الكهربية المعزولة على الاستعدادات الحبل الشوكي-جذع الدماغ من القوارض الوليد يسمح الشبكات العصبية التنفسية تسجيل الإخراج

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. J. Vis. Exp. (105), e53071, doi:10.3791/53071 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

التنفس هو نشاط معقد وحيوي يسيطر عليها الدماغ، مما يسمح dioxygen (O 2) امتصاص وثاني أكسيد الكربون (CO 2) القضاء. يتم إنشاء محرك التنفسي المركزي عن طريق شبكة معقدة تقع في الدماغ في كل من الثدييات 1، 2 البرمائيات والزواحف 3، 4 الطيور والأسماك 5. حتى لو كان يمكن معالجتها دراسة التنفس في الجسم الحي، والتحقيقات الآلية الدقيقة تتطلب الوصول المباشر إلى شبكة التحكم في الجهاز التنفسي. تحقيقا لهذه الغاية، وضعت أدريان وBuytendijk مستحضر ذهبية انخفاض، والتي أقطاب توضع على سجل سطح الدماغ إيقاع لدت المرتبطة الخيشومية التهوية 5. وقد تم تكييف هذا النهج في وقت لاحق من قبل Suzue في عام 1984 6 لاستخدامها في القوارض حديثي الولادة. وقد أدى ظهور هذا المستحضر إلى تقدم كبير في علم الأعصاب في الجهاز التنفسي. لأنها بسيطة نسبيا، قدمت تقنية حيحرث غير قابلة للمجموعة واسعة من التحقيقات الأساسية من السلوكيات الحركية الإيقاعية وأصولهم في القوارض حديثي الولادة.

الهدف العام من هذه الطريقة لتسجيل المتعلقات العصبية النشاط الشهيق، ودعا إيقاع مثل الجهاز التنفسي في التنفس الوهمية، التي تنتجها الشبكة في الجهاز التنفسي. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في مجموعة واسعة من أهداف البحث، واستهداف الردود الشهيق إلى تغيرات في الجهاز التنفسي أو الصيدلة في كل البرية نوع 7 و 8 المعدلة وراثيا الحيوانات. وبالنظر إلى أن التجارب التي تجرى عند درجة حرارة منخفضة، دون afferents الحسية، وتحت الظروف التي تركيزات الجلوكوز وO 2 في ACSF مرتفعة، وقد أثيرت تساؤلات بشأن مدى ملاءمة الفسيولوجية في الإشارات المسجلة. في حين أن هناك اختلافات واضحة بين المجراة في ظروف المختبر (على سبيل المثال، تردد رشقات نارية الشهيق) تظل الحقيقة أن وجودالعناصر الأساسية لشبكة الجهاز التنفسي 6 تجعل من الممكن لدراسة الإيقاع القوي يرتبط إلى وظيفة التماثل الساكن الحيوية 9،10.

الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية لتسهيل الوصول المباشر إلى عناصر الدماغ للشبكة في الجهاز التنفسي، والتي هي بالكاد يمكن الوصول إليها في الجسم الحي، وخاصة في الأطفال حديثي الولادة. يتم وضع الدماغ في ظل ظروف رقابة صارمة: لا التضمين إيقاع سجلتها المدخلات وارد الطرفية من الرئتين أو الهيئات السباتي، والسماح للدراسة في التركيز على محرك الأقراص التنفسي المركزي نفسه 11. وهكذا، ويستخدم هذا الوصول إلى تطبيق مؤثرات وتسجيل إشارة خرج. وعلى النقيض من تخطيط التحجم التسجيلات، هو منظم إيقاع التنفس من قبل جميع مكوناته في جميع أنحاء الجسم (على سبيل المثال، وانتفاخ الرئة، chemosensors الطرفية)، مما يجعل من الصعب تطبيق مؤثرات دقيقة.

فيالفئران ewborn، يتكون البروتوكول من تسجيل رابع إشارة بطني الجذر على الدماغ معزولة والحبل الشوكي اقتطاع، حافظت في الاصطناعي الدماغي الشوكي السائل (ACSF). يتكون إيقاع الناتجة عن الاستعدادات الحبل الشوكي الدماغ من رشقات نارية بطيئة الفردية التي ترتبط إشارة الشهيق 9. المعزولة الاستعدادات الحبل الشوكي الدماغ وللتسجيل بسهولة في الفئران من يوم بعد الولادة 0-4 (P0 - P4) 7. يستخدم هذا الأسلوب عادة لتقييم الاستجابة ميتة الشبكة في الجهاز التنفسي، وكذلك استجابة لفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم، والحماض أو المخدرات. ويرد بروتوكول نقص الأكسجين الحاد هنا. يتم الحصول على هذا التحفيز عن طريق سحب O 2 في ACSF. يستخدم هذا الأسلوب عادة لتقييم التسامح والقدرة على الاستجابة للإهانات ميتة. بروتوكول يؤدي الى الاكتئاب الإيقاع من الدقيقة الأولى حتى نهاية التعرض نقص الأكسجة (الشكل 1) 12. يتم عكس هذا الاكتئابخلال مرحلة ما بعد ميتة الانتعاش 12. وفيما يتعلق تصميم تجريبي، فمن المهم أن نلاحظ أن بونس، وتقع في الجزء منقاري من جذع الدماغ، لديه عمل كابح بشكل خاص على مولد إيقاع 8. وهكذا، والأعمال التحضيرية من الدماغ والحبل الشوكي الكامل منقاري عرض إيقاع أقل. يتم تحديد إدراج بونس في عينة معزولة للتسجيل وفقا لهدف التجربة 13؛ سوف دراسة تأثير جسري على شبكة النخاع المستطيل تتطلب التسجيلات مع وبدون بونس لمقارنة النتائج 14. وعلاوة على ذلك، واحدة من مزايا هذه التقنية إمكانية تمديد الجزء المنقاري لإعداد لتشمل الدماغ المتوسط ​​و / أو مناطق دماغية بينية 15،16، مما يجعل من الممكن لتقييم أثر هذه المناطق على الشبكة الجهاز التنفسي-بونتو النخاع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا الأسلوب يتطلب استخدام المواد الحيوانية، سمحت من قبل لجنة لافال جامعة الحيوان الأخلاق (بروتوكول # 2012-170).

1. إعداد والتحضير

  1. حلول
    1. إعداد الحلول الأسهم ACSF وفقا للصفات التالية 7،17. تتوفر في الأدب وصفات أخرى مع وجود اختلافات التركيز. حلول تخزين المخزون في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
      1. الملح الحل: إضافة 75.39 غرام من كلوريد الصوديوم (129 ملي النهائي)؛ 2.5 غرام من بوكل (3.35 ملي النهائي)؛ 0.81 غرام من NaH2PO4 (0.58 ملي النهائي)؛ 2.33 غرام من MgCl2 (1.15 ملي النهائي)؛ 1.85 غرام من CaCl2 (1.26 ملم). تذوب في 800 مل من الماء المقطر ثم ملء إلى 1 L مع المياه المقطرة.
      2. حل بيكربونات: إضافة 17.65 غرام من NaHCO 3 (21 ملي النهائي). تذوب في 900 مل من الماء المقطرة ثم ملء إلى 1 L مع الماء المقطر. والاختلافات في تركيز البيكربونات يؤدي إلى تغيرات درجة الحموضة.
      3. حل الجلوكوز: إضافة 54.06غرام من الجلوكوز (30 ملي النهائي). تذوب في 400 مل من الماء المقطرة ثم ملء الى 500 مل بالماء المقطر.
    2. إعداد ACSF عن طريق تمييع 100 مل من محلول الملح، و 100 مل من محلول بيكربونات، و 50 مل من محلول الجلوكوز في 1 لتر من الماء المقطر. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    3. إعداد الزجاج الكهربائي عن الاحترار وتمتد أنبوب زجاجي حتى يكسر. الرمال أسفل الحافة قبل الاستخدام. القطب يمكن إعادة استخدامها الكثير من الوقت طالما أنه يبقى نظيفة.
  2. إعداد التجريبي
    ملاحظة: يتم عرض تفاصيل الإعداد في الشكل 2.
    1. بدوره على مكبر للصوت، والانتقال averager، ونظام الحصول على البيانات، تحكم في درجة الحرارة ومضخة. تحقق من تضخيم الإشارات (كسب = 10000)، والترشيح (عتبة منخفضة، 10 هرتز، عتبة عالية، 5 كيلو هرتز)، ومعدل أخذ العينات من البث التناظري إلى الرقمي التحويل من إشارة الخام (2.5 كيلو هرتز).
    2. ملء زجاجة مع ACSF وفقاعة مع كربوجين (95٪ O 2 2). لحث على bubbled- واستعد-ACSF التدفق في غرفة تسجيل (حجم 5 مل) في 4 مل / دقيقة. عقد درجة الحرارة في غرفة تسجيل في 26 (± 1) درجة مئوية. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 في هذه الظروف القياسية.
    3. تبقي 50 مل من RT وفقاعات كربوجين ACSF في حقنة 50 مل بالقرب من غرفة التشريح.
    4. قم بتشغيل الكمبيوتر وبدء برنامج تسجيل.

2. تشريح

  1. وزن وتحديد بصريا جنس الحيوان (الذكور لها الشرج التناسلية مسافة أطول، في حين أن الإناث لديها مسافة الشرج الأعضاء التناسلية قصيرة؛ الذكور الأعضاء التناسلية غالبا ما تكون مظلمة بينما الأعضاء التناسلية للإناث وردي).
  2. تخدير القوارض حديثي الولادة من جانب واحد من الخيارات التالية: تخدير بالبرد (تزج تماما الحيوان في الثلج لمدة 4-5 دقيقة 18)، والحقن (equitensine في 4 مل / كغم) 19 أو استنشاق التخدير المتطايرة (الأيزوفلورين 20 أو الأثير 21). Confiجمهورية مقدونيا طائرة كافية من التخدير بسبب عدم وجود رد فعل مخلب الانسحاب.
  3. وضع الحيوان على مقاعد البدلاء، وجها بطني أسفل. القسم جزء منقاري من الرأس coronally مع مشرط على مستوى bregma (وضوحا من خلال الجلد والجمجمة). تنفيذ هذه الخطوة مباشرة بعد تخدير الحيوان.
  4. القسم الجسم coronally مع مشرط تحت أعضاء الأمامي.
  5. إزالة الجلد والعضلات والأنسجة الدهنية والأحشاء مع مقص جراحي ورقيقة وكماشة. منذ العظام لينة في هذا العصر، توخي الحذر حتى لا تضر الجهاز العصبي. تنفيذ هذه الخطوة على مقاعد البدلاء.
  6. إعداد مكان في غرفة التشريح. استخدام ACSF المخزنة في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير. من هذه النقطة إلى نهاية التسجيل، استخدم المجهر.
  7. على الوجه الظهري للإعداد، وقطع الجمجمة والفقرات من منقاري إلى الجزء الذيلية على طول محور المتوسط ​​مع مقص جراحي ورقيقة وكماشة. فتح الجمجمة قطعوالفقرات من أجل فضح النسيج العصبي. استخدام ACSF strored في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير.
  8. مع كماشة، وإزالة الغشاء العنكبوتي، الأنسجة رقيقة تغطي سطح النسيج العصبي. تحتفظ الأم الحنون والأوعية الدموية ضد النسيج العصبي. استخدام ACSF المخزنة في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير.
  9. إعداد مكان مع ظهري وجهه لأسفل، وبعناية اسقاط الدماغ والحبل الشوكي عن طريق قطع الأعصاب والنسيج الضام مع مقص حين عقد إعداد في المكان. نهج ظهري هو ممكن أيضا. الحفاظ على الجذور والأعصاب أطول فترة ممكنة. إزالة العظام لعزل الدماغ والحبل الشوكي. استخدام ACSF المخزنة في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير.
  10. إزالة المخيخ وتبقى الهياكل منقاري من قبل باجتزاء لهم مشرط. استخدام ACSF المخزنة في الإبرة إلى الأوكسجين التحضير.
  11. اختياريا اعتمادا على التجربهتصميم التل، وإزالة الجسر مع مشرط من قبل القسم الأمامي الإكليلي إلى الشريان المخيخي السفلي 22. لاحظ أن الحفاظ على بونس كلها سوف تبطئ إيقاع في الفئران وبشكل كامل وتمنع في الفئران. الاستعدادات التي تشمل فقط الجزء الذيلية للبونس عرض النشاط مثل الجهاز التنفسي مع وتيرة مستقرة في جذور C4.

3. تسجيل

  1. إعداد مكان في غرفة تسجيل، بطني مكشوفة. إصلاح إعداد مع دبابيس في أدنى جزء من الحبل الشوكي ومنقاري أقصى جزء من الدماغ.
  2. باستخدام حقنة مرتبطة القطب بواسطة إبرة لها، لحث على الاكتئاب في القطب (قطر الزجاج نصيحة: 150-225 ميكرون) من خلال سحب المكبس حقنة، من أجل سد جزئيا القطب مع ACSF.
  3. باستخدام micromanipulator، ضع بعناية القطب بالقرب من الجذور البطنية الرابعة. يمكن أن الجذور البطنية الأخرى أيضا تقديم مثل الجهاز التنفسي النشاط (ه.ز.، العصب القحفي الثاني عشر، C1 الجذر البطني).
  4. لحث على الاكتئاب في الخزان الكهربائي عبر حقنة من خلال سحب المكبس من أجل نضح بلطف جذير العصبية. ثم نقل بعناية القطب تطبيقه ضد الحبل الشوكي.
    ملاحظة: من الناحية المثالية حجم جذير يطابق حجم الفتحة الكهربائي وبالتالي يخلق ختم بين المقصورات الداخلية والخارجية من القطب. منذ تستخدم مكبرات الصوت التفاضلي عادة لمثل هذه التسجيلات، أي انفتاح بين داخل القطب وغرفة تسجيل يقلل من جودة الإشارة ويجعل من الصعب للقضاء على الضوضاء الخلفية.
  5. بدء التسجيل.
  6. تسجيل الإيقاع التي تنتجها إعداد ظل ظروف normoxic (أي فقاعات ACSF مع كربوجين: 95٪ O 2 و 5٪ CO 2) لمدة 20 دقيقة على الأقل لتحديد خط الأساس المعلمات من التحضير.
  7. تبديل نضح من-فقاعات كربوجين ACSF لACSF التحفيز (أي فقاعات مع 95٪ N 2 و 5٪ CO 2 لنقص الأكسجة التحفيز) لمدة 15 دقيقة. تغيير مدة التعرض وفقا للبروتوكول تجريبي. تسجيل مدة التعرض على تسجيل والحيوان ورقة البيانات. استخدام أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ بين زجاجة ACSF وغرفة كلما أمكن ذلك لتجنب انتشار الغاز إلى خارج الأنبوب.
  8. تبديل نضح إلى المعايير فقاعات كربوجين ACSF لمدة 15 دقيقة على الأقل لتسجيل الانتعاش. تسجيل هذا على تسجيل والحيوان ورقة البيانات.
  9. إنهاء التسجيل.

4. التحليل الإحصائي

  1. من إشارة متكاملة، وحساب التردد حيث بلغ عدد رشقات نارية في الدقيقة (معبرا عنها رشقات نارية / دقيقة)، واتساع بالفرق بين خط الأساس وذروة انفجار (معبرا عنها بالسيارات)، ومدة انفجر مثل مدة من بداية لنهاية انفجار (معبرا في الصورة)، ومنطقة انفجار كما المنطقة تحت لئيملقد للانفجار في إشارة متكاملة (معبرا عنها بالسيارات · ق) (الشكل 3).
  2. حساب تردد، والسعة، ومدة انفجر ومنطقة الانفجار تحت normoxic (خط الأساس)، ميتة (التحفيز) وبعد ميتة الشروط (ما بعد التحفيز) الانتعاش كمتوسط ​​لمدة 5 دقائق الأخير من التسجيلات لكل حالة. لا تحليل الجزء الأول من كل حالة لأن هناك تأخير بين التحول نضح وACSF التجانس في غرفة تسجيل.
  3. تعبير ثم التحفيز (أي نقص الأكسجين) وبعد التحفيز (أي بعد نقص الأوكسجين) القيم الانتعاش كنسبة مئوية من القيم الأساسية لتسجيل المقابلة. التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SD

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما ذكر في المقدمة، واحدة من أهم مزايا هذه التقنية هو الوصول مباشرة إلى الدماغ لتطبيق مؤثرات المختلفة. وكمثال على ذلك، تم تطبيق نقص الأكسجة هنا الشكل 1. AB يعرض تسجيل بروتوكول الكامل، مع كل الظروف normoxic ونقص الأوكسجين. الشكل 1.CE يعرض إيقاع سجلت في ظروف normoxic (أي فقاعات ACSF مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 في 26 ° C). كما هو موضح سابقا في هذا الإعداد الدقيق 11، والتردد هو حوالي 8 رشقات نارية / دقيقة، والسعة حوالي 0.800 بالسيارات. لاحظ أن السعة تعد مؤشرات فقط بسبب الاختلافات الهامة بين الإعداد. يمثل التتبع العلوي إشارة متكاملة في حين يمثل أدنى أثر للإشارة الخام. الشكل 1.DF يعرض إيقاع المسجلة في ظروف نقص الأوكسجين (أي.، فقاعات ACSF مع 95٪ N 2 و 5٪ CO <دون> 2 في 26 ° C). كما تتميز سابقا 23، انخفضت وتيرة بشكل كبير خلال نقص الأكسجة. الشكل 1.GH يعرض انفجار واحد تظهر الأنماط النموذجية في ظروف normoxic ونقص الأوكسجين.

الشكل 1
الشكل 1. أمثلة من تسجيلات تم الحصول عليها من الاستعدادات الحبل جذع الدماغ، الحبل الشوكي. الإخراج التنفسي المسجلة من جذر بطني C4 الاستعدادات من الفئران P4 تحت normoxic، ميتة وظروف الانتعاش بعد ميتة ((A) إشارة متكاملة و (B) إشارة الخام) . لكل حالة والتسجيلات الموسعة ((C) والتي تتكامل إشارة normoxic؛ (D) إشارة ميتة متكاملة؛ (E) الخام إشارة normoxic؛ (F) الخام إشارة ميتة) وانفجار واحد ((G) انفجار normoxicو(H) ميتة انفجار) وترد. كما ورد في النص، يرجى ملاحظة أن السعة لابد من تفسيرها بعناية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تلخيصية مخطط من الإعداد. وارتفعت درجة حرارة ACSF انفجر وإرسالها عن طريق مضخة في غرفة تسجيل. ويستنشق ACSF الزائدة في غرفة تسجيل بواسطة مضخة والتخلص منها. ويرتبط غرفة تسجيل على الأرض وتحكم في درجة الحرارة. يتم ترحيل الإخراج الكهربائي مباشرة إلى مكبر للصوت، ثم إلى averager المتحركة ونظام الحصول على البيانات، وأخيرا جهاز الكمبيوتر. يرجى النقر هنا رس عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. حلل انفجار معلمات. يتم احتساب تردد حيث بلغ عدد رشقات نارية في الدقيقة (معبرا عنها رشقات نارية / دقيقة)، واتساع بالفرق بين خط الأساس وذروة انفجار (معبرا عنها بالسيارات)، ومدة انفجر كما مدة من البداية إلى النهاية من انفجار (معبرا في الصورة)، ومنطقة انفجار كما المنطقة تحت منحنى انفجار في إشارة متكاملة (معبرا عنها بالسيارات ق ·). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدير دقيق لنشاط الجهاز التنفسي يمكن أن يكون تحديا. في الواقع، والتنفس هو وظيفة التي يمكن أن تكون تلقائية وطوعية، وأنه هو منظم وفقا للبيئة، واحتياجات الجسم، والحالة العاطفية والسلوك. وميزة هذا الأسلوب هو عزل العناصر العصبية المسؤولة عن إنتاج الأمر التنفسي. وهكذا، والتسجيلات الكهربية من الاستعدادات الحبل الشوكي والدماغ تخطيط التحجم هي تقنيات تكميلية لدراسة الشبكة العصبية في الجهاز التنفسي كلها في المختبر والمجراة على التوالي. تسجيلات التصحيح المشبك في إعداد الحبل الشوكي الدماغ (على سبيل المثال، تقترب من السطح البطني) هي أيضا التي يمكن تصورها وتسمح بدراسة الخلايا العصبية خاصة في شبكة الجهاز التنفسي الحفاظ عليها 24.

ويشمل هذا البروتوكول بعض الخطوات الحاسمة، لا سيما في تشريح. من أجل تجنب تلف الأنسجة العصبية،يجب تنفيذ جميع الخطوات تشريح بسرعة وبدقة. لا ينبغي أن يكون معطوبا في هذا النسيج العصبي ويتم حفظها بعناية من قبل الغمر المستمر في ACSF. كما ذكر سابقا، ونوعية العلاقة بين جذير الأعصاب والقطب هو خطوة حاسمة الثانية. تطلع جذير يمكن أن تجلب القطب أقرب إلى إعداد. في حين أن الاتصال بين القطب والدماغ يمكن أن تحسن نوعية الختم، على المرء أن تجنب الوقوع في الاكتئاب أو إلحاق الضرر الجسدي التحضير.

وينبغي دائما أن تستخدم إشارة متكاملة للتحليل، ولكن الإشارات الأولية يمكن أن تكون مفيدة للتمييز رشقات نارية المناسبة من الضوضاء في الخلفية. وعلاوة على ذلك، يمكن إضافة مكبر صوت للإعداد للاستماع إلى الإيقاع وتحديد جودة الإشارة والضوضاء الخلفية الحالي قبل الاختبار. في الواقع، يمكن بعض الاختلافات في الأساس الخلفية تكون موجودة بسبب التدخل الكهربائية وسبب بخط أساس غير مستقر. هذا interfينبغي منع الفروق عن طريق فحص توصيلات الكابلات والمص الجذر القطب. وعلاوة على ذلك، لأن انفجار السعة تعتمد على كل من الضوضاء في الخلفية والعلاقة بين الجذر والقطب، والتردد هو الكثير من المعلمة يمكن الاعتماد عليها. وبالتالي، ينبغي دائما أن أعرب السعة انفجار كنسبة مئوية من القيم الأساسية لتجنب الاختلافات بين الأفراد بسبب الإعداد.

يتم تحديد حدود أسلوب من عمر الحيوان الذي إعداد يمكن أن تتحقق. وهذا يسمح دراسة دقيقة للإقامة لمحرك الأقراص التنفسي المركزي عند الولادة، وهي مثيرة جدا للاهتمام وذات الصلة سريريا، لكنه يركز على هذه الأعمار المبكرة، ولا يمكن أن تمتد إلى العصور اللاحقة. أقدم العصور يمكن استخدامها في perfused arterially العمل الاستعدادات القلب والدماغ 25، ولكن مع تعديلات بروتوكول كبيرة (انظر أدناه). وكان من إعداد الحبل الشوكي الدماغ معزولة من خنازير غينيا الكبار تطويرإد كتبها موران-Surun وآخرون 26، حيث يتم perfused الدماغ عبر الشريان القاعدي ويتم تسجيل الإيقاع في العصب القحفي الثاني عشر. قيود أخرى هي مدة التجربة. لا يمكن أن تبقى التحضير لأكثر من 7 ساعات في الظروف الموصوفة سابقا 6. لذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لإجراء التجارب على المدى الطويل، حتى لو ظلت الاستعدادات من الضفادع الصغيرة (انظر أدناه) 24 ساعة في المختبر.

تعديلات مختلفة يمكن تطبيقها على هذه التقنية. هنا، وقد تم تنفيذ التحدي ميتة، ولكن الاختلافات الغاز الأخرى هي أيضا تصور (على سبيل المثال، فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم 27 وكذلك الاختلافات الرقم الهيدروجيني 28). وبنفس الطريقة، يمكن perfused التحضير مع ACSF الذي تم حله المخدرات وتطبيقها على الدماغ بمثابة ما قبل المعالجة 29 أو 30 خلال التسجيل. في هذه الحالة، يمكن إيقاع تسارع أو تباطؤ مؤشر داو جونز 29ن 30 وفقا لعقار تجريبي. وعلاوة على ذلك، مع غرفة تسجيل compartmented، مختلف ACSF يمكن تطبيقها على أجزاء مختارة من إعداد 6 وتغيرات درجة الحرارة 9 يمكن استخدامها. يسمح هذا التقسيم دراسة الآثار المترتبة على أجزاء الدماغ المحدد في الآثار الناجمة عن التحفيز. في حين أن أسلوب عرض تستخدم الفئران حديثي الولادة، فإنه ينطبق على غيرها من نماذج الحيوانات أيضا. باستخدام بروتوكول مماثل إلى واحد بطلب للحصول على الجرذان والفئران يمكن استخدامها من اليوم الحمل 16 (E16) حتى P4 12. والفرق الرئيسي هو الحاجة لتدفئة وكربوجين فقاعة في ACSF أثناء تشريح. السلاحف والضفادع الصغيرة والضفادع الكبار يمكن أن تستخدم أيضا. ومع ذلك، هذه الأنواع تتطلب تقنيات تشريح مختلفة، فضلا عن تعديلات على تكوين ACSF.

ويمكن أيضا أن يقترن هذا الأسلوب مع تسجيلات التصحيح المشبك على وجه منقاري من إعداد 31، مما يتيحالتصور المتزامن لشبكة إشارة خرج ونشاط خلية واحدة معينة من هذه الشبكة. ويمكن أيضا أن الجهد صبغة حساسة التصوير تطبق في الفئران حديثي الولادة-الدماغ الشوكي الاستعدادات الحبل لحصر المناطق تفعيلها على الوجه البطني من الدماغ 32. ويمكن أيضا أن تتحقق تحليل ج منظمات المزارعين في الأعمال التحضيرية من أجل تحديد السكان العصبية المعنية في ردود الجهاز التنفسي محددة. وأخيرا، وإعداد يمكن تعديلها للحفاظ على الأجهزة الأخرى مثل القلب 25، أضلاعه أو الفسيولوجية الشريان نضح مع ايقاعات الفسيولوجية الأخرى 33. ومع ذلك، فإن هذه التعديلات مهمة جدا تتطلب البروتوكولات تشريح الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Sigma Aldrich 761036-5EA Use under hood
NaCl Bioshop SOD002
KCl Bioshop POC888
CaCl2 Bioshop CCL444
MgCl2 Bioshop MAG510
NaHCO3 Bioshop SOB999
NaH2PO4 Bioshop SPM306
D-glucose Bioshop GLU501
Carbogen Linde 343-02-0006 
Temperature Controller Warner Instruments, Hamden, CT, USA TC-324B
Suction electrode A-M Systems, Everett, WA, USA model 573000
Differential AC amplifier A-M Systems, Everett, WA, USA model 1700
Moving averager CWE, Ardmore, PA, USA model MA-821
Data acquisition system Dataq Instruments, Akron, OH, USA model DI-720
LabChart software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber Home made
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Micromanipulator World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA KITE-R
Base Kanetec, Bensenville, IL, USA MB
Peristaltic pump Gilson, Middleton, WI, USA MINIPULS 3
Faraday Cage Home made
Computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
  2. Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
  3. Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
  4. Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
  5. Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
  6. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  7. Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
  8. Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
  9. Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
  10. Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
  11. Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
  12. Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
  13. Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. 165-201 (2007).
  14. Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
  15. Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  18. Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
  19. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
  20. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
  21. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
  22. Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
  23. Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
  24. Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
  25. Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502, (Pt 3), 623-639 (1997).
  26. Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
  27. Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
  28. Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
  29. Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
  30. Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
  31. Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
  32. Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
  33. St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics