Utilisation des Biocapteurs pour quantifier enzymatique endogène ATP ou H ₂ O ₂ Dans le rein

L’objectif global de ces procédures est de mesurer en temps réel les concentrations interstitielles endogènes d’un TP et de peroxyde d’hydrogène dans des reins entiers. Ceci est accompli en réhydratant et en étalonnant d’abord des capteurs pour des applications ex vivo et in vivo à des concentrations connues d’un TP et de peroxyde d’hydrogène. Pour l’installation du capteur ex vivo, le rein a été instrumenté chirurgicalement et nettoyé du sang.

Cette procédure est réalisée en rinçant le rein à travers l’aorte. Ensuite, le rein du rat est isolé chirurgicalement, placé dans une chambre d’enregistrement et perfusé avec une solution saline. Un TP et du peroxyde d’hydrogène sont mesurés à l’aide de capteurs ex vivo pour la procédure in vivo.

Une incision est pratiquée pour permettre la visualisation du rein perfusé de sang. Le rein est placé dans le capuchon d’alambic et un cathéter interstitiel peut être installé pour des applications médicamenteuses. D’autres concentrations rénales interstitielles A TP et de peroxyde d’hydrogène sont mesurées à l’aide de capteurs in vivo.

À terme, ces protocoles facilitent l’utilisation de biocapteurs enzymatiques à micro-électrodes pour des mesures en temps réel d’un TP et de peroxyde d’hydrogène dans l’interstitium rénal. Le principal avantage des biocapteurs enzymatiques est leur capacité à mesurer directement les concentrations interstitielles endogènes dans les tissus biologiques. Ici, cette technologie est utilisée pour détecter une concentration de TP et de peroxyde d’hydrogène dans l’interstitium d’un rein isolé perfusé de seline, ou in vivo.

La précision des biocapteurs enzymatiques permet des mesures en temps réel de la régulation basale et dynamique des concentrations extracellulaires d’A, de TP ou de peroxyde d’hydrogène. Ces mesures peuvent établir des profils d’application de médicament ou de maladie pour des régions rénales fonctionnellement distinctes. Réhydratez les capteurs A TP et zéro en plaçant leurs pointes dans des chambres de réhydratation séparées contenant le tampon A pendant au moins 10 minutes à une température de deux à huit degrés Celsius.

Activez la fonction POTENTIA à double canal et démarrez le logiciel du système d’enregistrement. Réglez le programme pour enregistrer les données sous forme de code A-S-C-I-I et la polarité du capteur sur anodique positive. Préparez une chambre d’étalonnage avec trois millilitres de tampon, puis abaissez l’électrode de référence dans la chambre.

Retirez chaque capteur de la réhydratation. Fixez-les à des micromanipulateurs et insérez-les dans la solution de la chambre d’étalonnage. Effectuez tous les étalonnages et études dans une cage de Faraday sur une table d’air de laboratoire haute performance pour réduire le bruit du signal.

Lors des enregistrements de pyrométrie. Effectuer la télémétrie volumique cyclique pour les capteurs ex vivo dans la chambre d’étalonnage. En faisant passer les capteurs de moins 500 millivolts à plus 500 millivolts à une vitesse de 100 millivolts par seconde pendant 10 cycles, cela améliore considérablement la sensibilité des capteurs, polarise les capteurs à plus 600 millivolts.

Après le dernier cycle, le courant du capteur diminuera en un fourre-tout asim. Une lecture d’étude est réalisée après un minimum de cinq minutes. Enregistrez la lecture du zéro consécutivement, ajoutez des quantités définies d’une solution TP dans la chambre pour produire une ligne d’étalonnage englobant une plage de détection souhaitée du capteur A TP.

La solution A TP produira un pic net dans le signal du capteur, initialement suivi d’une décroissance lorsque l’A TP se diffuse uniformément dans toute la chambre. Les valeurs du signal doivent être enregistrées une fois que le niveau du signal s’est stabilisé. Pour chaque ajout d’A TP, ajoutez trois microlitres s’évaporent d’un stock de deux milligrammes par millilitre pour tester la spécificité du capteur A TP.

Le courant produit par une application TP doit être réduit au niveau zéro consécutivement, ajouter des quantités définies de solution de peroxyde d’hydrogène dans la chambre pour produire une ligne d’étalonnage englobant une plage de détection du capteur nul ; les valeurs du signal doivent être enregistrées une fois le niveau du signal stabilisé. Pour chaque ajout de peroxyde d’hydrogène, ajoutez trois microlitres de dentelle de bétail à partir d’un stock de deux milligrammes par millilitre pour tester la spécificité du capteur de nullité. Le courant produit par l’application de peroxyde d’hydrogène devrait être réduit à zéro pour les études ex vivo.

Ligature Rapa autour des artères cœliaque et mésentérique supérieure et de l’aorte abdominale au-dessus de ces artères. Mais ne ligaturez pas deux ligatures autour de l’aorte abdominale sous l’artère rénale. Lister l’aorte abdominale distalement sous l’artère rénale.

Clampez l’aorte à au moins un centimètre au-dessus de la ligature et en dessous de l’artère rénale. Cathétériser l’aorte abdominale à l’aide d’un tube en polyéthylène entre la ligature la plus basse et la pince. Fixez le cathéter avec la deuxième ligature de l’aorte.

Retirez la pince et ligaturez les artères mésentérique et cœliaque ainsi que l’aorte au-dessus de ces artères. Perfuser le rein à six millilitres par minute avec la solution saline équilibrée de Hank à température ambiante pendant deux à trois minutes jusqu’à ce que le rein soit complètement blanchi. De plus, la veine rénale peut être cathétérisée pour la collecte du liquide d’écoulement.

À l’aide d’une pince à épiler chirurgicale, retirez avec précaution la capsule rénale, qui est nécessaire à l’insertion du capteur. Exciser le rein, y compris la partie de l’aorte reliée au cathéter. Placez le rein dans une boîte de Pétri de trois millilitres remplie de solution de bain.

Perfuser le rein avec la solution de bain via l’aorte canulée à un débit constant de 650 microlitres par minute. Fixez le rein à l’aide d’élastiques attachés sur le rein et fixés au plat recouvert de silicone avec des épingles. Placez l’électrode de référence près du rein dans la boîte de Pétri avec ses extrémités immergées dans la solution du bain.

Positionnez les micromanipulateurs pour une insertion rapide des capteurs dans le rein. Vous pouvez également utiliser une sonde factice fixée à chaque micromanipulateur pour aider à obtenir le placement souhaité des capteurs pour chaque capteur et ne pas durer plus de 20 secondes. Retirez le capteur de la chambre de réhydratation, fixez-le au micromanipulateur et insérez-le dans la solution du bain de vaisselle.

Si une exposition plus longue à l’air est prévue, trempez brièvement le capteur dans une solution de glycérol pour chaque exposition. Polarisez les capteurs avec la stat potentia à plus 600 millivolts et laissez le courant à Asim tote. Avancez chaque capteur à la même profondeur dans le rein.

Effectuer l’analyse des données selon le protocole texte. La conception du biocapteur enzymatique à micro-électrodes permet de détecter en temps réel des analytes et des reins entiers pour obtenir des résultats reproductibles. Des pré et post-étalonnages précis sont essentiels.

Cette figure montre une trace représentative du signal produit par le capteur X pvo, un capteur TP et un capteur nul lors de l’étalonnage d’un capteur TP. La procédure d’étalonnage produit un ajustement linéaire qui est utilisé pour calculer les changements dynamiques d’un TP. Le capteur de nullité est étalonné en ajoutant les concentrations connues de peroxyde d’hydrogène à la solution du bain et les valeurs paramétriques asim à am sont enregistrées. L’ajout de catalyseurs à la solution du bain entraîne une décroissance rapide du courant.

Le capteur in vivo produit une trace similaire mais détecte les courants réducteurs plutôt qu’oxydatifs, et donc le courant est négatif L’étalonnage produit également un ajustement linéaire dans la plage de 0,3 à 80 micromolaires. La spécificité du capteur in vivo à un TP par rapport à d’autres produits puriques est illustrée ici. Démontré dans cette figure, l’angiotensine deux a induit des changements de concentration de peroxyde d’hydrogène endogène interstitiel dans des reins fraîchement isolés de rats résistants au sel et sensibles au sel.

L’angiotensine 2 induit une libération aiguë de peroxyde d’hydrogène par les deux reins. Cependant, les amplitudes maximales étaient significativement élevées dans les reins des rats sensibles au sel, en particulier lorsqu’ils étaient nourris avec un régime riche en sel. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’extrémité du capteur et la surface du cortex rénal sont délicates et qu’en tant que telles, endommager l’un ou l’autre nuira à la précision des enregistrements.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer des substances endogènes et des organes entiers tels que les reins. Vous serez également en mesure d’effectuer avec précision les étalonnages et les interventions chirurgicales nécessaires à la réussite des enregistrements. Nous avons appliqué cette méthode pour étudier les niveaux de TP et de peroxyde d’hydrogène dans le basilic, et ils sont libérés dans le rein.

Cependant, la même approche pourrait être utilisée pour déterminer les concentrations d’adénosine glutamate, de glucose et de certaines autres substances lorsque des capteurs correspondants sont appliqués.