成像APP的细胞内运输与光活化GFP

Biology

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Summary

而细胞表面蛋白的传输相对容易地研究,可视化细胞内蛋白质的贩卖是困难得多。在这里,我们使用结合光活化绿色荧光蛋白的结构和表现出的方​​法来准确地遵循从高尔基体向下游车厢淀粉样前体蛋白,并按照其清除。

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Tam, J. H., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

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Abstract

β-淀粉样蛋白(Aβ)是在阿尔茨海默氏病的患者的脑中发现的老年斑的主要成分。 Aβ是从淀粉样前体蛋白(APP)由β和γ-分泌的顺序裂解而得。尽管Aβ对AD病理学的重要性,这些分裂的亚细胞定位还不够健全。在我们的实验室工作和其他人从细胞表面内化后牵连内体/溶酶体系统中APP加工。然而,APP的细胞内运输也比较充分研究。

而细胞表面蛋白是易于进行许多标记技术,没有简单的方法从高尔基体以下的膜蛋白的贩卖。为此目的,我们创建了APP的构建体具有标记光活化GFP(paGFP),在C末端。合成后,paGFP具有低基础荧光,但它可以与413纳米的光吨被刺激Ø产生一个强大,稳定的绿色荧光。通过使用高尔基标记半乳糖基转移酶耦合到青色荧光蛋白(GALT-CFP),为目标,我们能够准确地光活化的APP在反面高尔基网。因为它贩卖标识用荧光下游隔室的初级内体(Rab5的)时,次级内体(内Rab9)和溶酶体(LAMP1)的标签隔室标志物蛋白被光激活的APP-paGFP之后可。此外,使用抑制剂以APP加工包括氯喹或γ分泌酶抑制剂L685,458,我们能够进行脉冲追踪实验,以检查APP的处理在单个细胞。

我们发现的APP的很大一部分迅速动作,溶酶体没有出现在细胞表面,然后被从溶酶体清零分泌状分裂。该技术演示paGFP的实用程序来回回以下细胞内蛋白质的贩运和加工米高尔基到下游隔室。

Introduction

阿尔茨海默氏病(AD)的特点是老年斑和神经原纤维缠结(NFTS)在脑中的存在。老年斑的主要成分是β淀粉样(Aβ)。 Aβ是由其前体衍生的;淀粉样前体蛋白(APP)1。 APP的淀粉样蛋白形成切割开始除去胞外域的来自APP的由β分泌2。剩余的99个残基的羧基末端片段(CTF)可通过γ分泌裂解以产生Aβ的3-7。虽然许多实验已经证明的细胞表面APP的裂解从细胞表面到核内体/溶酶体系统内化后,最近的一些研究已经表明,APP的细胞内运输也是在调节其处理8-11重要。

已经有一些尝试,在调控Aβ水平与γ分泌酶抑制剂和Aβ与免疫otherapies。然而,随着这些疗法最近的临床试验表明没有好处,而且,在某些情况下,造成的损害12。一个未开发策略以调节Aβ生成是改变APP的亚细胞定位和γ分泌相互作用。高尔基体,质膜和胞内体/溶酶体都被认为是可能的语言环境γ裂解APP的。从我们的实验室的研究表明,APP和所述γ分泌是溶酶体膜13的居民的蛋白质。此外,我们已发现,溶酶体γ分泌具有酸性最适pH 13。此外,内体/溶酶体系统与氯喹或NH 4的Cl碱化,已经显示减少生产的Aβ14。 γ-分泌酶的抑制或敲除或早老导致APP-CTFS堆积在溶酶体15-17。此外,扰乱APP内吞作用降低Aβ生成18-20。

尽管高尔基作为分类站为新生蛋白质,并从内体/溶酶体系统回收蛋白的重要性,APP的细胞内运输尚未详细研究21。最近的工作表明,APP可以经由与Retromer Complex功能相互作用再循环到反面高尔基网(TGN)。在Retromer Complex上的下调减少Aβ产生8,22-24。然而,APP的从高尔基体出口未得到很好的研究。

而以下细胞表面蛋白,例如转铁蛋白受体的内吞作用,很容易被标记并且随后,以下细胞内蛋白质的贩卖是更具挑战性。事实上,很少有蛋白质有他们的细胞内运输成像。荧光蛋白标记,如光活化-GFP(paGFP)的出现,提供了新的工具来研究细胞内运输。光活化-GFP是GF形式P,该是合成后几乎不可见,但发展强烈的绿色(GFP)的荧光通过413纳米的激光活化之后并且该信号是稳定的天25,26。使用paGFP构建体已经用于证明溶酶体蛋白的溶酶体内贩卖膜蛋白1(LAMP1)25,在细胞表面递送水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG,分泌途径的标志物)27,和过氧化物酶的周转28和自噬体29。

为了可视化的APP从TGN中 ​​活细胞分选,我们设计了质粒表达APP的最后112个氨基酸耦合到光活化(paGFP)上的C末端(称为βAPP-paGFP)30。我们还进行这些实验,全长APP取得了相似的结果;的βAPP构建在这里使用,因为它提供更明亮的图像。然后,我们光激活β APP-paGFP只有在TGN,所划分的TGN标记半乳糖(高尔特)。虽然APP已经被标记为paGFP可视化APP的快速轴突运输和清关的核周区域,这是APP贩运的第一个示范从一个仔细界定室到另一个11,31,32。在这里,我们展示了TGN内精确的光激活和APP的出口进入下游的车厢和随后的裂解和清除从溶酶体30。高尔基内的精确光激活可广泛适用于其它蛋白质的系统。

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Protocol

1.电池电镀和转染

  1. 在细胞培养罩,钢板〜30万至五十万元SN56细胞(简Rylett博士惠赠)在35毫米的玻璃底焦的菜,并与预染的媒体覆盖(贝科改良Eagle培养基,DMEM,辅以10%FBS)。
  2. 在一个5%CO 2培养箱增殖过夜孵育细胞,在37℃。
    注:细胞应为约50%的转染前-70%汇合。
  3. 在细胞培养罩,转染细胞用质粒表达的荧光蛋白标记的TGN标记(半乳糖基转移酶耦合到青色荧光蛋白,GALT-CFP),荧光蛋白标签隔室的标志(这里,相关溶酶体膜蛋白1,LAMP1,具有标记MRFP),和感兴趣的具有标记paGFP(βAPP-paGFP的蛋白)。 (这些构建之前已描述30)
  4. 孵育细胞与转染试剂和质粒DNA˚F或24小时,在37℃下在5%CO 2培养箱。使用的DNA的〜2微克的比率为5微升转染试剂例如脂质体2000),以最佳平衡的细胞毒性和转染效率。实际浓度可能需要为不同的质粒进行优化。在这里描述的实验中,使用βAPP-paGFP的1微克/共聚焦盘,LAMP1-MRFP 0.3微克/共聚焦盘,和GALT-CFP的0.2微克/共焦菜。
    注意:使用质粒的量将取决于转染效率。
  5. 神经元细胞系:步骤1.4之后,在细胞培养罩,除去预转染培养基和分化SN56细胞在2ml的DMEM补充有0.1%青霉素/链霉素用1mM二丁环AMP(dbcAMP)24小时。

2.显微镜阶段准备

  1. 预温热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Hank氏平衡盐溶液(HBSS)至37℃。意马前热身显微镜阶段吴至37℃。
  2. 用PBS洗涤细胞两次,以除去分化培养基和2毫升HBSS中替换,在37℃。在显微镜阶段将细胞加热到37℃。
    注:细胞是活的,在HBSS中约1.5-2小时。
  3. 允许5-10分钟为共焦板温度达到平衡与显微镜阶段。

3.光激活的ROI在高尔基

  1. 用显微镜目镜,发现转染GALT-CFP,LAMP1-MRFP,和βAPP-paGFP。
    1. 使用的油镜镜头,高倍率( 63X或100X)。对于荧光视觉形态,使用设置能够可视化FITC(适用于CFP和GFP荧光)和罗丹明(对于MRFP荧光)的过滤器。
  2. 共焦切片为每个通道设置为1微米。取一个低分辨率图像。
  3. 裁剪图像所感兴趣的细胞。
  4. 利用调整旋钮,手动设置焦平面到小区的中间。这通常是其中核是最大的小区的一部分。
  5. 在TGN(GALT-CFP荧光)内画利益(投资回报)​​3-5圆形区域。
    1. 为了吸引投资回报( 蔡司LSM程序),选择“编辑ROI”命令控制台按钮。
    2. 选择圆形ROI按钮。
    3. 单击并拖动超过GALT-CFP电池的正面区域。
      注意:光漂白包许多显微镜具有这种能力。
  6. 采取与重叠的ROI的细胞的图像。保存ROI的副本,以供日后参考。
    1. 要将投资回报保存图像,选择“宏”按钮。
    2. 按“加载”按钮,启动“CopyRoisToOverlay”(文件路径:C:/AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb)。
      注:共聚焦显微镜配备有475-525纳米(CFP)带通(BP),一个500-530纳米的BP(GFP),和560纳米长通(LP)滤波器组是必需的。也需要458纳米和488纳米发射和540nm的发射氦氖激光器的氩激光。
  7. 设置在显微镜的漂白时间过程。
    1. 设置激光二极管(25毫瓦405纳米的激光),以最大功率。
      注意:过度的光激活会导致光毒性或损害细胞膜。使用保护眼睛,避免视网膜损伤。
    2. 设置了显微​​镜成像120次。
      注:一个成像周期包括在投资回报中的漂白和整个小区的成像。这是漂白时间过程。
    3. 将显微镜漂白(光激活),只有投资回报的每张图片后20-30迭代。的时间,以图像和漂白的图像会有所不同。设置图像之间的时间延迟,所以每个周期大约是30秒。
      注:每个周期的成像部分大约需要15-30秒取决于图像大小。漂白每个RO余为约50毫秒。所有4个感兴趣区为20次迭代的漂白需要4秒在每个漂白/图象周期​​的结束。
  8. 启动漂白时间过程。
  9. 关掉漂白15分钟(成像和漂白的30个循环)之后,但继续捕获细胞的图像。
    注:时间0至15分钟是“脉冲”时期。
  10. 继续拍摄图像的45分钟(不含漂白),跟随βAPP-paGFP的间隙。
    注:时间15至45分钟是'追'的时期。
  11. 使用在步骤6中描述的分析方法,共定位的兴趣(这里,βAPP-paGFP)与感兴趣的隔室(在此,LAMP1-MRFP)通过使表面到每个信道的蛋白质。

4.确定下游腔

  1. 以确定是否溶酶体(在这些实验中)是最后的隔室中,添加膜可渗透蛋白酶抑制剂以引起蛋白质积累在溶酶体。
    1. 对于βAPP,使用0.5微米L685,458(具体的γ分泌酶抑制剂)晚上或100μM氯喹(deacidifies溶酶体)成像前30分钟。
  2. 查找细胞和光活化按照步骤3.1 - 3.8。
  3. 图像的细胞另外45分钟(没有光激活)来确定该βAPP-paGFP积累在缺乏裂解。
  4. 根据在步骤6中描述的方法进行分析的递送蛋白的溶酶体(或其它下游隔室)和随后的间隙。

5.高尔基内确保光活化的精度

  1. 热身HBSS至37℃。
  2. 制备2ml的溶液,对于每一个共焦板要被成像的66μM诺考达唑(处理)或DMSO(对照)在HBSS中。
    1. 其一共聚焦板,加入2毫升37℃HBSS和从16.60毫米诺考达唑库存增加7.96微升诺考达唑的。
    2. 作为控制如此而定,加入2毫升37℃HBSS到2ml管中,并加入7.96微升DMSO中。
  3. 孵育细胞,在HBSS中与诺考达唑或DMSO进行成像之前5分钟。
  4. 发现细胞在步骤3.1。
  5. 光激活前,准备显微镜拍照,激活期限后Z堆栈。
    1. 点击'Z堆栈“按钮。开始扫描使用快速XY。
    2. 调整焦平面与显微镜调整旋钮电池的顶部。按“马克先'设置在堆栈中的第一个位置。
    3. 调整焦平面与细胞的显微镜调整旋钮的底部(最靠近玻璃)。按'马克最后'来设置在堆栈中的最后一个位置。
    4. 在Z堆叠面板,按“Z切片”按钮。将“间隔”为1微米。
      注意:对于更高的空间分辨率堆栈较小堆栈间隔,但更多的图像将需要采取延长为栈的摄像期间。
  6. 漂白细胞,如在步骤3.7-3.8中描述。光激活和图像从0分钟至15分钟(30帧)。
  7. 30帧后停止成像。立即保存视频的图像。
    注意:有些显微镜,可能会覆盖第一视频,如果它不保存启动第二成像序列之前。
  8. 保存的视频后,立即获取Z堆栈,使用步骤5.5中的参数。
  9. 共定位βAPP-paGFP与GALT-CFP(或其它高尔基标记物),如在步骤6中描述。
    注意:CFP光漂白剂迅速且由成像期间结束可能不可见。共定位可能无法与GALT-CFP。如果共定位是必需的,使用MRFP标记哥尔特。

6.囊泡过滤和共定位

  1. 使用一个分析程序 (例如了Imaris)以使隔室的表面 (如LAMP1-MRFP)和蛋白O-˚F 利益 (例如βAPP-paGFP)。
  2. 通过点击顶部菜单栏上的超越按钮,进入分析程序的“超越”部分。
  3. 在最左边的面板(左起 5按钮)的顶部选择曲面向导按钮。
  4. 选择一个频道来过滤囊泡( βAPP-paGFP荧光,感兴趣的蛋白质)。
  5. 通过提交大泡的直径在现场向导,然后按下一步进行背景扣除。分析程序自动选择 - 根据从最大囊泡在现场得到的阈值 - 在感兴趣的信道的区域。
    1. 手动调整阈值的背景,如果需要细化选择。
  6. 在阈值选择屏幕的底部,选中“拆分触摸对象”选项来分隔组合表面。
    注意:如果许多小泡紧密分组,GETHER,分析程序意愿组下一个表面上这些对象。
    1. 选择10-15代表性的囊泡,并计算出平均泡直径并输入到向导。
  7. 通过提高或降低对“质量”(在每个点的中部的通道的强度)的阈值缩小所选种子点。
    注:感兴趣的频道的表面将被创建。选定曲面的进一步细化可以在此时执行。基于在每个泡囊的像素数阈囊泡。
  8. 面膜使用这种表面原有的渠道。要屏蔽,请从左侧面创建向导(铅笔)第4选项卡。
  9. 选择“屏蔽所有”。与感兴趣的囊泡一个新的通道将被创建。
    注:在面膜的过程中,一个选项,复制原有的渠道提供。如果原始数据需要保存,请选择此选项。
  10. 重复小号TEPS 6.1至6.7的未经过滤的通道( LAMP1 MRFP,车厢)。
  11. 在顶部的工具栏,选择共定位工具。
    1. 在顶部面板中,作为信道被共定位直方图出现,选择最近创建的屏蔽频道。
    2. 选择所有可用的数据。有暗像素有时分析后存在。不要选择这些像素直方图,就会影响结果。
    3. 在最右侧的面板中,选择“生成Coloc通道”。这将创建一个只包含共定位像素的新渠道。的数据将在在'频道统计“按钮相同的面板。该数据可以导出为.csv文件。
    4. 使用“材料的共定位百分比”统计。这个选项考虑到对象的像素和尺寸的强度。

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Representative Results

典型结果表明βAPP离开TGN而显得流量迅速LAMP1(图1a b)。在光激活期间,囊泡可以看出出发往溶酶体图1b)高尔基。无抑制剂的治疗,paGFP荧光将在溶酶体可见的,而有光激活在TGN。停止光活化后,βAPP-paGFP迅速从溶酶体清零图1a比较 1b)。治疗与诺考达唑导致APP的GALT-CFP内的累积标记的隔室,并防止贩卖溶酶体图1c)。

APP的瑞典突变(染APPsw)通过10倍34增加β-切割速率。随着βAPPsw-paGFP快速裂解,在paGFP荧光出现在细胞质中弥漫的荧光信号。据推测,这我的S快速βAPP裂解γ分泌释放的C-末端paGFP到细胞质图2)的结果。在γ分泌酶抑制剂的存在下,βAPP溶酶体内积聚。

递送βAPP的溶酶体后,将paGFP荧光迅速清除。短停留时间可能贩卖从溶酶体到另一隔室的结果。相反地,βAPP由γ分泌酶裂解预期会导致从溶酶体膜图3a)paGFP荧光的扩散。漫荧光更难以通过共聚焦显微镜检测。以确定是否βAPP被传递到另一个隔室或清零,SN56细胞用针对γ分泌(L685,458)或碱化剂(氯喹)的特异性抑制剂。加入要么L685,458或氯喹导致APP积累在溶酶体( 荣>图3b c)。

人们普遍认为的APP被递送到细胞表面被内吞之前和在核内体加工和溶酶体35。然而,在我们的未经处理的细胞,细胞表面βAPP无法通过共聚焦显微镜检测。光激活βAPP可以不集中在细胞膜上的特定区域。相反,可以存在跨越质膜的大表面积漫射荧光。有趣的是,γ分泌酶抑制剂处理导致可检测的βAPP-paGFP在细胞表面图3b)。 γ分泌酶抑制剂治疗可路线更加βAPP到细胞表面,在除了抑制酶功能。因此,质膜的表面积大扩展paGFP在较大的区域并使得检测变得困难,尽管该蛋白质贩卖到隔室。

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图1.成像APP的贩卖溶酶体。SN56细胞用LAMP1-MRFP,GALT-CFP和βAPP-paGFP。a)本小区是准确的ROI内光激活放置在高尔基(投资回报表示由白圆圈)。细胞是替代地光激活并成像为15分钟,以确定βAPP-paGFP贩卖。插图显示贩运核周区域内高尔基体溶酶体。共定位的像素显示为黄色。b)含有 βAPP-paGFP溶酶体囊泡贩卖。黄像素表示LAMP1和βAPP-paGFP共存。C)SN56细胞成像防止βAPP-paGFP出口从TGN之前,诺考达唑治疗。代表性图像取自光激活期间结束。在右侧面板中,Z堆栈同一小区内的光激活后立即服用。钍 ËGALT-CFP一直假色红,以提高共同定位GALT-CFP和βAPP-paGFP的可视化。黄像素高尔特表示,CFP和βAPP-paGFP之间的共存。比例尺代表5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.贩运βAPPsw-paGFP。SN56细胞的转染LAMP1-MRFP,GALT-CFP和βAPPsw-paGFP(βAPP与家族瑞典突变)。瑞典突变增加了APP被切割的速度。细胞替代地内高尔基光激活和成像。漫荧光可以后paGFP从溶酶体膜分离的扩散进入细胞质中可以看出。比例尺条为5微米。53 / 53153fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.确定终端的细胞器。SN56细胞用LAMP1-MRFP,GALT-CFP和βAPP-paGFP。光激活后,随访另外45分钟的细胞。两个最左边的图显示了细胞光活化之前(最左边的)和后光活化(中)15分钟。上面板最右侧示出了APP的荧光后总成像在一个 )未处理, 二)γ分泌酶抑制剂45分钟处理, c)氯喹处理过的。箭头指向的APP共定位成像的45分钟后与LAMP1。比例尺代表5微米。 请点击此处查看次的放大版本是的身影。

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Discussion

该技术描述了精确的光激活膜蛋白标记paGFP在TGN想象以后的贩卖和切割。虽然paGFP创建十年前25,这是精确的光激活跟随新生蛋白质贩运到下游车厢的第一个例子。使用的APP-paGFP以往的研究构建光活化的细胞,其被认为是高尔基体11的周边区域的核。然而,在我们的显微照片,溶酶体,早期内涵体和晚期内涵体作为显然也可以在该区域图1和参考30)中找到。这些实验已在HEK293细胞,COS7细胞,神经元细胞SN56,SH-SY5Y细胞,和小鼠的神经元被成功地运行,尽管小鼠神经元的转染效率是低的。使用全长APP构建体和缩短构建体,其中包括的最后112个类似的实验已经进行APP的酸,与β-和γ-切割位点,融合到paGFP。缩短的构造更容易转染,并提供更高的荧光信号,并且这些示于附图。我们缩短的结构也缺乏N端胞外域,它具有不确定的分裂和分选信号38。尽管有这些N端信号和分歧,我们发现我们的缩短构造也有类似的定位和贩卖全长APP-paGFP 30,33。

因为许多细胞器在细胞的周围核区,尽一切努力确保光激活的准确性。在成像期间,细胞和高尔基会移动。因此,光激活的ROI必须小心地在光激活期间监测并调节以保持在高尔基的顶部。共聚焦显微镜在温度的微小变化很敏感。例如,AC或暖气通风口在microscoPE可能导致成像平面的变化。

为了保持实验之间的一致性,我们设置每个光激活/成像周期之间的时间延迟。需要时间来漂白感兴趣区和图像的细胞。取决于感兴趣区的细胞和数量的大小,时间进行漂白和采取一个图像会有所不同。为了保持从图像一致性图像,设置图像之间的时间延迟,所以每个图像,包括漂白,需要约30秒。增加的时间分辨率可以通过使用采用了光束整形器例如LSM5实时检测器)的检测系统来实现。这些显微镜可以形象以120帧/秒,分辨率没有损失。

以确认光激活的精度,就必须执行一个诺考达唑的控制。通过阻断转运出高尔基期间光激活,这确保了paGFP未被显著在其它车厢激活。CFP光致漂白剂迅速反复成像和漂白,可以使共存与高尔特-CFP困难。如果堆积paGFP荧光停留在高尔基区,这也可以指示准确光激活。或者,GALT可以具有标记MRFP,这是多种光稳定比CFP在这些实验中。

高尔基内改善活化也可以与一个多光子显微镜实现。虽然在这些实验中,共焦成像平面通常为1微米的切片,激光成像和光激活将穿过整个小区。一种多光子激光可用于这些实验中,并且可以提高精度在所有三个维度35。然而,如这里表现出来,传统的405nm的激光二极管是足够精确的TGN内光激活βAPP-paGFP。

作为对照,我们已经完成类似的实验为VSVG-paGFP荧光。 VSVG-paGFP,这是组成性递送至细胞表面27,37,是可视化传递到质膜30的特定子区域。这保证了运输到细胞内的区室不被触发过表达或paGFP标签的存在。

漫paGFP荧光可能难以通过共聚焦显微镜进行本地化。根据我们的经验,APP正在迅速裂解,似乎有一个短暂的一生为在溶酶体膜全长蛋白。这个问题是由瑞典的FAD突变加速的APP裂解34的速率恶化。为了采用这种技术用于迅速裂解蛋白质,抑制剂是至关重要的,以确定最后的下游隔室。 γ分泌的抑制作用L685,458或氯喹导致APP在溶酶体显著积累;即使采用瑞典突变。

如果太多的抑制剂的情况下,这可能导致细胞内的交流累积βAPP-paGFP的,并可能导致蛋白质的内含物。积累paGFP在夹杂物导致在细胞荧光paGFP夹杂物中的实验开始前(我们的未公开的观察结果, 处理过夜40μM的氯喹)。抑制剂浓度,防止感兴趣的蛋白质的切割,但不会导致夹杂物的形成,应使用。过转染细胞paGFP也会造成paGFP的明显的夹杂物,这将不发荧光的光激活。新光激活paGFP将优先流量这些夹杂物和干扰结果的解释。当寻找细胞图像,避免细胞具有明显的paGFP夹杂物。我们在与βAPP-paGFP的经验,有一个很微弱的绿色荧光细胞表达βAPP-paGFP在适当的水平。这微弱的荧光通常不能被成像,并且只能通过目镜看到。

(即质膜),该蛋白可能难以察觉。这可能是因为荧光信号,被散布在大面积上,稀释或因为在横截面中的膜轮廓是共焦显微镜的分辨率以下。有可能通过使用落射荧光显微镜成像规避这个问题。然而,这将降低显著该技术的空间分辨率。

这种技术的一个优点是它适用于其他膜蛋白。虽然这种技术依赖于在多个蛋白质的表达,似乎蛋白质转运未公开打乱,如已被证明与VSVG-paGFP和βAPP-paGFP 30。除了溶酶体,内体/溶酶体系统的其他标记物也已成功地使用。这些措施包括Rab5的-MRFP为早日结束osome和内Rab9-mchFP(樱桃荧光蛋白)为已故内涵体。这种功能强大的显微镜技术可以扩展到遵循从TGN其他蛋白质的贩卖。它可以同样地应用于按照提供良好定义的隔室的标记是可用的离散室之间贩卖。

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Disclosures

作者有没有竞争经济利益或利益冲突。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

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References

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