूल्योंएक बिंदु।
  6. प्रत्येक समय बिंदु के लिए Fura लाल चैनलों के लिए Fluo-4 की तीव्रता के अनुपात की गणना। प्लॉट स्कैटर / प्रत्येक रॉय के लिए सीए 2 + क्षणिक की लाइन बिंदु-समय बदल जाता है। चयनित ग्लोमेरुली के लिए क्या मतलब / एसई मूल्यों की गणना।
    नोट: समय कॉलम 4.5 पर चयनित इमेजिंग आवृत्ति के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए।

Fluo-4 प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग 6. intracellular कैल्शियम एकाग्रता गणना

  1. ग्लोमेरुली का एक नमूना लेने और 4.7 कदम करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की रिकॉर्डिंग के बाद स्नान समाधान करने के लिए, और रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि (10 माइक्रोन होना चाहिए स्नान कक्ष में अंतिम एकाग्रता) ionomycin जोड़ें। तीव्रता इसकी अधिकतम तक पहुँच जाता है और क्षय शुरू होने के बाद MnCl 2 जोड़ प्रतिदीप्ति 8 बुझाने के लिए (अंतिम एकाग्रता 5 मिमी) होना चाहिए।
  2. 6.1 में प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण करें। प्राप्त Fluo-4 संकेत आरओआई तीव्रता मूल्यों अनुसार कॉपी करेंपसंदीदा विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा 5.1-5.5 में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए।
  3. एक सूत्र का उपयोग आरओआई करने के लिए इसी podocyte में (एनएम में) intracellular कैल्शियम एकाग्रता की गणना:
    1 समीकरण
    कश्मीर डी Fluo-4 (345 एनएम) के लिए निरंतर एक पूर्व निर्धारित हदबंदी है जहां, एफ आप (आधारभूत) के लिए कैल्शियम एकाग्रता की गणना कर रहे हैं कि timepoint पर तीव्रता है, और एफ मिनट और एफ अधिकतम पर तीव्रता मान रहे हैं (ionomycin आवेदन के बाद) और (MnCl 2) के साथ प्रतिदीप्ति के शमन के बाद अधिकतम कैल्शियम लोड की बात है, क्रमशः (चित्रा 3 देखें)।

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Representative Results

यहाँ हम podocytes में कैल्शियम के स्तर में तीव्र परिवर्तन को मापने की समस्या को संबोधित किया। 1 हौसले की podocytes में उच्च संकल्प लाइव प्रतिदीप्ति confocal इमेजिंग और एकल आयन चैनल गतिविधि रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के इरादे से बनाया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है पृथक कृंतक ग्लोमेरुली। चूहे anaesthetized होने के बाद संक्षेप में, गुर्दे रक्त के लिए उन्हें स्पष्ट करने के लिए पीबीएस के साथ प्लावित किया जाना चाहिए। फिर, गुर्दे excised और decapsulated, और ग्लोमेरुली अंतर sieving के द्वारा गुर्दे की छाल से अलग कर रहे हैं कर रहे हैं। नमूना के भाग पैच दबाना विश्लेषण के लिए ले जाया जा सकता है और बाकी फ्लोरोसेंट कैल्शियम रंगों Fluo-4, AM और Fura लाल के साथ लोड किया जा सकता है, कोंफोकल ratiometric कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन करने के क्रम में हूँ।

एकल आयन चैनल गतिविधि की electrophysiological माप ग्लोमेरुली के अलगाव के बाद सही दूर किया जा सकता है। आयन चा की गतिविधिnnels पैच दबाना विधि का सेल जुड़ा हुआ है और पूरे सेल विन्यास में दोनों मापा जा सकता है। दिखाया दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए एकल TRPC-जैसे कैल्शियम का आयोजन आयन चैनल गतिविधि (चित्रा 2) की रिकॉर्डिंग है। इसके अतिरिक्त, यह सेल पारगम्य या रिसेप्टर बाध्यकारी एकल आयन चैनल के स्तर पर podocytes में कैल्शियम बाढ़ पर उनके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए दवाओं लागू करने के लिए संभव है।

एकल आयन चैनल गतिविधि मूल्यांकन की अनुमति देता है कि एक दृष्टिकोण podocyte समारोह चिह्नित कर सकते हैं कि डेटा की एक किस्म पैदा करता है। हालांकि, यह बहुत पूरे कोशिकाओं के स्तर पर कैल्शियम एकाग्रता परिवर्तन को मापने के द्वारा पूरक किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययन को करने के लिए, हौसले से अलग ग्लोमेरुली उच्च throughput confocal इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के साथ भरी हुई थी। एक उच्च ऑप्टिकल संकल्प के साथ यह एक समय में कई podocytes में कैल्शियम के स्तर की निगरानी करना संभव है। 3 समय दर्शाता चित्राpodocyte भीतर कैल्शियम एकाग्रता के परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए डिजाइन ठेठ प्रयोग के लिए बिल्कुल। podocyte भीतर बेसल कैल्शियम एकाग्रता Fluo-4 प्रतिदीप्ति के आधार पर मूल्यांकन किया गया था। 1 मिनट (एफ) के लिए बेसल संकेत तीव्रता दर्ज करने के बाद ionomycin लागू किया जाता है और फिर MnCl 2 से बुझती है, जो शिखर प्रतिदीप्ति (एफ अधिकतम) पर पहुंच होने का कारण बनता (एफ मिनट का उल्लेख किया जाता है)। 6.3 में सूत्र के अनुसार, प्रयोग के हर समय बिंदु पर Fluo-4 संकेत की तीव्रता तो सेल में कैल्शियम आयनों की वास्तविक एकाग्रता में अनुवाद किया जा सकता है। ग्राफ से देखा, पृष्ठभूमि (लगभग 400 मनमाना इकाइयों) में प्रतिदीप्ति मतलब स्वस्थ गैर apoptotic कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम के लिए एक सामान्य एकाग्रता सीमा के भीतर है, जो 140 एनएम, में तब्दील हो।

वर्णित दृष्टिकोण का महत्व और उपयोगिता तीव्र कैल्शियम transie को मापने के लिए अनुमति देता है जो किसी अन्य अनुप्रयोग, से जायज हैविभिन्न दवाओं के जवाब में podocytes में एनटीएस। चित्रा -4 ए के पहले और 10 माइक्रोन एटीपी के अलावा के बाद (4.5 में वर्णित) 2 मिमी कैल्शियम युक्त समाधान में Fluo-4 और Fura लाल के साथ दाग चूहे ग्लोमेर्युल्स के प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। हरे रंग में एक नाटकीय वृद्धि नोट (Fluo-4 बजे) (तीर के साथ चिह्नित) podocytes के प्रतिदीप्ति, और Fura लाल प्रतिदीप्ति में एक बूंद (लाल pseudocolor)। FuraRed नीचे चला जाता है, जबकि कोशिका के भीतर कैल्शियम एकाग्रता, 4 तीव्रता ऊपर चला जाता है Fluo बढ़ जाती है जब Fluo4 और FuraRed, उलटी दिशा यानी में 488 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि दर्शाते हैं। यही कारण FuraRed फ्लोरोफोरे की दोहरी उत्तेजना प्रकृति के लिए संभव है। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के आधार पर यह प्रतिदीप्ति में इसी वृद्धि या कमी के साथ कैल्शियम बाध्य (420 एनएम) या कैल्शियम मुक्त (488 एनएम) फ्लोरोफोरे की तरह व्यवहार कर सकते हैं। इसलिए, एक अकेले ratiometric इमेजिंग मोड में FuraRed का उपयोग हालांकि, यह requir के लिए संभव है420 एनएम और 488 एनएम - दो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य तों। यह कम से कम दो बार (एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के उपयोग की तुलना में) इमेजिंग की आवृत्ति में कमी होगी; शोधकर्ता इमेजिंग की तेज गति को बनाए रखना चाहते हैं, तो छवि संकल्प कम किया जाना चाहिए। इन fluorophores के एक ही 488 एनएम लेजर से उत्साहित है, और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का एक अच्छा भेदभाव प्रदान किया जा सकता है के रूप में हालांकि, fluo 4 और FuraRed, इमेजिंग आवृत्ति में संकल्प या कमी की हानि के बिना एक ratiometric मोड में एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। ROIs से संक्षेप एक ठेठ क्षणिक चित्रा -4 ए में तीर 4B चित्रा में दिखाया गया है साथ चिह्नित; ग्राफ स्पष्ट रूप से कई मिनट के भीतर decays जो 10 माइक्रोन एटीपी, के अलावा के बाद Fluo4 / FuraRed तीव्रता के अनुपात में एक तीव्र वृद्धि को दर्शाता है। छवियाँ हर 4 सेकंड ले जाया गया है, और इसलिए, तकनीक कोशिका के भीतर कैल्शियम एकाग्रता में तेजी से परिवर्तन का अवलोकन करने की अनुमति देता है।


प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा। पशु ठीक से anaesthetized और सर्जरी के लिए तैयार किया जाता है के बाद, गुर्दे रक्त को निकालने के लिए पीबीएस के साथ प्लावित कर रहे हैं। फिर, गुर्दे excised और decapsulated, और ग्लोमेरुली अंतर sieving के द्वारा गुर्दे की छाल से अलग कर रहे हैं कर रहे हैं। यहाँ, नमूना के भाग पैच दबाना विश्लेषण के लिए लिया जाता है, और बाकी फ्लोरोसेंट कैल्शियम रंगों और confocal ratiometric कैल्शियम इमेजिंग किया जाता है के साथ भरी हुई है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Podo में TRPC कैल्शियम चैनल की गतिविधि दिखा चित्रा 2. प्रतिनिधि रिकॉर्डिंगहौसले से अलग चूहे ग्लोमेरुली की cytes। बाएं पैनल में एक सेल संलग्न विन्यास में एक electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान ग्लोमेर्युल्स की सतह पर podocyte शरीर से जुड़ी पैच दबाना पिपेट दर्शाता है; एक capsulated ग्लोमेर्युल्स का एक हिस्सा छवि के अधिकार के निचले कोने में देखा जा सकता है। एक -40 एम वी होल्डिंग क्षमता पर चूहा ग्लोमेर्युल्स की podocyte पर किए गए एक सेल संलग्न पैच से TRPC-जैसे चैनलों गतिविधि के प्रतिनिधि वर्तमान पता लगाने के अधिकार पर दिखाया गया है। सी और ओ मैं बंद और खुले चैनल के स्तर को निरूपित, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि प्रयोग में intracellular कैल्शियम के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन podocytes। ग्लोमेरुली Fluo-4 बजे, प्रतिदीप्ति तीव्रता आधारभूत में और ionomycin और MnCl 2 के अलावा के बाद दर्ज की गई है के साथ लोड कर रहे हैं, intracellular कैल्शियम एकाग्रता के लिए उपाय। ग्राफ डाई और सबसे कम प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ मिनट) में परिणाम quenches जो और MnCl 2, (Fluo-4 प्रतिदीप्ति, एफ मैक्स की अधिकतम उत्पादन) ionomycin के जवाब में प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन को दर्शाता है। हर समय बिंदु के लिए प्रतिदीप्ति (बाएं भुज) की तीव्रता 6.3 में सूत्र के अनुसार (दाएं भुज) nanomoles में वास्तविक कैल्शियम एकाग्रता में अनुवाद किया जा सकता है। एफ, एफ अधिकतम और एफ मिनट की गणना की गई है जब समय बिंदुओं पर podocytes दिखा छवियों के साथ insets के नोट। यहाँ दिखाए गए ग्राफ में एक चक्र (आरओआई) द्वारा चिह्नित podocyte के प्रतिदीप्ति तीव्रता को दर्शाता है; छवियाँ हर 4 सेकंड ले जाया गया।"एन.के.> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा एटीपी के जवाब में podocytes में कैल्शियम यात्रियों 4. मापन। (क) पहले और 10 माइक्रोन एटीपी के बाद इसके अलावा 2 मिमी कैल्शियम युक्त समाधान में Fluo-4 (हरी pseudocolor) और Fura लाल (लाल pseudocolor) के साथ दाग जंगली प्रकार चूहा ग्लोमेर्युल्स illustrating प्रतिनिधि छवियाँ। दवा के आवेदन से पहले कम तीव्रता हरे रंग का प्रतिदीप्ति ध्यान दिया जाना चाहिए। (बी) 10 माइक्रोन एटीपी के आवेदन के द्वारा podocytes में पैदा intracellular कैल्शियम क्षणिक का उदाहरण संक्षेप। वें से कैल्शियम डिपो और कैल्शियम बाढ़ की उत्तेजना और कमी के लिए खातों दवा है, जो के अलावा निम्नलिखित Fluo-4 / Fura लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात में एक मजबूत और तेजी से वृद्धि के नोटई बाहर सेल में, intracellular कैल्शियम एकाग्रता की ऊंचाई में जिसके परिणामस्वरूप। त्रुटि सलाखों के एक ही ग्लोमेर्युल्स के 11 podocytes के लिए गणना का मतलब है की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण कृंतक ग्लोमेरुली की podocytes से कैल्शियम से निपटने के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक को पैच दबाना एक चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और प्रतिदीप्ति ratiometric confocal इमेजिंग के आवेदन की अनुमति देता है। हालांकि, दोनों तरीकों को अपने दम पर, अलग से इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल 1) गुर्दे फ्लश सहित कई अपेक्षाकृत सरल कदम, है; 2) अंतर sieving के द्वारा ग्लोमेरुली के अलगाव; 3) पैच दबाना electrophysiological प्रयोगों का प्रदर्शन, या intracellular कैल्शियम में परिवर्तन के ratiometric confocal इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट कैल्शियम लेबलिंग रंगों के साथ ग्लोमेरुली की ऊष्मायन।

ग्लोमेरुली, Gloy के आधार पर एक संशोधित प्रोटोकॉल को अलग-थलग करने के लिए एट अल। 5 इस्तेमाल किया गया था। अंतर sieving की मौजूदा तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह परिष्कृत और समय लेने वाली कदम की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार बोमन कैप्सूल ने छीन ग्लोमेरुली पैदा करता है और वह यह है किपुस्तिका decapsulation की। अलग अंश में ग्लोमेरुली के बहुमत decapsulated कर रहे हैं, हालांकि शोधकर्ता भी, capsulated ग्लोमेरुली पता है कि वहाँ होना चाहिए। कैप्सूल podocytes तक पहुँचने से दवाओं को रोकता है, क्योंकि यह बोमन कैप्सूल के बंद छीन ग्लोमेरुली imaged रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 2 में देखा capsulated ग्लोमेरुली चिकनी और दौर के आकार में दिखाई देते हैं, जबकि decapsulated ग्लोमेरुली, अलग केशिकाओं और podocyte निकायों के साथ किसी न किसी सतह है। इसके अलावा, Fluo4 और FuraRed भरी हुई ग्लोमेरुली decapsulated वालों की तुलना में कम तीव्र प्रतिदीप्ति संकेत फेंकना समझाया।

प्राप्त चूहे ग्लोमेरुली के अंश का 95% (समीपस्थ नलिकाओं के निशान के साथ) शुद्ध और यदि आवश्यक हो तो आसानी से पश्चिमी सोख्ता या अन्य आणविक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह इस तैयारी में podocytes केशिकाओं से जुड़े होते हैं कि असाधारण महत्वपूर्ण है, एक भाग के रूप में बरकरार पैर प्रक्रियाओं और समारोह को बनाए रखनेदेशी ग्लोमेर्युल्स निस्पंदन उपकरण मशीनरी की। podocytes से कैल्शियम से निपटने के तंत्र मधुमेह या उच्च रक्तचाप 9-12 के रूप में इस तरह के रोगों में गुर्दे की जटिलताओं के विकास और रोकथाम में एक आवश्यक नियामक भूमिका की सेवा। गंभीर चोट podocyte आकृति विज्ञान और संरचना बदल और प्रोटीनमेह 2,3,13-15 कारण हो सकता है तथ्य यह है कि इसका सबूत के रूप में Podocytes, पारगम्यता बाधाओं में महत्वपूर्ण योगदान। इसलिए, यह आसानी से इस तैयारी में जांच की जा सकती है, जो दवाओं के लिए इन कोशिकाओं में कैल्शियम बाढ़ की जवाबदेही निरीक्षण करने के लिए बहुत महत्व का है। यह शोधकर्ता एक रोग राज्य में podocytes जांच कर रही है, तो आमतौर पर प्रोटीनमेह और ग्लोमेरुली नुकसान में परिणाम है, जो उदाहरण के लिए, उच्च रक्तचाप या मधुमेह, के लिए, ग्लोमेरुली की उपज स्वस्थ पशुओं की तुलना में कम शुद्ध हो सकता है कि समझ में आ जाना चाहिए। यह हमेशा के नुकसान से बचने के लिए अलगाव की प्रक्रिया के हर चरण में ग्लोमेरुली को भिन्न नजर रखने के लिए सिफारिश की हैऊतक। कुछ मामलों में, वृद्ध या जवान भी जानवरों से भारी रोगग्रस्त ग्लोमेरुली या ग्लोमेरुली बड़े / छोटे जाल sieves के चयन सहित अलगाव की प्रक्रिया के व्यक्तिगत समायोजन, आवश्यकता हो सकती है।

हम podocytes 16 में कैल्शियम TRPC चैनलों के निषेध में गैर स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाओं की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए शुरू में इस दृष्टिकोण का आवेदन किया है। इन अध्ययनों 7,16-22 बाद हम podocytes समारोह को नियंत्रित करने के लिए कई महत्वपूर्ण तंत्र स्थापित करने के लिए वर्णित तकनीक कार्यरत हैं। उदाहरण के लिए हम चूहों के podocytes में p2 (purinergic) रिसेप्टर्स की प्रोफाइल वर्णित और माउस ग्लोमेरुली में Angiotensin द्वितीय द्वारा कैल्शियम बाढ़ के विनियमन को परिभाषित किया है। एक बाद की पांडुलिपि 20 में वर्णित है, प्रोटोकॉल चूहों जैसे चूहों में, बल्कि अन्य प्रजातियों में ही नहीं इसी तरह के अध्ययन, प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। दो फ्लोरोसेंट के उपयोग के साथ ratiometric कैल्शियम प्रतिदीप्ति इमेजिंग (रंगों - Fluo-4 और Fura लाल) डेटा के अतिरिक्त विश्वसनीयता सुनिश्चित करता है, और यदि आवश्यक कैल्शियम इमेजिंग अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ जोड़ा जा सकता है अगर podocytes भीतर अन्य पदार्थों में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए। उदाहरण के लिए, हम DAF-एफएम डाई की मदद से नाइट्रिक ऑक्साइड को मापने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है। पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अकेले इस्तेमाल किया जा सकता है या कैल्शियम इमेजिंग के साथ संयोजन में (स्थापना अनुमति)। इसके अलावा कैल्शियम चैनल से, तकनीक अन्य आयन चैनल की गतिविधि रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। हाल ही में डॉ ड्रायर के समूह में 23 से दिखाया गया है के रूप में इसके अलावा, अभिकर्मक और siRNA का उपयोग करते हैं, यहां तक कि अधिक आवेदन के क्षेत्र का विस्तार हो सकता है।

परम्परागत epifluorescence माइक्रोस्कोपी के बजाय कम सस्ती confocal इमेजिंग का यहां इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, शोधकर्ता विस्तृत क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के प्रभावी संवेदनशीलता आम तौर पर बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश द्वारा सीमित है कि बारे में पता होना चाहिए। कोंफोकल कल्पना करने के लिए यह (में तुलनाछ) एकल रॉय (podocyte) या उसके पैर प्रक्रियाओं के उच्च छवि संकल्प का उत्पादन करने में असमर्थता के रूप में ऐसी सीमाओं का कारण बनता है। यह ग्लोमेर्युल्स और गहरी ऊतक की सतह के बीच अंतर करना मुश्किल है के रूप में इसके अलावा, व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी podocytes की पहचान पेचीदा हो। अब के रूप में confocal इमेजिंग के लिए विभिन्न fluorophores के वाणिज्यिक उपलब्धता काफी बेहतर है और तेजी से विस्तार हो रहा है। वैकल्पिक रूप से, epifluorescence पढ़ाई आसानी से एक साथ इंट्रासेल्युलर सीए 2 + और ​​एक चैनल गतिविधि रिकॉर्डिंग प्रदान कर सकते हैं, जो एक electrophysiological सेटअप के साथ जोड़ा जा सकता है। फिल्टर पहिया monochromator और तटस्थ घनत्व फिल्टर स्थापना के साथ ग्लोमेरुली podocytes की Fura2-पूर्वाह्न लोड हो रहा है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है, लेकिन हमेशा गुणवत्ता के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है।

यह भी अलग, कार्यात्मक ग्लोमेर्युल्स शारीरिक उत्तेजनाओं के जवाब में इसकी मात्रा को बदलने में सक्षम है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। शोधकर्ता का प्रदर्शन करते हुए के बारे में पता होना चाहिएप्रयोगों, और ध्यान से ध्यान केंद्रित करने के नुकसान से बचने के लिए कोंफोकल अध्ययन के दौरान फोकल हवाई जहाज़ चुनते हैं, और अनायास ही संकुचन या विश्राम का परीक्षण करने के क्रम में उपन्यास दवाओं के चयन पर नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं।

इस तकनीक कृंतक पृष्ठभूमि की एक किस्म में औषधीय उपचार या अन्य जोड़तोड़ के बाद एकल आयन चैनल पर कैल्शियम बाढ़ में परिवर्तन और व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर नजर रखने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। एक संशोधित प्रोटोकॉल निस्संदेह असाधारण बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेगा, जो गुर्दे की बायोप्सी से प्राप्त ऊतकों को लागू किया जा सकता है के रूप में इस तकनीक को भी मानव गुर्दे की बीमारी अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, कैल्शियम एकाग्रता माप सामान्य और रोग की स्थिति में podocytes भीतर से निपटने कैल्शियम के नियमन में गहराई और यंत्रवत अंतर्दृष्टि और अधिक प्रदान कर सकता है, जो वास्तविक समय में electrophysiological पैच दबाना प्रयोगों के साथ जोड़ा जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

लेखकों माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ग्लेन Slocum (विस्कॉन्सिन मेडिकल कॉलेज) और लड़की ए Lavin (Nikon उपकरण, Inc) को धन्यवाद देना चाहूंगा। ग्रेगरी Blass पांडुलिपि के महत्वपूर्ण proofreading के लिए स्वीकार किया है। इस शोध (के रूप में करने के लिए) 1-15-बी एस-172, और (डीवीआई करने के लिए) नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की ओर से बेन जे Lipps रिसर्च फैलोशिप अनुदान स्वास्थ्य अनुदान HL108880 और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-ʟ-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68 solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low pass filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
mesh 200 Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
Polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia VetEquip, Inc. 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

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References

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