Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J. Vis. Exp. (101), e52983, doi:10.3791/52983 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

İnsan beyni tahmini 85000000000 nöron ve glial 1 de dahil olmak üzere 85000000000 bir başka nöronal-olmayan hücreleri ihtiva eder. Olarak İngilizce'ye tercüme 'glia' dolayısıyla Yunan etimolojisi - sinirbilimciler nöronal hücre popülasyonu üzerinde ağırlıklı olarak odaklanmıştır son 100 yıl daha fazla parçası için, glial hücreler inanan nöronlar için yapısal destek sağladı pasif destek hücreleri biraz daha fazla olması 'tutkal'. Son zamanlarda, ancak nöronal-glial etkileşimleri nörobiyoloji, nörofizyoloji ve birçok nörodejeneratif hastalıkların oluşumu ve ilerlemesinde temel yönlerine çok daha temel olabileceğini giderek daha belirgin hale gelmiştir. Serebellar granül hücreleri (CGCs), insan beyninde en bol homojen nöronal nüfus, beyincik hakim ve hücresel bileşenlerin% 90'ından fazlasını oluşturuyor. Sonuç olarak, bu hücreler, t için bir model sistem olarak in vitro kapsamlı olarak kullanılmaktadırO nöronal gelişim, işlev ve patoloji 2-6 çalışma.

Bununla birlikte, CGC kültürleri halen en önemli oranlarda mikroglia ve glia içerir. Sonuç olarak, varsayım olarak farklı hücre tedavilere doğrudan nöronal yanıt veren CGC veriler, aslında ortaya çıkabilecek - kısmen veya toplam - kültürde glia komşu dolaylı, ikincil karşılık gelen. Bu değerlendirme için, seçici olarak, L-lösin metil ester (LME) yardımı ile CGC nöronal kültürlerde mikrogliyal ortadan kaldırmıştır. LME orijinal seçici makrofajlar 7 yok etmek için kullanılan bir lysomotropic madde olduğu için ve aynı zamanda seçici olarak nöral, astrosit ve karışık glial kültürler 8,9,10 gelen mikroglia tüketmek için kullanılmıştır. LME o lizozomal bozulması ve sonraki apoptoz 13,14 sebep olup, makrofajlar ve mikroglia tarafından içselleştirilir. Makrofajlar ve mikroglia onları particula olmaya neden lizozomlarda karakteristik zenginLME tedavisine maruz kalma üzerine rly hassas. Bu protokol GCG'ye ve diğer nöronal / glial kültür sistemleri kullanılarak deneylerde mikroglia katkısını araştırmak için güçlü, henüz basit ve kolay bir yol sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada tarif Bütün deneyler Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası uyarınca yapıldı.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

  1. İki paslanmaz çelik laboratuar kesme makasları ve iki paslanmaz çelik laboratuar forseps hazırlayın. Bir kültür kukuleta O tüm aletleri ve yer Otoklav / N sterilizasyon ultraviyole ışık (UV) ışık altında.
  2. Minimum temel ortam (MEM), kültür ortamı (500 ml yapmak% 10 Fetal Sığır Serumu [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glukoz, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 6 ug / ml ampisilin) ​​ve filtre sterilize edin. Ay için 4 ° C'de depolayın.
  3. 14 mm, 1 numaralı kalınlık lamelleri içeren 24 kuyu kültür tabak hazırlayın. Daha önce tarif edildiği gibi 3, 100 mg / L, poli-D-lisin (PDL) lamelleri ve kat otoklava. UV ışığı O / N sterilize edin.

CGC Kültür Çözümleri 2. Hazırlık

  1. Tedavi otoklavlanmış, UV ışığı, steril dH 'Çözelti A' (100 mi) Hazırlama glikoz, 250 mg, sığır serumu albümin [BSA], 300 mg, fosfat tamponlu salin [PBS] (Ca + 2 ve 955 mg 2 O Mg) + ücretsiz ve% 3.8 1 ml MgSO 4 · 7H- 2 O.
  2. Çözelti A 9 ml seyreltilmiş / ml tripsin 5 mg 1 ml içeren "çözelti, B '(10 mi) Hazırlama
  3. 'Çözelti C' 1000 birim DNAaz, soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 0.5 mg, çözelti A ile 10 ml olacak şekilde seyreltildi% 3.8 MgSO 4 · 7H 2 O 100 ul, ihtiva eden (10 mi) Hazırlama
  4. Çözelti A ile 20 ml olacak şekilde seyreltildi çözelti C 3.2 ml, içeren "çözelti, D '(20 mi) Hazırlama
  5. · 7H 2 O EBSS, 25 mM NaHCO 3, 3 mM MgSO 4 BSA / Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) çözeltisi hazırlayın ve% 4 BSA, pH 7.4, daha önce tarif edilen 3.
  6. , 150 mM LME bir son konsantrasyon elde etmek için MEM kültür ortamı 5 ml saf LME ekleyerek LME Hazırlama bir tezgah üstü pH metre kullanılarak pH 7.4'e çözelti döner ve filtre, bir 28 mm, polieter sülfon (PES) 0.2 mikron bir şırınga kullanılarak sterilize Filtre.

3. CGCs Kültürleme

  1. Daha önce 3 açıklandığı gibi 4-7 gün eski sıçan yavrularından cerebella toplayın. Buz üzerinde 5 ml solüsyon A içeren Petri kabındaki hemen yerleştirin.
  2. Petri kabı kapağı cerebella ve yer dokusundan fazla çözüm kapalı dökün.
  3. En az üç farklı yönlerde iyi Alevli jilet ile ince doku doğranır.
  4. 5 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosu içerisinde çözeltisi (kaybolur, sınırlı doku sağlamak için solüsyonu ile Petri kabı durulama) B ve yere doğranmış doku ekleyin. Min yavaşça her çift sallayın.
  5. Tripsin, sarsıntısından yüzde nötralize etmek için tüp D çözeltisi (20 mi) ilave5 dakika boyunca 65 xg'de rifuge.
  6. Süpernatantı dökün.
  7. Süspansiyon mümkün olduğu kadar homojen hale gelinceye kadar, çapı azaldıkça üç alevli bir cam pipet ile iyice Çözelti C trituratının 4 ml (yaklaşık 10 kat her) içinde süspanse edin.
  8. Yavaş yavaş ve hafifçe BSA / EBSS'ye üstünde Bu homojenat birkaç damla ekleyin. O BSA / EBSS'ye aracılığıyla batmaya başlarsa, daha çiğnemek ve / veya homojenat BSA / EBSS'ye üstünde bir tabaka halinde oturmak gerekir biraz daha çözüm C. ekleyin. Sallamayın. 5 dakika boyunca 100 xg'de Spin.
  9. Süpernatantı ve MEM orta 1 ml tekrar süspansiyon pelet (yumuşak) sökün.
  10. MEM ortamı içinde 500 ul 800,000 hücre / Lamel bir hemositometre ve plaka kullanarak hücreleri sayın. % 6 CO2 ile 37 ° C 'de, bir kuluçka makinesi içinde yer.
  11. Ortamı aşağıdaki gün (hazırlık sonrası 24-36 saat) değiştirin. Hücre döngüsü önleyicisi arabinofuranozil sitidin (AraC) 10 uM içeren MEM ortam maddesi içeren bir çözelti yapmak.
    1. Her biri içinLamel, sırt hücreleri ve kontör eski orta 250 ul ekleyin, taze 24 plaka eski orta 250 ul korumak kalanını aspire normal MEM orta 250 ul ekleyin ve sonra, hücreler yıkamak için bu aspire Araç-içeren ortama, 250 ul.
      Not: Hücreler, in vitro (DIV), 6 gün arasında kullanılabilir.

4. Seçici mikrogliada İncelten (6 DIV de yapılır)

  1. 150 mM LME bir son konsantrasyon elde etmek için MEM ortamı ayrı bir kısım, 5 ml saf LME ekleyin.
  2. PH 7.4 çözüm dönün ve filtre 28 mm polieter sülfon (PES) 0.2 mikron şırınga filtresi kullanılarak sterilize edin.
  3. Kontrol kültürleri için normal bir MEM ortam maddesi ile birlikte 10 dakika boyunca 37 C 'de bir su banyosunda MEM ortamı ve yerine 50 mM (2 x LME) bir konsantrasyona kadar seyreltilir.
  4. Yarısını (250 ul), CGC kültürleri MEM Ortamı çıkarın ve 37 ° C'de saklayın.
  5. Sağlıgı hücrelerya da kontrol kültürleri için LME olmayan, önceden ısıtılmış MEM ortam maddesi (250 ul) ile 25 mM arasında iyi olarak konsantrasyonu veren 1: örneğin, 2 x LME (250 ul) ihtiva eden MEM ortam maddesi, 1 seyreltilmiştir.
  6. 1 saat boyunca% 6 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  7. Iki kez, taze, önceden ısıtılmış MEM ortamı içinde yıkayın hücreleri LME içeren medya kaldırmak ve daha sonra kalan kültür ortamı ve ilgili çukurlara taze, önceden ısıtılmış MEM ortamının eşit bir hacmini değiştirmek için kullanılır.
  8. (37 ° C'de% 6 CO2 ile nemlendirilmiş) inkübatör kültürler dönün ve başka tedavi öncesi 24 saat dinlenmeye bırakın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

seçici CGC ve / veya karışık kültürlerden mikroglia ortadan kaldırmak için bu tekniğin yeteneği doğru tespit etmek ve bunların çevredeki hücrelerden mikroglia ayırt etmek araştırmacının sonraki yeteneğine dayanır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu, örneğin isolectin-B4 gibi bir mikroglial spesifik hücre makinesi kullanılarak elde edilebilir. Şekil 2'de de gösterildiği gibi, astrosit ve nöronal yoğunluk ve morfolojisi gözlenebilir bir değişiklik, her ana tedavi grubu ile ilgili olarak kaydedildi. Kültürler bileşiğin bir mikroglial özgü işlem destekleyici tek başına LME ile tedavi edildiğinde Önemli olarak, nöronal ya da astrositik morfolojisinde belirgin bir değişiklik gözlemlenmiştir. Şekil 3A, astrosit yoğunluğu ve primer, kemirgen astrosit kültürü 12 morfolojisinde gözlenebilir bir değişiklik gösterir, ancak yapar kirlenmesine mikroglia kaybı gösterir. Şekil 3B'de, A'da olduğu gibi, herhangi bir değişiklik astrocy bölgesindekite yoğunluğu ve morfolojisi görüldü; Ancak, mikrogliyal numarası ve reaktivite kirlenmesine bir kayıp gözlendi. Bu yazıda kullanılan immünsitokimya (ICC) protokolü kısa bir açıklama için, 11 başvuru bakınız.

Şekil 1
Şekil 1: CGCs LME tedavisi karakterizasyonu. İmmünositokimya (A) Örnek görüntüler (ICC) deneyleri, yıkama-off ardından, 1 saat süre ile 25-75 mm LME ile muamele edildikten sonra CGC kültürleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. ICC mikroglial tespit edilmek ve nicelendirilmek üzere toplam hücre sayısının ölçülmesi için DAPI (mavi) ve bu gösteren apoptotik morfolojisi ve isolectin-B4 (IB 4) (yeşil) ile gerçekleştirilmiştir. Ölçek çubuğu 30 mikron =. Nükleer kromatin yoğunlaşması olarak tanımlanan apoptotik morfoloji, (gri çubukları görüntüleyerek hücrelerin (B) Niceleme;% 'siKontrol seviyeleri (yeşil çubuklar) bir yüzdesi olarak alanındaki toplam hücre sayısı) ve toplam olarak mikroglial sayısı. Student t-test ile ilgili kontrol ve LME belirli bir tedavi arasında gerçekleştirildi; * P <0.05, ** p <0.01, *** P <0.001; n = 3 (yani 3 bağımsız tekrarlar).

Şekil 2,
Şekil 2: CGC kültürlerde nöronlar ve astrositler 25 mM LME tedavisinin etkilerinin Karakterizasyonu. 1 saat 25 mM LME tedavisinden sonra CGC kültürler üzerinde yapılan deneyler ICC temsili görüntülerinin Paneli. ICC astrositik yoğunluk ve morfolojik değişikliklerin belirlenmesi için DAPI (mavi) nöronal yoğunluk ve anti-GFAP (kırmızı) değişikliklerin belirlenmesi için, bir anti-β-III-tubulin (yeşil) ile gerçekleştirilmiştir. Negatif kontrol (-ve TO) görüntüleri CGC kültürleri temsil eder birincil Antikorlarıns ihmal edilmiştir. Ölçek çubuğu 30 mikron =.

Şekil 3,
Şekil 3: astrositik kültürlerden mikroglia kaldırılması, 25 mM LME tedavinin etkinliği daha başka karakterizasyonu. 1 saat boyunca 25 mM LME ile ön-muameleden sonra, birincil astrosit kültürleri üzerinde yapılan ICC deneylerden Örnek görüntülerin (A) panel. ICC astrositik yoğunluk ve morfolojisi ve mikroglial sayısının belirlenmesi için, anti-ED1 (yeşil) değişikliklerin belirlenmesi için DAPI (mavi), anti-GFAP (kırmızı) ile gerçekleştirilmiştir. (B) 1 saat boyunca 25 mM LME ile ön-muamele, aşağıdaki 24 saat boyunca LPS (1 ug / ml) ile muamele sonrası, birincil astrosit kültürleri üzerinde yapılan ICC deneylerden Örnek görüntüler. Aktif microg tanımlamak için değil, anti-GFAP (yeşil) ve anti-İNOS (kırmızı) ile tarif edildiği gibi, ICC gerçekleştirilmiştirlia. Primer antikorlar ihmal edildi, burada Negatif kontrol (-ve TO) görüntüleri CGC kültürleri temsil etmektedir. Ölçek çubuğu 30 mikron =.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En önemli adımlar CGC gelen mikroglia başarılı bir şekilde seçici olarak ortadan kaldırılmasını sağlamak için ve / veya karışık kültürler: 1) steril ve sağlıklı CGC kültür muhafaza edilmesini; 2) Filtre LME içeren ortamı sterilize ve pH 7.4 çözüm dönen; 3) muhafaza CGC medyayı tutmak ve 37 ° C'de medya LME içeren Isı çarpmasını önlemek için C °; ve 4) hücreler inkübatör dışında tutulur süresini azaltmak için hızlı çalışıyor.

Daha önce laboratuarımızda optimize bir konsantrasyonda - bizim CGC kültürleri mikroglia tüketmek için 25 mM LME kullanılır. Bununla birlikte, bazı mikrogliya hala bazı farklılaştırılmış olmayan çoğalan mikrogliya bir nüfusa yansıtıyor olabilir inanıyorum LME tedavisi, aşağıdaki kültür kalır. Gerçekten de, Hamby ve ark. (2006), 50-75 mM LME yüksek yoğunluklu astrosit mono tabakaları 13 arasında mikroglia ortadan kaldırmak için gerekli olduğu bulunmuştur. Biz de daha önce gösterilen saf mikrogliyal c olduğunu varultures, 10 mM LME Tüm mikroglia öldürmek için yeterli, ancak 24 saatlik bir enkübasyon süresi 14 idi.

Mikroglia kontamine hücre kültürü modelleri kurtulmak için alternatif yöntemler son zamanlarda gün ışığına çıkmıştır. Crocker ve ark., (2008) (P0-P2) farenin 15 postnatal astrositler olarak nöral kök hücre (MGK) farklılaşmasını teşvik ederek astrosit kültürleri mikroglia ortadan kaldırmak için yeni bir yaklaşım gösterdi. Onlar fenomenleri altında yatan mekanizmalar bilinmemektedir olmasına rağmen bu teknik tamamen kültürlerden gelen mikroglia ortadan bulundu. . Buna ek olarak, kumamaru ve arkadaşları, (2012) lipozom klodronat kullanılan - makrofajlarda apoptosisi teşvik ettiği bilinen bir biophosphonate - P3 fareler 16 birincil astrosit kültürlerinde mikroglia ortadan kaldırmak için. Bu bileşik, benzer bir şekilde ve LME, etkinlik aynı seviyede çalışır; Yazarlar LME belirli koşullar altında astrositlere toksik olabilir gibi iddia olsaastrosit yapışma kapasitesi 13 engellemeden - - Vadesi hücrelere serbest difüzyon lipozomal klodronat kültüründen mikroglia tüketmek için geliştirilmiş bir yöntem temsil eder. Biz, ancak, 25 mM LME hiçbir astrosit canlılığı veya çoğalması etkilemez bulundu.

Bu tarifnamede açıklanan protokol seçici CGCs bir nöronu ile zenginleştirilmiş kültürlerde mikroglia ortadan kaldırmak için LME belirli bir konsantrasyonunu kullanır. Bu çeşitli koşullar altında nöronlar üzerindeki mikroglia etkisini belirlemek için güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder ve nörolojik bozukluklarda nöro rolünü araştıran araştırmacıların önemli veriler sunmaya devam etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps  Sigma-Aldrich F4142 The curved end facilitates removal of the cerebellum 
Micro-dissecting scissors Sigma-Aldrich S3146 Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection 
L-leucine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 7517-19-3
EBSS solution  Sigma-Aldrich E7510-500 ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich 27964-99-4 Coat coverslips 1 day before use 
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
DNase Sigma-Aldrich D5025
Soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich T6414
Mouse anti-ED1 antibody  Abcam ab31630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26, (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11, (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73, (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1, (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131, (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13, (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49, (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56, (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7, (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105, (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90, (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics