Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.
Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.
गुर्दे विभिन्न पदार्थों के लिए समस्थिति संतुलन बनाए रखने और कुल रक्तचाप को निर्धारित करता है कि एक तरह से रक्त की मात्रा को विनियमित। अति या हाइपोटेंशन से लेकर गुर्दे छानने का काम, पुनःअवशोषण या स्राव नेतृत्व में गड़बड़ी या साथ देने के रोग राज्यों, अंत में गुर्दा प्रत्यारोपण की आवश्यकता है कि मंच गुर्दे की बीमारी समाप्त करने के लिए। केशिका अन्तःचूचुक, तहखाने झिल्ली और उपकला कोशिकाओं के एक एकल कोशिका परत – – भट्ठा-डायाफ्राम अखंडता और समारोह 1 के रखरखाव में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं जो podocytes, गुर्दे छानने इकाई (ग्लोमेर्युल्स) तीन परतें होती हैं। Permselective केशिकागुच्छीय फिल्टर में शिथिलता ऐसे प्रोटीनमेह के रूप में अणुओं के मूत्र हानि का कारण बनता है। विभिन्न एजेंटों ग्लोमेरुली निस्पंदन बाधा की अखंडता को निर्धारित जो podocytes और उनके पैर प्रक्रियाओं, की संरचना को प्रभावित कर सकता है।
podocytes glom के रखरखाव में शामिल कर रहे हैंeruli निस्पंदन समारोह। यह podocyte द्वारा अनुचित कैल्शियम हैंडलिंग सेल चोट की ओर जाता है और nephropathies 2,3 के विभिन्न रूपों की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि स्थापित किया गया है। इसलिए, podocyte समारोह के अध्ययन के लिए सहायक होगा intracellular कैल्शियम एकाग्रता परिवर्तन का सीधा मापने के लिए अनुमति देता है जो एक मॉडल का विकास। पृथक ग्लोमेरुली पहले से एल्बुमिन प्रतिबिंब गुणांक की माप 4 और पूरे सेल electrophysiological पैच दबाना माप 5,6 में अभिन्न सेलुलर धाराओं के आकलन परिवर्तन सहित एक कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया। वर्तमान पत्र में हम, औषधीय एजेंटों के आवेदनों के जवाब में intracellular कैल्शियम एकाग्रता परिवर्तन को मापने कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम के बेसल के स्तर का अनुमान है, और व्यक्तिगत कैल्शियम चैनल गतिविधि का आकलन करने के लिए शोधकर्ता की अनुमति देता है कि प्रोटोकॉल का वर्णन। Ratometric कैल्शियम एकाग्रता मापन और पैच दबाना electrophysiology क्रमश: podocyte और चैनल गतिविधि के भीतर intracellular कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया।
यहाँ वर्णित दृष्टिकोण कृंतक ग्लोमेरुली की podocytes से कैल्शियम से निपटने के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक को पैच दबाना एक चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और प्रतिदीप्ति ratiometric confocal इमेजिंग के आवेदन की अ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ग्लेन Slocum (विस्कॉन्सिन मेडिकल कॉलेज) और लड़की ए Lavin (Nikon उपकरण, Inc) को धन्यवाद देना चाहूंगा। ग्रेगरी Blass पांडुलिपि के महत्वपूर्ण proofreading के लिए स्वीकार किया है। इस शोध (के रूप में करने के लिए) 1-15-बी एस-172, और (डीवीआई करने के लिए) नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की ओर से बेन जे Lipps रिसर्च फैलोशिप अनुदान स्वास्थ्य अनुदान HL108880 और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।
Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm |
Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
TEA chloride | Tocris | T2265 | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |