Metoder til at hæmme bakteriel Pyomelanin Produktion og Bestem den tilsvarende stigning i Følsomhed over for oxidativt stress

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Fremstilling af kulturmedier Antibiotika og 2- [2-nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexandion (NTBC)

  1. Gør LB-bouillon (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,25% NaCI i H2O) og alikvot i passende mængder. Der steriliseres ved autoklavering. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Gør 100 ml LB-agar (1% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,25% NaCl, 1,5% agar i H2O) i 250 ml kolber. Der steriliseres i autoklave og opbevares ved stuetemperatur. Sørg for, at agaren er smeltet før hælde ind i plader.
    BEMÆRK: kolber indeholdende 100 ml LB-agar vil give 4 plader. Mængden af ​​LB-agar kan ændres for at svare til antallet af plader, der er nødvendige til analysen.
  3. Gør PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Der steriliseres i autoklave eller filtrering og opbevares ved stuetemperatur.
  4. Forbered antibiotiske stamopløsninger for gentamicin, kanamycin, end tobramycin.
    1. Udarbejde passende antibiotikum lager koncentrationer for P. aeruginosa stammer indeholdende 100 mg / ml gentamicin, 30 mg / ml kanamycin og 10 mg / ml tobramycin. Opløs antibiotika i vand, Filtersteriliser (0,2 um), og opbevares ved 4 ° C. Alter antibiotika og koncentrationer afhængigt af bakterien undersøgt.
  5. Forbered NTBC stamopløsninger. Opløs 10 mg af NTBC i 400 pi DMSO. Dette giver en koncentration på 75,9 mM NTBC. Store NTBC stamopløsninger ved -20 ° C. Optø løsninger ved stuetemperatur efter behov.
    BEMÆRK: Forskellige kilder til NTBC har forskelle i opløselighed. Fastsætte en passende køretøj, hvor at opløse NTBC baseret på producentens anbefalinger og justere trin 1.5 i overensstemmelse hermed.

2. NTBC Titreringer bakteriestammer

  1. Opsæt overnatskulturer af stammerne, der skal testes. Tilsæt 2 ml LB-medium til 16 x 150 mm reagensglass (én pr stamme) og podning med 1 isoleret koloni fra hver stamme. Inkuber natten over ved 37 ° C med beluftning på en vævskultur rotator i en luft-inkubator.
  2. Den følgende dag, forberede titreringer af NTBC i LB-bouillon. Bruge en initial området fra 0 til 900 uM NTBC da forskellige stammer har forskelle i følsomhed over for NTBC.
    1. Tilsæt 1 ml LB-medium til 4 til 5 reagensglas (16 x 150 mm) pr stamme.
    2. Tilsæt NTBC stamopløsningen (75,9 mM) til reagensglassene (16 x 150 mm) i en række koncentrationer. Se tabel 1 for NTBC koncentrationer og tilsvarende lagerbeholdninger at tilføje til 1 ml LB-bouillon.
  3. Mål OD 600 af de overnatskulturer. Vask kulturer, før du tager OD 600 aflæsninger til at fjerne pyomelanin stede i medierne.
    1. Vask kulturerne ved centrifugering 1 ml kultur i en mikrocentrifuge ved 16.000 x g i 2 min. Supernatanten fjernes, og eventuelle løst pelleterede celler meden mikropipette og resuspender faste cellepelleten i 1 ml LB.
  4. Pode titrering rør ved OD600 0,05. Beregn mængden af ​​vasket kultur er nødvendig for at pode rørene.
    BEMÆRK: Brug de vaskede kulturer til vaccinationer, da pyomelanin bør ikke være til stede.
  5. Inkubér titrering rør til ca. 24 timer ved 37 ° C med beluftning ved hjælp af en vævskultur rotator i en luft-inkubator.
  6. Fotografere titreringsforsøg rør og sammenligne pigment produktion inden for og mellem stammerne til at bestemme mængden af ​​NTBC at bruge for MIC og oxidativ stress-analyser. Brug OD 600 aflæsninger for at bestemme mængden af pyomelanin i cellefri dyrkningssupernatant og bestemme celletætheden.
    BEMÆRK: OD 600 Forholdet mellem pyomelanin i dyrkningssupernatant til celler kan beregnes til at kvantificere forskelle i pyomelanin produktion efter behandling med NTBC.

3. Antibiotisk Minimum Inhibitory koncentration (MIC) Assay i 96-brønds plader

  1. Opsæt overnatskulturer af stammerne, der skal testes i LB med og uden NTBC.
    BEMÆRK: Denne protokol er beskrevet ved hjælp af den repræsentative niveau på 300 pM NTBC. Det passende niveau af NTBC skal anvendes, bestemmes i trin 2.6.
    1. Tilsæt 300 uM NTBC til 2 ml LB. Tilføj et tilsvarende volumen af ​​køretøj (DMSO) til 2 ml LB for ingen NTBC tilstand.
    2. Brug af sterile tandstikkere, pode rør med én isoleret koloni af bakterier. Der vil være en kultur med NTBC og én kultur uden NTBC for hver stamme. Inkuber natten over ved 37 ° C med beluftning ved hjælp af en vævskultur rotator i en luft-inkubator.
  2. Den følgende dag, gør LB + NTBC og LB + DMSO master-løsninger til opsætning MIC assay. Tilføj NTBC ved en koncentration på 600 uM, da dette vil blive fortyndet to gange, når der tilsættes inoculum, hvilket gav en slutkoncentration på 300 uM.
    1. For at teste én antibiotisk for en stamme, tilsættes 600 pM NTBC til 2 ml LB og blandes for at gøre NTBC Master løsning. Tilføj et tilsvarende volumen af ​​køretøj (DMSO) til 2 ml LB og bland til at gøre nogen NTBC mester løsning. Brug disse løsninger til sikring af antibiotiske stamopløsninger samt til etablering af fortyndingsrækken i 96-brønds plader.
      BEMÆRK: opløsningsformuleringer Føreren vil give ekstra løsning til at redegøre for pipetteringsfejl. Master løsninger kan skaleres op eller ned efter behov afhængig af antallet af antibiotika og stammer testet.
  3. Forbered antibiotiske løsninger i LB + NTBC eller LB + DMSO master-løsninger.
    BEMÆRK: Den antibiotiske koncentration i disse løsninger skal være dobbelt ønskede slutkoncentration. Nok opløsning bør gøres for at overføre 100 pi til fire brønde i en 96-brønds plade.
    1. Forbered gentamicin +/- NTBC stamopløsning ved 64 ug / ml. For at gøre denne opløsning tilsættes 0,288 pi gentamicin lager (100 mg / ml) til 450pi LB + NTBC eller LB + DMSO Master opløsning.
      BEMÆRK: Den maksimale koncentration af gentamicin for P. aeruginosa PAO1 er 32 pg / ml.
    2. Gør kanamycin +/- NTBC stamopløsning på 256 pg / ml. For at gøre denne opløsning tilsættes 3,84 pi kanamycin lager (30 mg / ml) til 450 pi LB + NTBC eller LB + DMSO master-løsninger.
      BEMÆRK: Den maksimale koncentration af kanamycin for P. aeruginosa PAO1 er 128 ug / ml.
    3. Forbered tobramycin +/- NTBC stamopløsning på 8 ug / ml. For at gøre denne opløsning tilsættes 0,36 pi tobramycin lager (10 mg / ml) til 450 pi LB + NTBC eller LB + DMSO master-løsninger.
      BEMÆRK: For P. aeruginosa PAO1, er den maksimale koncentration af tobramycin er 4 pg / ml.
      BEMÆRK: antibiotika og koncentrationer kan justeres for bakterierne, der skal testes.
  4. Tilsæt 100 pi af hver 2x antibiotisk opløsning til fire brønde i en 96-brønds plade. Placer disse løsninger i rækken A. For example bør gentamicin anbringes i A1 til A4, bør kanamycin anbringes i A5 til A8 og tobramycin skal placeres i A9 gennem A12. Se figur 1A til et diagram af en 96-brønds plade oprettet.
    BEMÆRK: Flere antibiotika kan afprøves på en plade, men kun én stamme bør testes pr pladen for at eliminere risikoen for krydskontaminering fra andre stammer.
  5. Der tilsættes 50 ul af LB + NTBC eller LB + DMSO Master løsning på rækkerne B til H i ​​96-brønds plade. Sørg for, at den ene plade er LB + NTBC og én plade er LB + DMSO. Se figur 1A.
    1. Brug LB + NTBC for antibiotika i LB + NTBC. Brug LB + DMSO for antibiotika i LB + DMSO.
  6. Ved hjælp af en mikropipette udføre to gange serielle fortyndinger af antibiotika ved at overføre 50 pi af opløsningen fra række til række A B. blande opløsningen, ændre pipettespidser, og overføre 50 pi af opløsningen fra række til række B C. Gentag for den remaining rækker. Efter fortynding rækken G, fjerne 50 ul løsningen fra denne række og udsmid. Brug række H som ikke antibiotisk kontrol for bakterievækst. Se figur 1B.
    BEMÆRK: Hver brønd i række A til G indeholder nu 50 pi antibiotikum i LB + NTBC eller LB + DMSO ved 2X den endelige ønskede koncentration. Række H indeholder LB + NTBC eller LB + DMSO uden antibiotika.
  7. Mål OD 600 af de overnatskulturer. Vask alle kulturer, før du tager OD 600 aflæsninger til at fjerne pyomelanin stede i medierne.
    1. Vask kulturerne ved centrifugering 1 ml kultur i en mikrocentrifuge ved 16.000 x g i 2 min. Fjern supernatanten med en mikropipette og resuspender cellepelleten i 1 ml LB.
  8. Fortynde overnatskulturer til 2.75x10 5 CFU / ml i LB.
    BEMÆRK: Antag, at en OD 600 enhed svarer til 1x10 9 CFU / ml for P. aeruginosa. OD til CFU / ml konverteringer kan different i andre bakterier.
  9. Der tilsættes 50 pi af fortyndet bakteriekultur til den passende brønd.
    BEMÆRK: Kulturer dyrket i NTBC bør føjes til brøndene indeholdende NTBC og kulturer dyrket i DMSO bør tilsættes til brøndene indeholdende DMSO. Se figur 1B.
    1. Tilføj bakterier til tre brønde for hver stamme og antibiotisk koncentration. Der tilsættes 50 pi LB til fjerde og at virke som en kontrol for bakteriel forurening. Se figur 1B.
    2. Brug en multikanals mikropipette til inokulering brøndene. Sørg for, at pipette tips er nær bunden af ​​brøndene, når du tilføjer inokulum at forhindre forurening af tilstødende brønde.
      BEMÆRK: Tilføjelse bakteriekultur til brøndene vil udvande de antibiotiske og NTBC koncentrationer to gange.
  10. Dæk 96-brønds plader med parafilm og inkuber ca. 24 timer ved 37 ° C. Inkuber 96-brønds plader statisk, i en luft-inkubator.
  11. Undersøgpladerne for bakterievækst i brøndene. MIC er den laveste koncentration af antibiotikum, hvor der ikke bakterievækst ses for alle tre gentagelser af hver stamme.
    1. Visuelt undersøge pladen for vækst eller læses ved hjælp af en pladelæser indstillet til OD600.

4. Spot Plate Assay for oxidativt stress respons

  1. Opsæt overnatskulturer af stammerne, der skal testes i LB med og uden NTBC som beskrevet i trin 3.1.
  2. Den næste dag, forberede LB-agarplader indeholdende H 2 O 2 som en oxidativ stressor. En serie af H 2 O 2-koncentrationer fra 0 til 1 mm er et godt udgangspunkt.
    1. Smelte LB-agar kolber. Cool medier til ca. 50 ° C ved stuetemperatur.
    2. Tilføj H 2 O 2 direkte til den afkølede medier ved de ønskede koncentrationer. Swirl kolber at blande. Se tabel 2 for koncentrationer af H 2 O 2og mængder af koncentreret H 2 O 2 for at tilføje. Disse værdier er baseret på 100 ml LB-agar.
    3. Hældeplader umiddelbart efter tilsætning af H 2 O 2 og flammer overfladen for at fjerne bobler. Udbyttet er 4 plader pr 100 ml LB-agar. Mærk pladerne med H 2 O 2 koncentration.
    4. Placer pladerne afdækket i en biologisk flow hætte med blæseren kører i 30 minutter til fjernelse af overskydende fugt fra pladerne.
      BEMÆRK: Brug pladerne samme dag, de er forberedt. I modsat fald kan resultere i inkonsistente data.
      BEMÆRK: Oxidative stressfaktorer såsom paraquat kan erstattes med H 2 O 2 i dette assay. De anvendte koncentrationer for andre oxidative stressfaktorer kan være anderledes end dem, der anvendes til H 2 O 2.
  3. Vask og måle OD600 af overnatskulturer som beskrevet i trin 3.7.
  4. Normalisere OD 600 af alle de overnight cultures til laveste værdi for sættet af stammer, der testes. P. aeruginosa har generelt en OD600 på ca. 2,5 ved dyrkning natten over i LB + NTBC eller LB + DMSO.
    1. Bestem mængden af kulturen er nødvendig for at fortynde kulturen til den laveste OD600 i et samlet volumen på 1 ml. For eksempel, hvis en kultur har en OD 600 på 3 og den laveste OD600 for sættet af stammer 2.5, udføres følgende beregning: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml kultur vil blive placeret i et mikrocentrifugerør.
    2. Beregne mængden af ​​LB + NTBC (300 uM) eller LB + DMSO nødvendige for at bringe volumenet kulturen til 1 ml. For eksempel i trin 4.4.1, mængden af ​​tilsat LB + NTBC eller LB + DMSO til kulturen vil være 0,167 ml (1 ml totalvolumen - 0,833 ml kultur). Gør stamopløsninger af LB + NTBC og LB + DMSO til brug for disse fortyndinger baseret på mængden nødvendig for at fortynde alle stammer.
    3. Bland kultur og LB + NTBC eller LB + DMSO ved hvirvelbehandling.
  5. For at opretholde kulturer i en konstant koncentration af NTBC eller DMSO, udføre ti gange serielle fortyndinger af de normaliserede overnatskulturer i PBS + NTBC eller PBS + DMSO.
    1. Gøre stamopløsninger PBS + NTBC og PBS + DMSO. For et sæt af fortyndinger for en stamme, blandes 300 uM NTBC eller et tilsvarende volumen af ​​DMSO med PBS til opnåelse af et totalvolumen på 720 pi. Skalere disse lagre op eller ned afhængigt af hvor mange stammer testes.
    2. Label mikrocentrifugerør i 10 -1 til 10 -7 seriefortyndinger. Tilføj 90 pi PBS + NTBC eller PBS + DMSO til de relevante rør. Brug PBS + NTBC for stammer, der dyrkes i LB + NTBC og bruge PBS + DMSO for stammer, der dyrkes i LB + DMSO.
    3. Tilsæt 10 ul af kultur til den passende 10 -1 fortynding rør. Vortexes og overføre 10 pi af 10 -1 fortynding til 10 -2 fortynding rør. Gentag indtil alle fortyndinger har været PerfoRMED. Skift pipettespidser mellem fortyndinger.
  6. Spot 5 pi af 10 -3 gennem 10 -7 fortyndinger på LB + H 2 O 2 plader i to eksemplarer for hver stamme. Brug en pipette spids, hvis pletter er belagt fra de fleste fortyndes til mindst fortyndet (10 -7 til 10 -3). Ikke tip eller vippe pladen, indtil væsken er tørret i pladen.
  7. Pladerne inkuberes i 24-48 timer ved 37 ° C (luftinkubator), afhængig af stammen.
    BEMÆRK: P. aeruginosa PAO1 vil have gode store kolonier på LB efter 24 timers inkubation. Inkuber stammer, indtil de har kolonier omtrent samme størrelse som PAO1.
  8. Fotografere pladerne ved hjælp af et CCD-kamera over en transluminator. Eventuelt redigere fotos til kontrast og afgrøde til samme størrelse. Tæl antallet af kolonier i hver plet at bestemme ændringer i følsomhed over for oxidativ stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC titreringer

De NTBC titreringer blev anvendt til at bestemme, om NTBC var i stand til at reducere pyomelanin i P. aeruginosa, og også identificere koncentrationen af NTBC der eliminerer eller reducerer pyomelanin produktion til brug i yderligere analyser. Der kan være variationer i niveauerne af pyomelanin fremstilles i forskellige replikationer, men generelle tendenser forbliver konstant. Den NTBC titreringsassay kunne også modificeres til at teste andre forbindelser, der kan påvirke pigment produktion i andre bakterier. Dette fungerer kun, men hvis der er en fænotypisk ændring, som kan bestemmes visuelt eller kvantificeres.

Behandling af pyomelanin producerende stammer af P. aeruginosa med NTBC resulterede i en dosisafhængig fald i pigmentproduktion 12. Figur 2 viser, at forskellige stammer af P. aeruginosa har forskelle i følsomhed over for NTBC, som angivet ved niveauer af PYOmelanin produktionen. Højere koncentrationer af NTBC var forpligtet til at reducere pyomelanin produktion i klinisk isolat PA1111 17 (opnået fra Dara Frank) i forhold til laboratoriestamme HMGA :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutantbibliotek). Stammer, der ikke producerer pyomelanin [PAO1 (fås fra Carrie Harwood) og HPD :: tn 18 (University of Washington PAO1 transposon mutantbibliotek)] viste ingen ændring i pigmentering med NTBC behandling. Vi besluttede at bruge 300 uM NTBC for vores analyser, fordi pyomelanin produktion blev væsentligt reduceret i laboratoriet stammen HMGA :: tn ved hjælp af denne koncentration (sammenlign 300 uM til 0 pM NTBC). Alle stammer anvendt i denne undersøgelse blev opbevaret ved -80 ° C i 15% glycerol.

Antibiotisk mellemindkomstlande

Antibiotiske MIC'er kan testes under anvendelse af flere forskellige metoder. Den her beskrevne mikrotiterplade metode vil tillade brugenr for at teste en række antibiotiske koncentrationer og bruge et minimum af ressourcer. Resultaterne er nemt gentages, og analysen kan modificeres for at muliggøre forskelle i antibiotisk følsomhed af organismen, der skal testes. Vis variation kan ses mellem uafhængige forsøg, men tendenser er ret konsekvent. Tekniske replikater bør udvise den samme MIC.

Tabel 3 viser resultaterne for forskellige P. aeruginosa-stammer behandlet med og uden NTBC og forskellige aminoglycosidantibiotika. Tre uafhængige kolonier blev testet i tre eksemplarer efter den beskrevne fremgangsmåde. MIC blev registreret som den laveste koncentration af antibiotikum, der hæmmede bakterievækst i alle tre tekniske gentagelser. NTBC behandling havde ingen virkning på de aminoglykosid MIC værdierne for de testede stammer.

Oxidativt stress spot pladeassayen

Stedet pladeassay til test oxidativt stress giver reproducible resultater ved hjælp af lavere niveauer af H 2 O 2 end dem, der anvendes i andre assays. Pladen uden H2O 2 er en styreplade til at bestemme nøjagtigheden af fortyndingsrækken for hver stamme, samt bestemme koloni størrelsen og antallet af kolonier i hver plet uden at udsætte cellerne for oxidativt stress. I en ordentlig fortyndingsrække bør det endelige stedet har meget få kolonier, mens den første stedet vil have en utallige antal kolonier på H 2 O 2 frie medier. Der bør være en tidobbelt forskel i antallet af kolonier i hver plet i en fortyndingsrække. For alle testede stammer, bør lignende antal kolonier ses i den samme fortynding på H 2 O 2 frie styrepladen.

Da forskellige bakteriestammer kan have forskellige følsomheder til oxidativ stress, en række H 2 O 2 koncentrationer bør testes. Stigende koncentrationer af H2O 2 O 2 induceret oxidativ stress. Vækstkarakteristika forskellige bakteriestammer kan sammenlignes for at bestemme følsomheden over for oxidativt stress under en bestemt H 2 O 2 koncentration. Assayet kan modificeres for at bestemme virkningerne af en bestemt forbindelse eller reagens, såsom NTBC, på en enkelt bakteriestamme, når bakterierne udsættes for oxidativ stress. Kolonier kan også talt for at bestemme den procentvise reduktion i bakteriel kolonidannende enheder mellem forskellige eksperimentelle betingelser.

Figur 3 viser en plet pladeassay af pyomelanin og ikke-pyomelanin producerende stammer af P. aeruginosa behandlet med og uden NTBC og udsat for H 2 O 2 induceret oxidativ stress. Der er en klar Forskelnce i følsomhed over for oxidativ stress, når pyomelanin producerende bakterier behandles med NTBC og mellem bakterier, der ikke producerer pyomelanin sammenlignet med dem, der gør producere pigment. Stammer, der ikke producerer pyomelanin, enten naturligt eller som følge af NTBC behandling, var mere følsomme over for oxidativ stress end stammer, der producerede pyomelanin.

Figur 1
Figur 1:. Skematisk af antibiotisk MIC assay 96-brønds plade oprettet (A) 100 pi 2x antibiotika af den højeste koncentration udgangspunkt er i rækken A. række B til H er fyldt med 50 pi enten LB + NTBC eller LB + DMSO uden antibiotika. (B) to fold serielle fortyndinger udføres i rækkerne A til G, hvilket resulterer i 50 pi fortyndet antibiotika i hver brønd på 2x den endelige ønskede koncentration. Række H er en kontrol godt for bacterial vækst uden antibiotika. 50 pi LB eller inokulum sættes til passende brønde, fortynde antibiotika to gange til en slutkoncentration. LB fungerer som en kontrol for bakteriel forurening i antibiotika. GM, gentamicin; Km, kanamycin; Tob, tobramycin.

Figur 2
Figur 2: NTBC titreringer af pyomelanin producenter og ikke-producenter af P. aeruginosa. NTBC reducerede pyomelanin produktion på en dosisafhængig måde i laboratoriet og kliniske pyomelanin producenter, men havde ingen effekt på pigment produktionen i stammer, der ikke producerer pyomelanin. Modificeret fra henvisningen 12.

Figur 3
Figur 3: Spot plade assay for oxidativ stress respons Bakterielle stammer var fortyndet.d til samme OD600, seriel fortyndet 10 gange, og spottet på LB-plader indeholdende forskellige koncentrationer af H 2 O 2. De 0 mM H 2 O 2 plade resultater viste, at alle stammerne blev fortyndet korrekt, som indikeret ved et tilsvarende antal kolonier i hver af pletterne af den samme fortynding for forskellige stammer. Pladerne indeholdende H2O 2 viser, at stammerne var mere følsomme over for oxidativt stress som koncentrationen af H 2 O 2 øges. Dette indikeres ved nedsat kolonitællinger i pletterne i forhold til ikke H 2 O 2 tilstand, samt en reduktion af koloni størrelse. Modificeret fra henvisningen 12.

Slutkoncentration på NTBC (uM) Volumen af NTBC (75,9 mM) at tilføje (pl)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2,64
300 3,95
600 7,91
900 11.86

Tabel 1: NTBC koncentrationer til at oprette titreringer i LB. Denne tabel giver forskellige NTBC koncentrationer og den tilsvarende mængde af NTBC bestand at tilføje til 1 ml LB.

Slutkoncentration på H 2 O 2 (mM) Beløb på 9,79 MH 2 O 2 (30% vægt) at tilføje (pl)
0 0
0,2 2.04
0,4 4,09
0.6 6.13
0,8 8,17
1 10.21

Tabel 2:. Koncentrationer af H 2 O 2 til at tilføje til LB agar for oxidativt stress spot plade assay Denne tabel giver forskellige H 2 O 2 koncentrationer og den tilsvarende mængde koncentreret H 2 O 2 bestand at tilføje til 100 ml LB-agar.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicin 1 0,5 2 2 1 1 0,5 0,5
Kanamycin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramycin 0,5 0,5 0,5 0,5 0.25 0.25 0,5 0,5

Tabel 3: Antibiotikum MIC resultater Tre uafhængige kolonier blev testet i triplikat for hvert stra.i. Re-trykt med tilladelse fra henvisning 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics