הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University
Published 10/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.

Cite this Article

Copy Citation

Tam, J. H., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ביתא-עמילואיד (Aβ) הוא המרכיב המרכזי של סנילי לוחות שנמצאו במוחם של החולים במחלת האלצהיימר. Aβ נגזר מהמחשוף רציף של חלבון עמילואיד מבשר (APP) על ידי β וγ-secretases. למרות חשיבותו של Aβ לפתולוגיה לספירה, לוקליזציה subcellular של שסעים אלה אינה מבוססת היטב. עבודה במעבדה שלנו ואחרים לסבך את מערכת endosomal / lysosomal בעיבוד APP לאחר הפנמה מתא השטח. עם זאת, הסחר תאיים של APP הוא יחסית understudied.

בעוד חלבונים על פני קרום התא הם amendable לטכניקות תיוג רבים, אין שיטות פשוטות לבעקבות הסחר של חלבונים בממברנה מGolgi. לשם כך, יצרנו מבני APP שתויגו עם GFP צילום activatable (paGFP) בC-הסופית. לאחר סינתזה, יש paGFP הקרינה בסיס נמוכה, אבל זה יכול להיות מגורה עם לא אור 413 ננומטרo לייצר הקרינה חזקה, יציבה ירוקה. על ידי שימוש בGolgi סמן Galactosyl transferase מצמידים את חלבון ציאן פלורסנט (גאלט-CFP) כמטרה, אנחנו מסוגלים APP מדויק photoactivate ברשת טרנס Golgi. אז יכול להיות אחרי מופעל-תמונות APP-paGFP כפי שtraffics לתאים במורד הזרם מזוהה עם fluorescently מתויג חלבוני סמן תא לאנדוזום מוקדם (Rab5), אנדוזום מאוחר (Rab9) והליזוזום (LAMP1). יתר על כן, שימוש במעכבים לעיבוד APP כולל chloroquine או L685 מעכב γ-secretase, 458, אנו מסוגלים לבצע ניסויי דופק מרדף לבחון את העיבוד של APP בתאים בודדים.

אנו מוצאים כי חלק גדול של APP נע במהירות להליזוזום מבלי להיראות על פני השטח של התאים, ולאחר מכן פינה מהליזוזום ידי שסעים כמו secretase. טכניקה זו ממחישה את התועלת של paGFP לבעקבות הסחר והעיבוד של חלבונים תאיים הלוך ושובמ 'Golgi לתאים במורד הזרם.

Introduction

סימן ההיכר של מחלת אלצהיימר (AD) הוא הנוכחות של פלאק סנילי וסבכים נוירו-פיברילריים (NFTS) במוח. המרכיב המרכזי של לוחות סנילי הוא β עמילואיד (Aβ). Aβ נגזר ממבשרה; חלבון המוצא לעמילואיד (APP) 1. מחשוף amyloidogenic של APP מתחיל בהסרת ectodomain מAPP על ידי β-secretase 2. בר מסוף carboxyl 99-השאריות שנותר (CTF) ניתן ביקע ידי γ-secretase לייצר Aβ 3-7. בעוד ניסויים רבים תעדו את המחשוף של שטח פני תא APP לאחר הפנמה מתא השטח למערכת endosomal / lysosomal, מספר המחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי סחר תאיים של APP הוא גם חשוב בויסות העיבוד שלה 8-11.

היו כמה ניסיונות בויסות הרמות של Aβ עם מעכבי γ-secretase וimmun Aβotherapies. עם זאת, ניסויים קליניים האחרונים בטיפולים אלה לא הראו שום תועלת, ו, במקרים מסוימים, גרם נזק 12. אסטרטגיה בלתי מנוצלת לווסת ייצור Aβ היא לשנות את לוקליזציה המשנה הסלולר של APP ואינטראקציה γ-secretase. Golgi, קרום פלזמה, וendosomes / lysosomes שכל הוצע כמקומות אפשריים לγ-מחשוף של APP. מחקר מהמעבדה שלנו מצביע על כך שAPP וγ-secretase הם חלבוני תושב קרום lysosomal 13. יתר על כן, מצאנו כי יש lysosomal γ-secretase pH האופטימלי חומצי 13. בנוסף, alkalization של מערכת endosomal / lysosomal עם chloroquine או NH 4 Cl, הוכח להפחית את הייצור של 14 Aβ. γ-secretase עיכוב או בנוקאאוט או presenilin מוביל להצטברות APP-CTFs ב15-17 הליזוזום. יתר על כן, שיבוש אנדוציטוזה APP מוריד ייצור Aβ 18-20.

למרות חשיבותו של Golgi כתחנת מיון לחלבונים וחלבונים ממוחזרים ממערכת endosomal / lysosomal המתהווים, הסחר תאיים של APP לא נחקר בפירוט 21. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי APP יכול להיות ממוחזר לרשת טרנס Golgi (TGN) באמצעות אינטראקציה עם מורכב retromer. רגולציה כלפי מטה של מתחם retromer מפחיתה את ייצור Aβ 8,22-24. עם זאת, היציאה של APP מGolgi לא נחקרה היטב.

בעוד הבא אנדוציטוזה של חלבונים על פני קרום התא, כגון קולט transferrin, מתויגים בקלות ואחריו, בעקבות הסחר של חלבונים תאיים הוא מאתגר יותר. למעשה, כמה חלבונים יש לי הסחר תאיים שלהם צילם. כניסתו של תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון צילום activatable-GFP (paGFP), סיפקה כלים חדשים לבחינת סחר תאית. תמונה-activatable-GFP הוא צורה של GFP שהוא כמעט בלתי נראה לאחר סינתזה, אבל מפתחת ירוקה הקרינה חזקה (GFP) לאחר שהופעל על ידי 413 אור לייזר ננומטר והאיתותים יציבה לימים 25,26. מבנים באמצעות paGFP שימשו כדי להדגים את סחר intralysosomal של חלבון lysosomal חלבון קרום 1 (LAMP1) 25, מסירת השטח פני תא של וירוס שלפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (VSVG, סמן של מסלול ההפרשה) 27, והמחזור של peroxisomes 28 וautophagosomes 29.

על מנת להמחיש את המיון של APP מTGN בתאים חיים, עיצבנו פלסמיד המבטא את 112 חומצות אמינו האחרונות של APP מצמידים את התמונה-activatable (paGFP) על C-המסוף (מכונה βAPP-paGFP) 30. יש לנו גם ביצעתי ניסויים אלה עם APP באורך מלא והשיגו תוצאות דומות; מבנה ΒAPP משמש כאן משום שהוא מספק תמונות בהירות. לאחר מכן, אנו צילום הפעל ו# 946; APP-paGFP רק בTGN, כמוגדר על ידי TGN סמן Galactosyltransferase (גאלט). למרות APP כבר תויג עם paGFP לדמיין תחבורה מהירה axonal של APP ואישור מאזור perinuclear, זה ההפגנה הראשונה של סחר APP מאחד תא מוגדר בזהירות ל11,31,32 אחר. הנה, אנחנו מדגימים תמונה-הפעלה מדויקת בתוך TGN ויציאה של APP לתאים במורד הזרם ומחשוף שלאחר מכן ואישור מlysosomes 30. צילום ההפעלה מדויקת בתוך Golgi היא נרחב החלים על מערכות חלבון אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא ציפוי וTransfection

  1. במנדף תרבית תאים, צלחת ~ 300,000 ל~ 500,000 SN56 תאים (מתנת סוג של ד"ר ג'יין Rylett) על צלחת confocal זכוכית תחתונה 35 מ"מ ולכסות עם תקשורת לפני transfection (הנשר בינוני השתנה Dulbecco, DMEM, בתוספת 10% FBS).
  2. דגירה תאי הלילה בשעת 37 ° C בחממה של 5% CO 2 להתרבות.
    הערה: תאים צריכים להיות כ -50% -70% ומחוברות לפני transfection.
  3. במנדף תרבית תאים, תאי transfect עם פלסמידים להביע חלבון פלואורסצנטי מתויגים סמן TGN (transferase Galactosyl מצמידים את חלבון ציאן פלורסנט, גאלט-CFP), חלבון ניאון מתויג סמן תא (כאן, חלבון הליזוזום קשור קרום 1, LAMP1, מתויג עם mRFP), והחלבון של עניין מתויג עם paGFP (βAPP-paGFP). (מבנים אלה בעבר תיארו 30)
  4. דגירה תאים עם מגיב transfection וF פלסמיד דנ"אאו 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור. השתמש ביחס ~ 2 מיקרוגרם של ה- DNA ל5 μl של סוכן transfection (למשל Lipofectamine 2000) לרעיל איזון הטוב ביותר ויעילות transfection. ריכוזים בפועל עשויים צריכים להיות מותאמים לפלסמידים שונים. בניסויים שתוארו כאן, להשתמש מיקרוגרם / צלחת 1 confocal של βAPP-paGFP, 0.3 מיקרוגרם / צלחת confocal של LAMP1-mRFP, ושל 0.2 מיקרוגרם / צלחת confocal של גאלט-CFP.
    הערה: הסכום של פלסמיד המשמש יהיה תלוי ביעילות transfection.
  5. לשורות תאים עצביות: לאחר שלב 1.4, במכסת מנוע תרבית תאים, להסיר תקשורת מראש transfection ולהבדיל תאי SN56 בDMEM 2 מיליליטר בתוספת 0.1% פניצילין / סטרפטומיצין עם 1 מ"מ dibutyryl AMP המחזורי (dbcAMP) למשך 24 שעות.

2. מיקרוסקופ שלב הכנה

  1. טרום חם שנאגרו מלוח פוספט (PBS) ומלח הפתרון מאוזן של האנק (HBSS) עד 37 מעלות צלזיוס. במה מיקרוסקופ חימום לפני imaging עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. לשטוף את תאי פעמיים עם PBS, להסיר תקשורת בידול ולהחליף עם 2 מיליליטר של HBSS על 37 מעלות צלזיוס. תאי מקום על הבמה מיקרוסקופ חיממו עד 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: תאי קיימא לכ 1.5-2 שעות בHBSS.
  3. לאפשר 5-10 דקות לטמפרטורת צלחת confocal לאזן עם הבמה מיקרוסקופ.

3. תמונה-הפעלה של ROIs על Golgi

  1. עם עינית המיקרוסקופ, למצוא תאי transfected עם גאלט-CFP, LAMP1-mRFP, וβAPP-paGFP.
    1. השתמש בעדשת נפט טבילה עם הגדלה גבוהה (כלומר 63X או 100X). לקונפורמציה החזותית של הקרינה, להשתמש במסנן להגדיר מסוגלת לדמיין FITC (לCFP וקרינת GFP) וrhodamine (לקרינת mRFP).
  2. הגדר את פרוסת confocal עבור כל ערוץ 1 מיקרומטר. קח תמונה ברזולוציה נמוכה.
  3. יבול לתמונה רק התא של עניין.
  4. שימוש בכפתור הכוונון, להגדיר באופן ידנימטוס המוקד לאמצע התא. זה בדרך כלל החלק מהתא שבו הגרעין הוא הגדול ביותר.
  5. לצייר 3-5 אזורים מעגליים של עניין (ROIs) בתוך TGN (הקרינה גאלט-CFP).
    1. לצייר ROIs (כלומר בתכנית Zeiss LSM), בחר הכפתור 'ערוך את ההחזר על ההשקעה "במסוף הפקודה.
    2. בחר בלחצן החזר על ההשקעה החוזר.
    3. לחץ וגרור על גאלט-CFP אזורים חיוביים של התא.
      שים לב: יש לי חבילות צילום הלבנת עבור מיקרוסקופים רבים יכולת זו.
  6. קח תמונה של התא עם ROIs שמעליו. שמור עותק של ROIs לעיון מאוחר יותר.
    1. כדי לשמור את ROIs לתמונה, בחר בלחצן "מאקרו".
    2. לחץ על הכפתור "טען" כדי להתחיל את 'CopyRoisToOverlay' (נתיב קובץ: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      הערה: מיקרוסקופ confocal מצויד ב475-525 ננומטר לעבור להקה (CFP) (BP), 500-530 ננומטר BP (GFP),וסטי 560 מסנן מסירה ארוכה (LP) ננומטר נדרשים. לייזר ארגון לננומטר 458 ופליטת 488 ננומטר וליזר HeNe לפליטת 540 ננומטר נדרש גם.
  7. הגדרת מיקרוסקופ לקורס זמן אקונומיקה.
    1. הגדר את דיודת הלייזר (25 ננומטר לייזר mW 405) לכוח מרבי.
      זהירות: תמונה-הפעלה מוגזמת עלולה להוביל לצילום רעילות או נזק לקרומים תאיים. השתמש בהגנה על העין כדי למנוע נזק ברשתית.
    2. הגדרת מיקרוסקופ 120 מחזורים של הדמיה.
      הערה: מחזור הדמיה אחת מורכב מהלבנה בתוך ROIs והדמיה של כל התא. זה כמובן זמן אקונומיקה.
    3. הגדר את המיקרוסקופ כדי להלבין (צילום הפעל) רק ROIs במשך 20-30 חזרות אחרי כל תמונה. זמן תמונה ואקונומיקת תמונה תשתנה. להגדיר השהיית זמן בין תמונות כל כך כל מחזור הוא כ 30 שניות.
      הערה: חלק ההדמיה של כל מחזור נמשך כ 15-30 שניות בהתאם לגודל תמונה. ההלבנה עבור כל ROאני הוא כ -50 אלפיות שני. הלבנה של כל 4 ROIs במשך 20 חזרות תיקח 4 שניות בסוף כל מחזור אקונומיקה / תמונה.
  8. התחל את מהלך זמן אקונומיקה.
  9. כבה את ההלבנה לאחר 15 דקות (30 מחזורים של הדמיה והלבנה), אבל להמשיך בלכידת תמונות של התא.
    הערה: זמן 0 עד 15 דק 'היא התקופה "הדופק".
  10. המשך לכידת תמונות במשך 45 דקות (ללא הלבנה), לעקוב אחר פינוי βAPP-paGFP.
    הערה: זמן 15 עד 45 דקות היא התקופה "המרדף".
  11. שימוש בשיטת הניתוח שתוארה בשלב 6, שיתוף למקם את החלבון של עניין (כאן, βAPP-paGFP) עם התא של עניין (כאן, LAMP1-mRFP) על ידי ביצוע משטחים לכל ערוץ.

4. לקבוע את התא במורד הזרם

  1. כדי לקבוע אם lysosomes (בניסויים אלה) הוא התא הסופי, להוסיף מעכבי פרוטאז קרום חדיר לחלבונים לגרום לצבור בהליזוזום.
    1. לβAPP, להשתמש 0.5 מיקרומטר L685, 458 (מעכב γ-secretase הספציפי) לילה או chloroquine 100 מיקרומטר (lysosomes deacidifies) למשך 30 דקות לפני ההדמיה.
  2. מצא את התאים וphotoactivate כמו בשלב 3.1-3.8.
  3. תמונת התא ל45-דקות נוספות (ללא תמונה-הפעלה) כדי לקבוע היכן βAPP-paGFP מצטברת בהעדר המחשוף.
  4. לנתח את המסירה של חלבון לlysosomes (או תא במורד הזרם אחר) ולאחר מכן אישור על פי השיטה המתוארת בשלב 6.

5. להבטיח דיוק של תמונות-הפעלה בתוך Golgi

  1. HBSS חם-עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכן פתרון 2 מיליליטר, לכל צלחת confocal להיות צילמה, של 66 מיקרומטר nocodazole (טיפול) או DMSO (שליטה) בHBSS.
    1. לצלחת confocal אחד, פיפטה 2 מיליליטר של 37 ° C HBSS ולהוסיף 7.96 μl של nocodazole ממניות nocodazole 16.60 מ"מ.
    2. כביקורת כל כךlution, פיפטה 2 מיליליטר של 37 ° C HBSS לתוך צינור 2 מ"ל ולהוסיף 7.96 μl של DMSO.
  3. דגירה תאים בHBSS עם nocodazole או DMSO ל5 דקות לפני ההדמיה.
  4. מצא את התאים כמו בשלב 3.1.
  5. לפני photoactivation, להכין מיקרוסקופ כדי לקחת Z-ערימה לאחר תקופת צילום ההפעלה.
    1. לחץ על הכפתור "Z סטאק". להתחיל לסרוק באמצעות XY המהיר.
    2. התאם את מישור המוקד עם כפתור כוונון מיקרוסקופ לחלק העליון של התא. לחץ על "מארק הראשון" כדי להגדיר את המיקום הראשון בערימה.
    3. התאם את מישור המוקד עם כפתור כוונון מיקרוסקופ לתחתית (הקרוב ביותר לזכוכית) של התא. לחץ על "מארק האחרון 'כדי להגדיר את תפקידו האחרון במחסנית.
    4. בפנל ערימת Z, לחץ על הכפתור 'Z חתך ". הגדר את 'המרווח' 1 מיקרומטר.
      הערה: רזולוציה מרחבית גבוהה מחסנית מרווח ערימה קטנה יותר, אבל יותר תמונות יצטרכולהילקח הארכת תקופת ההדמיה לערימה.
  6. להלבין את התאים, כמתואר בשלב 3.7-3.8. תמונה-הפעל ותמונה מ0 דקות עד 15 דקות (30 מסגרות).
  7. תפסיק הדמיה לאחר 30 מסגרות. מייד לשמור תמונה של הווידאו.
    זהירות: מיקרוסקופים מסוימים עשויים להחליף וידאו ראשון אם זה לא נשמר לפני שמתחיל רצף הדמיה שני.
  8. לאחר שמירת הווידאו, לרכוש מייד Z-ערימה, באמצעות הפרמטרים מהשלב 5.5.
  9. שיתוף למקם βAPP-paGFP עם גאלט-CFP (או סמן Golgi אחר), כמתואר בשלב 6.
    הערה: CFP photobleaches במהירות ולא יכול להיות גלוי עד סוף תקופת ההדמיה. Colocalization לא יכול להיות אפשרי עם גאלט-CFP. אם נדרש colocalization, להשתמש mRFP לתייג גאלט.

6. שלפוחיות סינון וcolocalization

  1. השתמש בתכנית ניתוח (למשל Imaris) כדי להפוך את המשטחים של התא (למשל LAMP1-mRFP) וo חלבוןעניין F (למשל βAPP-paGFP).
  2. הזן את הסעיף 'לעלות' של תכנית הניתוח על ידי לחיצה על הכפתור לעלות על שורת תפריטים העליונה.
  3. בחר בלחצן אשף השטח בחלק העליון של רוב הפנל מהשמאל (5 כפתור ה מהשמאל).
  4. בחר ערוץ לסנן שלפוחית ​​(הקרינה כלומר βAPP-paGFP, חלבון של עניין).
  5. לבצע חיסור רקע על ידי הגשת הקוטר של השלפוחית ​​הגדולה ביותר בתחום לאשף ולחץ על הבא. תכנית הניתוח בוחרת באופן אוטומטי - על בסיס סף נובע מהשלפוחית ​​הגדולה ביותר בתחום - האזור בערוץ של עניין.
    1. באופן ידני להתאים את רקע הסף כדי לחדד את הבחירה במידת הצורך.
  6. בחלק התחתון של מסך בחירת הסף, לבדוק אפשרות של האובייקטים נוגעים ללב ספליט "להפריד את המשטחים בשילוב.
    הערה: אם שלפוחית ​​רבות מקובצים באופן הדוק לgether, קבוצת תכנית ניתוח אובייקטים אלה תחת משטח אחד.
    1. בחר 10-15 שלפוחית ​​נציג ולחשב את קוטר השלפוחית ​​הממוצע ולהזין את התוצאה באשף.
  7. לחדד את נקודות זרע שנבחרו על ידי הגדלת או הקטנת הסף על 'איכות' (עוצמת הערוץ באמצע כל מקום).
    הערה: משטחים של ערוץ עניין ייווצרו. חידוד נוסף של המשטחים שנבחרו ניתן לבצע בשלב זה. שלפוחית ​​סף המבוסס על מספר הפיקסלים בכל שלפוחית.
  8. מסכת הערוץ המקורי עם משטח זה. כדי להסוות, בחר בכרטיסייה 4 מהשמאל באשף יצירת משטח (עיפרון).
  9. בחירה 'מסכה כל ". ערוץ חדש עם שלפוחית ​​של עניין ייווצר.
    הערה: במהלך תהליך המסכה, אפשרות לשכפל את הערוץ המקורי מוצעת. בחר באפשרות זו אם נתונים המקוריים צריכה להיות נשמרו.
  10. חזור על ים6.1 teps דרך 6.7 לערוץ לא מסונן (כלומר LAMP1 mRFP, תא).
  11. בסרגל הכלים העליון, בחר בכלי colocalization.
    1. בפנל העליון, כהיסטוגרמות של הערוצים להיות colocalized מופיעה, בחר את הערוצים רעולי פנים שנוצרו לאחרונה.
    2. בחר את כל הנתונים זמינים. יש פיקסלים כהים שלעתים נוכחי לאחר ניתוח. אל תבחרו פיקסלים אלה בהיסטוגרמה, הם להטות את התוצאות.
    3. בפנל הימני הרחוק, בחר 'לבנות Coloc ערוץ ". זה יוצר ערוץ חדש המכיל רק את הפיקסלים colocalized. הנתונים יהיו באותו הפנל תחת הכפתור "ערוץ סטטיסטיקת". ניתן לייצא את הנתונים כקובץ CSV.
    4. השתמש בנתון "אחוז מהחומר colocalized '. אפשרות זו לוקחת בחשבון את עוצמת פיקסלים והגודל של האובייקט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות אופייניות להראות βAPP עוזב TGN ומופיע לתנועה במהירות לLAMP1 (איור 1 א 'וב'). במהלך תקופת צילום ההפעלה, ניתן לראות שלפוחית ​​היוצאת Golgi מיועד לlysosomes (איור 1). ללא טיפול מעכב, הקרינה paGFP תהיה גלויה בlysosomes בעוד שתמונה-הפעלה בTGN. לאחר הפסקת photoactivation, βAPP-paGFP מנוקה במהירות מהליזוזום (השווה איור 1 א ל1b). טיפול בnocodazole מוביל להצטברות של APP בתוך גאלט-CFP שכותרתו תאים ומונע סחר לlysosomes (איור 1 ג ').

המוטציה השבדית של APP (APPsw) מגבירה את קצב β-ידי המחשוף של פי 10 34. עם מחשוף מהיר של βAPPsw-paGFP, הקרינה paGFP מופיעה כאות הקרינה מפוזרת בcytosol. יש להניח שזהשל התוצאה של מחשוף βAPP מהיר על ידי γ-secretase שחרור paGFP C-המסוף לציטופלסמה (איור 2). בנוכחות מעכב γ-secretase, βAPP מצטבר בתוך lysosomes.

לאחר המסירה של βAPP להליזוזום, הקרינה paGFP מנוקה במהירות. הזמן קצר המגורים יכול להיות התוצאה של סחר מהליזוזום לתא אחר. לעומת זאת, מחשוף של βAPP ידי γ-secretase יהיה צפוי להוביל לדיפוזיה של הקרינה paGFP מקרום lysosomal (איור 3 א). הקרינה המפוזרת קשה יותר לזהות על ידי מיקרוסקופ confocal. כדי לקבוע אם βAPP מועבר לתא אחר או פינה, טופלו תאי SN56 עם מעכב ספציפי נגד γ-secretase (L685, 458) או סוכן alkalinizing (chloroquine). התוספת של שני L685, 458 או chloroquine הביאה הצטברות APP בהליזוזום ( Rong> 3 ב איור וג).

הוא מקובל שAPP מועבר לתא-פני השטח לפני שendocytosed ומעובד בendosomes וlysosomes 35. עם זאת, בתאים שלא טופלו שלנו, על פני קרום תא βAPP לא יכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופיה confocal. βAPP מופעלת תמונה לא יכולה להיות מרוכזת באזור מסוים של קרום פלזמה. במקום זאת, ייתכן שיש הקרינה מפוזרת על פני שטח הפנים הגדול של קרום הפלזמה. מעניין, טיפול מעכב γ-secretase מוביל לזיהוי βAPP-paGFP בתא השטח (איור 3). γ-secretase טיפול מעכב רשאי מסלול יותר βAPP לתא השטח, בנוסף לעיכוב אנזים פונקציה. לכן, שטח הפנים הגדול של קרום הפלזמה מתפשט paGFP על פני שטח גדול יותר והופך את זיהוי קשה, למרות שהחלבון שנסחרו לתא.

1 "src =" / קבצים / ftp_upload / 53,153 / 53153fig1.jpg "/>
איור 1. הדמיה הסחר של APP לlysosomes. SN56 תאים היו transfected עם LAMP1-mRFP, גאלט-CFP, וβAPP-paGFP.) התא היה מדויק צילום מופעל בתוך ROIs ממוקמת מעל Golgi (ROIs כונה על ידי עיגולים לבנים ). התא היה לחלופין וצלם במשך 15 דקות כדי לקבוע סחר βAPP-paGFP מופעל תמונה. הבלעה מראה סחר בתחום perinuclear מGolgi לlysosomes. פיקסלים-מקומי Co מופיעים צהוב. ב) הסחר של שלפוחית ​​המכילה βAPP-paGFP להליזוזום. צהובים פיקסלים לציין LAMP1 וטופלו SN56 תאים βAPP-paGFP colocalization. ג) עם nocodazole לפני ההדמיה כדי למנוע יציאה βAPP-paGFP מTGN. תמונה מייצגת נלקחה מתום תקופת צילום ההפעלה. בחלונית הימנית, Z-ערימת אותו התא שנלקחה מייד לאחר צילום הפעלה. ה דואר גאלט-CFP היה אדום בצבע כוזב כדי לשפר את ההדמיה של colocalized גאלט-CFP וβAPP-paGFP. צהובים פיקסלים לציין colocalization בין גאלט-CFP וβAPP-paGFP. ברים סולם מייצגים 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
סחר איור 2. של βAPPsw-paGFP. תאי SN56 היה transfected עם LAMP1-mRFP, גאלט-CFP וβAPPsw-paGFP (βAPP עם המוטציה השבדית המשפחתית). המוטציה השבדית מגדילה את השיעור שAPP הוא ביקע. תאים היו לחלופין בתוך וצלמה מופעלת התמונה Golgi. הקרינה מפוזרת ניתן לראות לאחר paGFP מנותק מקרום lysosomal לנטרל לתוך הציטופלסמה. בר סולם מייצג 5 מיקרומטר.53 53153fig2large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. קביעת אברון המסוף. SN56 תאים היו transfected עם LAMP1-mRFP, גאלט-CFP וβAPP-paGFP. לאחר צילום הפעלה, תאים היו במעקב במשך 45 דקות נוספות. שני השמאליים ביותר הפנלים להראות את התאים לפני photoactivation (השמאלי ביותר) ו -15 דקות לאחר photoactivation (באמצע). הפנל על ימין הקיצוני מציג הקרינה APP לאחר 45 דקות של הדמיה הכוללת בב) מעכב γ-secretase) שלא טופל, טופלו, או ג) chloroquine טופלו. ראשי חץ להצביע על APP עם LAMP1 לאחר 45 דקות של הדמיה-מקומי במשותף. ברים סולם מייצגים 5 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ההוא דמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקה זו מתארת ​​את התמונה-ההפעלה מדויקת של חלבוני קרום מתויגים עם paGFP בTGN לדמיין סחר ומחשוף שלאחר מכן. בעוד paGFP נוצר לפני למעלה מעשור 25, זה הוא הדוגמא הראשונה של תמונה-הפעלה מדויקת למעקב הסחר של חלבונים המתהווה לתאים במורד הזרם. מחקרים קודמים באמצעות APP-paGFP בונה אזור פרי-גרעיני של התא, שנחשב ל11 Golgi-הופעל תמונה. עם זאת, ניתן למצוא גם ברור כמו בmicrographs שלנו, lysosomes, endosomes המוקדם, ומאוחר endosomes באזור זה (איור 1 והתייחסות 30). ניסויים אלה כבר לרוץ בהצלחה בתאי HEK293, תאי COS7, תאי SN56 עצביים, תאי SH-SY5Y, ונוירונים עכבר, למרות יעילות transfection של נוירונים עכבר היא נמוכה. ניסויים דומים בוצעו באמצעות בונה מלאה APP האורך ובונה מקוצר, הכוללת 112 אמינו האחרוןחומצות של APP, עם אתרי β- וγ-מחשוף, התמזגו paGFP. בונה המקוצרת קלה יותר transfect ולספק אות ניאון גבוהה יותר, ואלה מוצגים בדמויות הנלוות. בונה המקוצרת שלנו גם חוסר ectodomain N-מסוף, שבו יש שסעים מוגדרים ואותות מיון 38. למרות אותות N-מסוף אלה ושסעים, אנו מוצאים כי יש המבנה המקוצר שלנו לוקליזציה דומה וסחר כאורך מלא 30 APP-paGFP, 33.

בגלל אברונים הרבים באזור פרי-גרעיני של התא, כל מאמץ נעשה כדי להבטיח את הדיוק של תמונה-הפעלה. במהלך תקופת ההדמיה, התא וGolgi יעברו. לכן, ROIs צילום ההפעלה חייבת להיות במעקב צמוד במהלך תקופת הפעלת צילום ומותאם להישאר בחלק העליון של Golgi. מיקרוסקופי confocal רגישים לשינויים קטנים בטמפרטורות. לדוגמא, AC או חימום פתחים מעל microscoPE עלול לגרום לשינוי של מטוס ההדמיה.

על מנת לשמור על עקביות בין ניסויים, שהצבנו השהיית זמן בין כל מחזור / הדמיה פוטו-הפעלה. הזמן נדרש כדי להלבין את ROIs ותמונת התא. בהתאם לגודל של התא ומספר ROIs, הזמן כדי להלבין ולקחת תמונה אחת תשתנה. על מנת לשמור על עקביות מתמונה לתמונה, להגדיר השהיית זמן בין תמונות כך שכל תמונה, כולל הלבנה, דורש כ 30 שניות. החלטה זמנית מוגברת יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במערכות גילוי שמעסיקות מעצב קרן (למשל גלאים חיים LSM5). מיקרוסקופים אלה יכולים תמונה ב 120 מסגרות / שני ללא הפסד ברזולוציה.

כדי לאשר את הדיוק של תמונה-הפעלה, זה הכרחי כדי לבצע בקרת nocodazole. על ידי חסימת תחבורה מGolgi בתמונה-הפעלה, זה מבטיח כי paGFP לא להיות מופעל באופן משמעותי בתאים האחרים.צילום מלביני CFP במהירות עם חזרו הדמיה והלבנה ויכולים לעשות colocalization עם גאלט-CFP קשה. אם כמות גדולה של הקרינה paGFP נשארת באזור Golgi, זה יכול גם להצביע על תמונה-הפעלה מדויקת. לחלופין, גאלט יכול להיות מתויג עם mRFP, שהוא יותר יציב מאשר צילום CFP בניסויים אלה.

הפעלה משופרת בתוך Golgi גם ניתן להשיג עם מיקרוסקופ רב-פוטונים. בעוד מטוס ההדמיה confocal בניסויים אלה הוא בדרך כלל פרוסה 1 מיקרומטר, הלייזר להדמיה וצילום הפעלה יעבור דרך כל התא. לייזר רב-פוטון יכול לשמש לניסויים אלה, ועשויים לשפר את הדיוק בכל שלושת הממדים 35. עם זאת, כפי שהודגם כאן, דיודת לייזר 405 ננומטר מסורתי די במדויק צילום להפעיל βAPP-paGFP בתוך TGN.

כביקורת, שבצענו ניסויים דומים לקרינת VSVG-paGFP. VSVG-paGFP, שהואנמסר constitutively לתא השטח 27,37, היה דמיין מועבר לאזורי משנה הספציפיים של קרום הפלזמה 30. זה מבטיח כי תחבורה לתאים תאיים אינה מופעלת על ידי יתר ביטוי או הנוכחות של תג paGFP.

הקרינה paGFP מפוזרת עשויה להיות קשה למקם על ידי מיקרוסקופ confocal. מניסיוננו, APP הוא ביקע במהירות ונראה שיש לי חיים קצרים כמו חלבון באורך מלא בקרום lysosomal. בעיה זו מחריפה על ידי המוטציה FAD השבדית שמאיצה את קצב מחשוף APP 34. להעסיק את הטכניקה לחלבונים ביקעו במהירות, מעכב הוא קריטי כדי לקבוע את התא במורד הזרם הסופי. עיכוב של γ-secretase ידי L685, 458 או chloroquine להוביל להצטברות משמעותית של APP בlysosomes; אפילו עם המוטציה השבדית.

אם משתמש יותר מדי מעכב, זה יכול להוביל לAC תאיים צבירה של βAPP-paGFP, ועלולות להוביל לתכלילים חלבון. צבר paGFP בתוצאות תכלילים בתכלילים paGFP ניאון בתא לפני הניסוי החל (תצפיות לא פורסמו, כלומר טיפול בלילה עם 40 מיקרומטר chloroquine). יש להשתמש בריכוז מעכב המונע מחשוף של החלבון של עניין, אך אינו מובילה להיווצרות הכללה. על-transfection של תאים עם paGFP יכול גם לגרום לתכלילים ברורים של paGFP, אשר לזרוח בלי תמונה-הפעלה. חדש paGFP מופעל תמונה יהיה מועדפת תנועה לתכלילים אלה ולהפריע לפרשנות של התוצאות. כאשר מחפשים תאים לתמונה, להימנע מתאים עם תכלילים paGFP ברורים. מניסיוננו עם βAPP-paGFP, יש הקרינה ירוקה קלושה מאוד בתאים המבטאים βAPP-paGFP ברמה המתאימה. הקרינה קלושה זה בדרך כלל לא יכול להיות צילמה וניתן לראות רק דרך עינית.

= "Jove_content"> מגבלה נוספת של שיטה זו היא החלבון שנסחר למבנה קרום גדול (קרום פלזמה כלומר) עשוי להיות קשה לזהות. זה יכול להיות בגלל אות הניאון, שמשתרעת על פני שטח גדול, מדולל או בגלל פרופיל הקרום בחתך נמוך מהרזולוציה של מיקרוסקופ confocal. ייתכן שניתן לעקוף בעיה זו על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. עם זאת, זה יהיה להפחית באופן משמעותי את הרזולוציה המרחבית של הטכניקה.

יתרון של שיטה זו הוא בתחולתה לחלבוני קרום אחרים. בעוד טכניקה זו תלויה ברחבי ביטוי של כמה חלבונים, נראה כי סחר בחלבון אינו גלוי שיבש, כפי שכבר הוכיח בVSVG-paGFP וβAPP-paGFP 30. בנוסף להליזוזום, סמנים אחרים של endosomal / מערכת lysosomal גם שימשו בהצלחה. אלה כוללים rab5-mRFP לסיום מוקדםosome וrab9-mchFP (חלבון פלואורסצנטי דובדבן) לאנדוזום מאוחר. טכניקת מיקרוסקופיה חזקה זו ניתנת להארכה למעקב הסחר של חלבונים אחרים מTGN. זה באותה מידה יכול להיות מיושם על מעקב סחר בין תאים נפרדים הניתנים סמני תא מוגדרים היטב זמינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד עניינים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, (12), 4245-4249 (1985).
  2. Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286, (5440), 735-741 (1999).
  3. De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391, (6665), 387-390 (1998).
  4. Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (16), 9299-9304 (2000).
  5. Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (11), 6138-6143 (2000).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280, (41), 35069-35076 (2005).
  7. Pawar, A. P., et al. Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350, (2), 379-392 (2005).
  8. Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195, (5), 765-779 (2011).
  9. Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39, (2), 168-177 (2007).
  10. Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (38), 13461-13466 (2005).
  11. Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282, (45), 32956-32964 (2007).
  12. Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10, (1), 18 (2013).
  13. Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278, (29), 26687-26694 (2003).
  14. Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716, (1-2), 91-100 (1996).
  15. Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255, (5045), 728-730 (1992).
  16. Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14, (3), 651-659 (1995).
  17. Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275, (47), 36794-36802 (2000).
  18. Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274, (27), 18851-18856 (1999).
  19. Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58, (1), 42-51 (2008).
  20. Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
  21. Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9, (4), 527-533 (1997).
  22. Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5, (1), 40 (2010).
  23. Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43, (2), 338-3345 (2011).
  24. Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32, (4), 1467-1480 (2012).
  25. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297, (5588), 1873-1877 (2002).
  26. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32, (4), 445-450 (2004).
  27. Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143, (6), 1485-1503 (1998).
  28. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173, (4), 521-532 (2006).
  29. Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141, (4), 656-667 (2010).
  30. Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7, (1), 54 (2014).
  31. Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70, (3), 441-454 (2011).
  32. Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41, (2), 166-174 (2009).
  33. Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3, (1), 11 (2010).
  34. Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271, (16), 9390-9397 (1996).
  35. Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283, (44), 29615-29619 (2008).
  36. Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89, (2), 1346-1352 (2005).
  37. Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11, (1), 13-22 (2000).
  38. Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats