Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması
Chapters
Summary June 9th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada, fare beyinciğindeki granül nöronların sinaptogenezini, doğum sonrası beyin gelişiminin zaman boyunca, bu hücreler sinaptik yapılarını rafine ettiklerinde ve kendilerini genel beyin devresine entegre etmek için sinapslar oluşturduklarında görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Transcript
Protokol, anahtar morfolojik büyümeyi görselleştirmek için gelişimin farklı aşamalarında serebellar granül nöronları inceler. Tekniğin avantajları, hücreye özgü hedefleme, transfekte yapıların hızlı ekspresyonu ve hücre özerk etkilerinin incelenmesine izin veren hücrelerin seyrek etiketlenmesini içerir. Bir yükleme pipeti ucundan 11,2 milimetrelik bir segmenti keserek başlayın ve enjeksiyon derinliğini 1,5 milimetre ile sınırlamak için kesilen parçayı Hamilton şırıngasının ucuna ara parça olarak yerleştirin.
Ara parçayı şırınga ucuna yapıştırıcı veya parafilm ile sabitleyin. Deneysel yavrunun sagital beyin bölümlerinden tek elektroporated CGN'lerin morfolojisini incelemek için, konfokal mikroskopta yığın başına 0.5 mikrometrede Z-yığını görüntüleri alın. Kolay görüntü analizi ve 3D yeniden yapılandırma sağlamak için görüntü penceresi başına bir hücre görüntüleyin.
Basit nörit izleyici kullanarak nörit uzunluğunu ve dendritik pençe oluşumunu kör bir şekilde analiz edin. Elektroporated CGN'lerin tek kanallı Z-stack görüntülerini Fiji'ye yükleyin ve açılır menüden Eklentiler"Segmentasyon" ve Basit Nörit Tracer"Yeni 3D Görüntüleyici Oluştur'u seçin" e tıklayın. Soma hücresine bağlanan bir dendritin tabanına kaydırın ve kavşağa tıklayarak bir yol başlatın.
Hücre doldurma sinyalinin en parlak olduğu bölümleri tıklatıp izi korumak için Y tuşuna basarak yolu manuel olarak izleyin. Dendritin sonuna kadar izleyin ve F.Alternatif olarak, pençenin tabanına kadar izleyin. Daha sonra, pençeyi yapının tabanından en uzun nöritin sonuna kadar izleyin.
Pencerelerde Control tuşunu veya macOS'te ALT tuşunu basılı tutup yolu tıklayarak ikincil ve üçüncül dalları izleyin. F.İzlemelerin ölçümlerinin ayrı bir pencerede görünür olduğunu gözlemleyin tuşuna basarak yolu onaylayın. Her pençe için toplam uzunluğu elde etmek için pençe dallarının tüm boyutlarını toplayın.
Temsili analizde, enjeksiyondan 3 ila 14 gün sonra elektroporated CGN'lerin projeksiyon görüntüleri, dendrit sayısında ilerleyici bir düşüş göstermiştir. CGN'ler bir dendritik büyüme aşamasına tabi tutuldu, ardından 3 DPI'dan 7 DPI'ya rafine edildi ve bu da fazla dendritlerin% 50'sinden fazlasının budamasıyla sonuçlandı. Bu olay, her bir dendritin sonunda pençe benzeri yapıların oluşumunda kalan arborsların kademeli olarak uzaması ile çakışmaktadır ve bu gelişimsel süreçlerin eşzamanlı olarak gerçekleştiğini göstermektedir.
7 DPI ile, dendritlerin kabaca% 75'inde pençeler bulundu. Etiketli CGN'lerin her biri, toplam somato-dendritik yüzey alanını ve hacmini ölçmek için NMRS'de yeniden yapılandırıldı. CGN boyutunda gelişim boyunca anlamlı bir fark gözlenmedi.
7 DPI'da olmasına rağmen, CGN'ler 3, 5 ve 10 DPI'ya kıyasla hacimde% 20'lik önemli bir düşüş sergiledi. Prosedürdeki en önemli şey, enjeksiyondan önce beyinciği doğru bir şekilde bulmaktır. Yöntem, shRNA'ların, siRNA'ların veya Cre Rekombinaz'ın transfeksiyonu yoluyla granül nöron gelişimindeki rollerini incelemek için genleri in vivo olarak genetik olarak manipüle etmek için uyarlanabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
