Photoactivatable GFP के साथ एपीपी के intracellular तस्करी इमेजिंग

1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University
Biology

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Summary

कोशिका की सतह प्रोटीन के परिवहन अपेक्षाकृत आसानी से अध्ययन किया है, वहीं इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की तस्करी visualizing और अधिक कठिन है। यहाँ, हम photoactivatable GFP को शामिल निर्माणों का उपयोग करें और सही ढंग से डाउन स्ट्रीम डिब्बों को गॉल्जी उपकरण से amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन का पालन करें और इसकी मंजूरी का पालन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन।

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Tam, J. H., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

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Abstract

बीटा amyloid (Aβ) अल्जाइमर रोग के मरीजों के दिमाग में पाया बूढ़ा सजीले टुकड़े के प्रमुख घटक है। Aβ β और γ-secretases द्वारा Amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) के अनुक्रमिक दरार से ली गई है। ई विकृति को Aβ के महत्व के बावजूद, इन चोली के subcellular स्थानीयकरण अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया है। हमारी प्रयोगशाला में काम करते हैं और दूसरों की कोशिका की सतह से internalization के बाद एप्लिकेशन प्रसंस्करण में endosomal / लाइसोसोमल सिस्टम फंसाना। हालांकि, एपीपी के intracellular की तस्करी अपेक्षाकृत understudied है।

सेल सतह प्रोटीन कई लेबलिंग तकनीक को सुधारने योग्य हैं, वहीं गॉल्जी से झिल्ली प्रोटीन की तस्करी निम्नलिखित के लिए कोई आसान तरीके हैं। यह अंत करने के लिए, हम सी टर्मिनस पर फोटो सक्रिय GFP (paGFP) के साथ टैग कर रहे थे कि एपीपी निर्माणों बनाया। संश्लेषण के बाद, paGFP कम बेसल प्रतिदीप्ति है, लेकिन यह 413 एनएम प्रकाश टी के साथ प्रेरित किया जा सकताओ एक मजबूत, स्थिर हरी प्रतिदीप्ति का उत्पादन। का उपयोग करके गॉल्जी मार्कर galactosyl ट्रांस्फ़्रेज़ एक लक्ष्य के रूप में सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Galt-सीएफपी) के लिए मिलकर, हम पार गॉल्जी नेटवर्क में सही photoactivate एपीपी करने में सक्षम हैं। यह fluorescently के साथ की पहचान बहाव के डिब्बों को traffics जल्दी इंडो सोम (Rab5), देर इंडो सोम (Rab9) और लाइसोसोम (LAMP1) के लिए डिब्बे मार्कर टैग प्रोटीन के रूप में फोटो सक्रिय एपीपी-paGFP तो पीछा किया जा सकता है। इसके अलावा, क्लोरोक्वीन या γ-secretase अवरोध करनेवाला L685, 458 सहित एपीपी प्रसंस्करण के लिए अवरोधकों का उपयोग करते हुए, हम एकल कक्षों में एपीपी के प्रसंस्करण की जांच के लिए पल्स-चेस प्रयोगों प्रदर्शन करने में सक्षम हैं।

हम app का एक बड़ा अंश कोशिका की सतह पर दिखने के बिना लाइसोसोम के लिए तेजी से चलता है, और उसके बाद secretase-जैसे चोली द्वारा लाइसोसोम से मंजूरी दे दी है कि लगता है। इस तकनीक fro intracellular प्रोटीन की तस्करी और प्रसंस्करण निम्नलिखित के लिए paGFP की उपयोगिता को दर्शाता हैबहाव के डिब्बों को गॉल्जी हूँ।

Introduction

अल्जाइमर रोग (ई) की बानगी बूढ़ा सजीले टुकड़े और मस्तिष्क में न्यूरोफ्रिब्रिल्लरी उलझनों (NFTs) की उपस्थिति है। बूढ़ा सजीले टुकड़े के प्रमुख घटक β-amyloid (Aβ) है। Aβ उसके अग्रदूत से प्राप्त होता है; amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) 1। एपीपी के amyloidogenic दरार β-secretase 2 से एपीपी से ectodomain को हटाने के साथ शुरू होता है। शेष 99-अवशेषों कार्बाक्सिल टर्मिनल टुकड़ा (CTF) Aβ 3-7 उत्पादन करने के लिए γ-secretase द्वारा cleaved जा सकता है। कई प्रयोगों endosomal / लाइसोसोमल प्रणाली में कोशिका की सतह से internalization के बाद कोशिका की सतह एपीपी की दरार दस्तावेज है, वहीं हाल ही के अध्ययन के एक नंबर एपीपी के intracellular तस्करी भी इसके प्रसंस्करण 8-11 विनियमित करने में महत्वपूर्ण है कि सुझाव दिया है।

Γ-secretase अवरोधकों और Aβ Immun साथ Aβ के स्तर को नियमन करने के प्रयास के एक नंबर दिया गया हैotherapies। हालांकि, इन उपचारों के साथ हाल ही में क्लिनिकल परीक्षण के कुछ मामलों में, नुकसान 12 के कारण होता है, कोई लाभ नहीं दिखाया है, और। Aβ उत्पादन व्यवस्थित करना एक unexploited रणनीति एपीपी के उप सेलुलर स्थानीयकरण और γ-secretase बातचीत को बदलने के लिए है। गॉल्जी, प्लाज्मा झिल्ली, और endosomes / लाइसोसोम सभी एप्लिकेशन की γ-दरार के लिए संभव स्थानों के रूप में सुझाव दिया गया है। हमारी प्रयोगशाला से अनुसंधान एपीपी और γ-secretase लाइसोसोमल झिल्ली 13 के निवासी प्रोटीन होते हैं कि पता चलता है। इसके अलावा, हम लाइसोसोमल γ-secretase एक अम्लीय इष्टतम पीएच 13 है कि मिल गया है। इसके अलावा, क्लोरोक्वीन या एनएच 4 सीएल साथ endosomal / लाइसोसोमल प्रणाली के क्षारीय, Aβ 14 के उत्पादन में कमी दर्ज की गई है। -γ secretase निषेध या पीटकर या Presenilin लाइसोसोम 15-17 में एपीपी-CTFs संचय की ओर जाता है। इसके अलावा, एपीपी endocytosis में खलल न डालें Aβ उत्पादन 18-20 को कम करती है।

नवजात प्रोटीन और endosomal / लाइसोसोमल सिस्टम से पुनर्नवीनीकरण प्रोटीन के लिए एक छँटाई स्टेशन के रूप में गॉल्जी के महत्व के बावजूद, एपीपी के intracellular की तस्करी विस्तार 21 में अध्ययन नहीं किया गया। हाल ही में काम एपीपी retromer परिसर के साथ बातचीत के माध्यम से पार गॉल्जी नेटवर्क (TGN) को साफ किया जा सकता है कि दिखाया गया है। Retromer परिसर के नीचे विनियमन Aβ उत्पादन 8,22-24 कम हो जाती है। हालांकि, गॉल्जी से एपीपी के निकास अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है।

ऐसे transferrin रिसेप्टर के रूप में सेल सतह प्रोटीन की endocytosis का पालन करते हुए, आसानी से लेबल और पीछा कर रहे हैं, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की तस्करी निम्नलिखित अधिक चुनौतीपूर्ण है। वास्तव में, कुछ प्रोटीन उनके intracellular की तस्करी imaged पड़ा है। ऐसे फोटो-सक्रिय-GFP (paGFP), के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के आगमन इंट्रासेल्युलर की तस्करी की जांच करने के लिए नए उपकरण उपलब्ध कराया गया है। फोटो-सक्रिय-GFP GF का एक रूप हैसंश्लेषण के बाद लगभग अदृश्य है, लेकिन 413 एनएम लेजर प्रकाश से सक्रिय होने के बाद मजबूत हरी (GFP) के प्रतिदीप्ति विकसित करता है और यह संकेत दिनों 25,26 के लिए स्थिर है कि पी। PaGFP का उपयोग करते हुए निर्माणों lysosomal प्रोटीन की intralysosomal की तस्करी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1) 25, vesicular stomatitis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (VSVG, स्रावी मार्ग के एक मार्कर), 27 की कोशिका की सतह से वितरण, और peroxisomes का कारोबार 28 और 29 autophagosomes।

जीवित कोशिकाओं में TGN से एपीपी की छंटाई कल्पना करने के क्रम में, हम सी टर्मिनल पर तस्वीर-सक्रिय (paGFP) के लिए मिलकर एपीपी के अंतिम 112 अमीनो एसिड व्यक्त प्लाज्मिड के लिए बनाया गया 30 (βAPP-paGFP के रूप में करने के लिए कहा गया है)। हम भी पूरी लंबाई एपीपी के साथ इन प्रयोगों का प्रदर्शन और इसी तरह के परिणाम प्राप्त कर ली है; यह उज्जवल चित्र प्रदान करता है क्योंकि ΒAPP का निर्माण यहां इस्तेमाल किया जाता है। हम तो तस्वीर सक्रिय &# 946; केवल TGN में एपीपी-paGFP, TGN मार्कर Galactosyltransferase (Galt) द्वारा सीमांकन के रूप में। एपीपी perinuclear क्षेत्र से तेजी से axonal एपीपी के परिवहन और निकासी कल्पना करने के लिए paGFP के साथ टैग किया गया है, यह एक सावधानी से परिभाषित डिब्बे से एक और 11,31,32 के लिए एपीपी की तस्करी का पहला प्रदर्शन है। यहाँ, हम सटीक TGN भीतर तस्वीर-सक्रियण और नीचे की ओर डिब्बों और लाइसोसोम 30 से बाद में दरार और निकासी में एपीपी के निकास प्रदर्शित करता है। गॉल्जी के भीतर सही तस्वीर-सक्रियण अन्य प्रोटीन प्रणालियों के लिए व्यापक रूप से लागू होता है।

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Protocol

1. सेल चढ़ाना और अभिकर्मक

  1. एक सेल संस्कृति हुड में, प्लेट ~ 300,000 से ~ 500,000 SN56 कोशिकाओं (डॉ जेन Rylett का एक तरह का उपहार) एक 35 मिमी गिलास नीचे कोंफोकल पकवान पर और (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, DMEM, साथ पूरक पूर्व अभिकर्मक मीडिया के साथ कवर 10% FBS)।
  2. पैदा करना एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: कोशिकाओं लगभग 50% अभिकर्मक पहले -70% मिला हुआ होना चाहिए।
  3. एक सेल संस्कृति हुड में, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त plasmids के साथ transfect कोशिकाओं, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन यहां डिब्बे मार्कर (, के साथ टैग लाइसोसोम जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1, LAMP1, टैग TGN मार्कर (Galt-सीएफपी सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए युग्मित galactosyl ट्रांस्फ़्रेज़) टैग किया mRFP), और paGFP (βAPP-paGFP के साथ टैग हित के प्रोटीन)। (इन निर्माणों में पहले 30 में वर्णित किया गया है)
  4. अभिकर्मक अभिकर्मक और प्लास्मिड डीएनए च के साथ कोशिकाओं को सेतेया एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा। सबसे अच्छा संतुलन cytotoxicity और अभिकर्मक दक्षता के लिए अभिकर्मक एजेंट के 5 μl (जैसे Lipofectamine 2000) के लिए डीएनए की ~ 2 ग्राम के अनुपात का प्रयोग करें। वास्तविक सांद्रता अलग plasmids के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। यहाँ वर्णित प्रयोगों में, 1 ग्राम βAPP-paGFP की / कोंफोकल पकवान, LAMP1-mRFP के 0.3 माइक्रोग्राम / कोंफोकल पकवान, और Galt-सीएफपी के 0.2 माइक्रोग्राम / कोंफोकल पकवान का उपयोग करें।
    नोट: इस्तेमाल किया प्लाज्मिड की राशि अभिकर्मक दक्षता पर निर्भर करेगा।
  5. न्यूरोनल सेल लाइनों के लिए: 1.4 चरण के बाद, एक सेल संस्कृति हुड में, पूर्व अभिकर्मक मीडिया को हटाने और 1 मिमी 24 घंटे के लिए चक्रीय एएमपी (dbcAMP) dibutyryl के साथ 0.1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 2 मिलीलीटर DMEM में SN56 कोशिकाओं को अलग।

2. माइक्रोस्कोप स्टेज तैयारी

  1. पूर्व गर्म फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS)। Imagi से पहले वार्म अप खुर्दबीन मंच37 डिग्री सेल्सियस के लिए एनजी।
  2. दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, भेदभाव मीडिया को हटाने और 37 डिग्री सेल्सियस पर HBSS के 2 मिलीलीटर के साथ बदलने के लिए। खुर्दबीन मंच पर जगह कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।
    नोट: प्रकोष्ठों HBSS में लगभग 1.5-2 घंटे के लिए व्यवहार्य हैं।
  3. कोंफोकल प्लेट तापमान खुर्दबीन मंच के साथ संतुलित करने के लिए 5-10 मिनट के लिए अनुमति दें।

गॉल्जी खत्म ROIs के 3. फोटो-सक्रियण

  1. माइक्रोस्कोप ऐपिस के साथ, Galt-सीएफपी, LAMP1-mRFP, और βAPP-paGFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं लगता है।
    1. उच्च वृद्धि (यानी 63X या 100x) के साथ एक तेल विसर्जन लेंस का प्रयोग करें। प्रतिदीप्ति के दृश्य रचना के लिए, और rhodamine (mRFP प्रतिदीप्ति के लिए) (सीएफपी और GFP प्रतिदीप्ति के लिए) FITC visualizing के लिए सक्षम सेट एक फिल्टर का उपयोग करें।
  2. 1 माइक्रोन के लिए प्रत्येक चैनल के लिए confocal टुकड़ा सेट करें। एक कम संकल्प छवि ले लो।
  3. छवि के लिए फसल केवल ब्याज की सेल।
  4. समायोजन घुंडी का उपयोग करना, मैन्युअल रूप से सेटसेल के बीच करने के फोकल हवाई जहाज़। यह आमतौर पर नाभिक सबसे बड़ा है, जहां सेल का हिस्सा है।
  5. TGN (Galt-सीएफपी प्रतिदीप्ति) के भीतर (ROIs) के हितों के 3-5 परिपत्र क्षेत्र ड्रा।
    1. (यानी जीस एल एस एम कार्यक्रम में) ROIs आकर्षित करने के लिए, कमांड कंसोल में 'संपादन आरओआई' बटन का चयन करें।
    2. परिपत्र रॉय के बटन का चयन करें।
    3. क्लिक करें और Galt-सीएफपी सेल के सकारात्मक क्षेत्रों पर खींचें।
      नोट: कई सूक्ष्मदर्शी के लिए तस्वीर विरंजन संकुल इस क्षमता है।
  6. मढ़ा ROIs के साथ सेल की एक छवि ले लो। बाद में संदर्भ के लिए ROIs की एक प्रतिलिपि सहेजें।
    1. छवि के लिए ROIs बचाने के लिए, 'मैक्रो' बटन का चयन करें।
    2. 'CopyRoisToOverlay' (: सी: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb फ़ाइल पथ) शुरू करने के लिए 'लोड' बटन दबाएं।
      नोट: 475-525 एनएम (सीएफपी) बैंड पास (बीपी), एक 500-530 एनएम बीपी (GFP) के साथ सुसज्जित एक confocal खुर्दबीन,और एक 560 एनएम लंबे पास (एलपी) फिल्टर सेट के लिए आवश्यक हैं। 458 एनएम और 488 एनएम उत्सर्जन और 540 एनएम उत्सर्जन के लिए एक HeNe लेजर के लिए एक आर्गन लेजर भी आवश्यक है।
  7. सेट अप एक ब्लीच समय पाठ्यक्रम के लिए माइक्रोस्कोप।
    1. अधिकतम शक्ति के लिए लेजर डायोड (25 मेगावाट 405 एनएम लेजर) की स्थापना की।
      सावधानी: अत्यधिक तस्वीर-सक्रियण सेलुलर झिल्ली के लिए फोटो विषाक्तता या नुकसान हो सकता है। रेटिना क्षति से बचने के लिए आंखों की सुरक्षा का प्रयोग करें।
    2. सेट-अप इमेजिंग के 120 चक्र के लिए माइक्रोस्कोप।
      ध्यान दें: एक इमेजिंग चक्र ROIs भीतर विरंजन और पूरे सेल की इमेजिंग के होते हैं। यह एक ब्लीच समय पाठ्यक्रम है।
    3. हर छवि के बाद 20-30 iterations के लिए केवल ROIs (फोटो-एक्टिवेट) ब्लीच करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। एक छवि अलग अलग होंगे छवि और ब्लीच करने के लिए समय है। प्रत्येक चक्र में लगभग 30 सेकंड है ताकि छवियों के बीच एक समय विलंब सेट करें।
      नोट: प्रत्येक चक्र की इमेजिंग भाग छवि आकार के आधार पर लगभग 15-30 सेकंड लेता है। प्रत्येक आरओ के लिए ब्लीचिंगमैं के बारे में 50 मिसे है। 20 पुनरावृत्तियों के लिए सभी 4 ROIs के ब्लीचिंग प्रत्येक ब्लीच / छवि चक्र के अंत में 4 सेकंड का समय लगेगा।
  8. ब्लीच समय पाठ्यक्रम शुरू करो।
  9. 15 मिनट (इमेजिंग और विरंजन के 30 चक्र) के बाद विरंजन बंद कर दें, लेकिन सेल की छवियों पर कब्जा जारी है।
    नोट: मिनट 'पल्स' की अवधि है 0-15 समय।
  10. ΒAPP-paGFP की निकासी का पालन करने के लिए, (विरंजन के बिना) 45 मिनट के लिए छवियों पर कब्जा जारी रखें।
    नोट: मिनट 'पीछा' की अवधि है 15 से 45 का समय।
  11. चरण 6 में वर्णित विश्लेषण विधि का प्रयोग, प्रत्येक चैनल के लिए सतहों बनाकर (यहाँ, LAMP1-mRFP) ब्याज की डिब्बे के साथ ब्याज (यहाँ, βAPP-paGFP) के प्रोटीन सह स्थानीय बनाना।

4. डाउनस्ट्रीम कम्पार्टमेंट का निर्धारण करें

  1. (इन प्रयोगों में) लाइसोसोम अंतिम डिब्बे हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए, प्रोटीन लाइसोसोम में जमा करने के लिए प्रेरित करने के लिए झिल्ली पारगम्य प्रोटीज अवरोधकों जोड़ें।
    1. ΒAPP के लिए, 0.5 माइक्रोन L685, 458 (विशिष्ट γ-secretase अवरोध करनेवाला) रातोंरात या इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन क्लोरोक्वीन (deacidifies लाइसोसोम) का उपयोग करें।
  2. 3.8 - 3.1 कदम के रूप में कोशिकाओं और photoactivate का पता लगाएं।
  3. ΒAPP-paGFP दरार के अभाव में जम जाता है, जहां छवि (तस्वीर-सक्रियण के बिना) एक अतिरिक्त 45 मिनट के लिए सेल का निर्धारण करने के लिए।
  4. चरण 6 में वर्णित विधि के अनुसार लाइसोसोम (या अन्य बहाव के डिब्बे) के लिए प्रोटीन के वितरण और बाद में मंजूरी के विश्लेषण करें।

5. गॉल्जी भीतर फोटो-सक्रियण की सटीकता सुनिश्चित

  1. 37 डिग्री सेल्सियस तक वार्म अप HBSS।
  2. हर कोंफोकल प्लेट HBSS में 66 माइक्रोन nocodazole (उपचार) या DMSO (नियंत्रण) की, imaged किया जा करने के लिए, एक 2 मिलीलीटर समाधान तैयार है।
    1. एक कोंफोकल प्लेट, पिपेट 2 37 डिग्री सेल्सियस HBSS के मिलीलीटर और एक 16.60 मिमी nocodazole स्टॉक से nocodazole की 7.96 μl जोड़ने के लिए।
    2. एक नियंत्रण के रूप में इतनीlution, पिपेट 2 2 मिलीलीटर ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस HBSS के मिलीग्राम और DMSO के 7.96 μl जोड़ें।
  3. इमेजिंग से पहले 5 मिनट के लिए nocodazole या DMSO के साथ HBSS में कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. 3.1 कदम के रूप में कोशिकाओं का पता लगाएं।
  5. Photoactivation इससे पहले, फोटो सक्रियण अवधि के बाद एक Z ढेर लेने के लिए माइक्रोस्कोप तैयार करते हैं।
    1. 'जेड ढेर' बटन पर क्लिक करें। फास्ट XY का उपयोग कर स्कैनिंग शुरू।
    2. सेल के शीर्ष करने के लिए माइक्रोस्कोप समायोजन दस्ता के साथ फोकल हवाई जहाज़ को समायोजित करें। प्रेस 'मार्क पहले' ढेर में पहले स्थान पर स्थापित करने के लिए।
    3. सेल के नीचे करने के लिए माइक्रोस्कोप समायोजन घुंडी (कांच के सबसे करीब) के साथ फोकल हवाई जहाज़ को समायोजित करें। प्रेस 'मार्क अंतिम' अनेकता में अंतिम स्थिति निर्धारित करने के लिए।
    4. जेड ढेर पैनल में, 'जेड सेक्शनिंग' बटन दबाएँ। 1 माइक्रोन के लिए 'अंतराल' सेट करें।
      एक उच्च स्थानिक संकल्प एक छोटे ढेर अंतराल ढेर के लिए है, लेकिन अधिक छवियों की आवश्यकता होगी: नोटढेर के लिए इमेजिंग अवधि लंबी लिया जाना।
  6. कदम 3.7-3.8 में वर्णित है, कोशिकाओं ब्लीच। 15 मिनट (30 फ्रेम) 0 मिनट से फोटो सक्रिय करने और छवि।
  7. 30 फ्रेम के बाद इमेजिंग बंद करो। इसके तत्काल बाद वीडियो की एक छवि बचाने के लिए।
    सावधानी: यह एक दूसरे इमेजिंग अनुक्रम शुरू करने से पहले सहेजा नहीं गया है तो कुछ सूक्ष्मदर्शी पहला वीडियो के ऊपर लिख सकता है।
  8. वीडियो सहेजने के बाद, तुरंत कदम 5.5 से मापदंडों का उपयोग कर, एक Z ढेर हासिल।
  9. चरण 6 में वर्णित है, Galt-सीएफपी (या अन्य गॉल्जी मार्कर) के साथ βAPP-paGFP सह स्थानीय बनाना।
    सीएफपी तेजी photobleaches और इमेजिंग अवधि के अंत तक दिखाई नहीं हो सकता: ध्यान दें। Colocalization Galt-सीएफपी के साथ संभव नहीं हो सकता है। Colocalization की आवश्यकता है, Galt टैग करने के लिए mRFP का उपयोग करें।

6. पुटिका छनन और Colocalization

  1. डिब्बे की सतहों (जैसे LAMP1-mRFP) और एक प्रोटीन ओ बनाने के लिए एक विश्लेषण कार्यक्रम (जैसे Imaris) का प्रयोग करेंच ब्याज (जैसे βAPP-paGFP)।
  2. शीर्ष मेनू पट्टी पर पार बटन पर क्लिक करके विश्लेषण कार्यक्रम की 'पार' अनुभाग दर्ज करें।
  3. सबसे बाईं पैनल (बाएं से 5 वीं बटन) के शीर्ष पर भूतल जादूगर बटन का चयन करें।
  4. पुटिकाओं (यानी βAPP-paGFP प्रतिदीप्ति, ब्याज की प्रोटीन) फिल्टर करने के लिए एक चैनल का चयन करें।
  5. अगले जादूगर और प्रेस करने के लिए क्षेत्र में सबसे बड़ा पुटिका के व्यास प्रस्तुत करके पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन करते हैं। विश्लेषण प्रोग्राम स्वचालित रूप से चयन करता है - हित के चैनल में एक क्षेत्र - क्षेत्र में सबसे बड़ा पुटिका से ली गई एक दहलीज पर आधारित है।
    1. मैन्युअल अगर जरूरत चयन को परिष्कृत करने के लिए सीमा पृष्ठभूमि समायोजित।
  6. थ्रेसहोल्ड चयन स्क्रीन के तल में, संयुक्त सतहों को अलग करने के लिए 'विभाजित छू वस्तुओं' विकल्प की जाँच करें।
    नोट: कई पुटिकाओं बारीकी को बांटा जाता है तोगेतेर एक सतह के नीचे इन वस्तुओं विश्लेषण कार्यक्रम होगा समूह।
    1. 10-15 प्रतिनिधि पुटिकाओं चुनें और औसत पुटिका व्यास की गणना और जादूगर में परिणाम दर्ज करें।
  7. बढ़ रही है या 'गुणवत्ता' (प्रत्येक स्थान के बीच में चैनल की तीव्रता) पर सीमा को कम करके चयनित बीज अंक परिष्कृत करें।
    नोट: ब्याज की चैनल की सतहों बनाया जाएगा। चयनित सतहों के आगे शोधन इस बिंदु पर किया जा सकता है। प्रत्येक पुटिका में बॉलीवुड की संख्या के आधार पर थ्रेसहोल्ड पुटिकाओं।
  8. इस सतह के साथ मूल चैनल मुखौटा। नकाब के लिए, सतह निर्माण विज़ार्ड (पेंसिल) में बाएं से 4 टैब का चयन करें।
  9. 'सभी मुखौटा' का चयन करें। ब्याज की पुटिकाओं के साथ एक नया चैनल बनाया जाएगा।
    नोट: मुखौटा प्रक्रिया के दौरान, मूल चैनल नकल करने के लिए एक विकल्प की पेशकश की है। मूल डेटा को बचाया जा करने की जरूरत है तो इस विकल्प का चयन करें।
  10. दोहराएँ रोंअनफ़िल्टर्ड चैनल (यानी LAMP1 mRFP, डिब्बे) के लिए 6.7 के माध्यम से TEPS 6.1।
  11. शीर्ष उपकरण पट्टी पर, colocalization उपकरण का चयन करें।
    1. शीर्ष पैनल में, colocalized जा करने के लिए चैनलों के histograms प्रकट रूप में, हाल ही में बनाया नकाबपोश चैनलों का चयन करें।
    2. उपलब्ध आंकड़ों के सभी का चयन करें। कभी कभी विश्लेषण के बाद मौजूद हैं कि अंधेरे पिक्सल रहे हैं। हिस्टोग्राम में इन पिक्सल का चयन न करें, वे परिणाम तिरछा जाएगा।
    3. अभी तक सही पैनल में, 'Coloc चैनल का निर्माण' का चयन करें। यह केवल colocalized पिक्सल युक्त एक नया चैनल बनाता है। डेटा 'चैनल के आंकड़े' बटन के तहत एक ही पैनल में होगा। डेटा एक .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है।
    4. 'सामग्री का प्रतिशत colocalized' आँकड़ा का प्रयोग करें। यह विकल्प खाते में वस्तु के पिक्सल और आकार की तीव्रता लेता है।

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Representative Results

ठेठ परिणाम βAPP (और चित्रा 1 ए ख) TGN जा रही है और तेजी से LAMP1 को यातायात के लिए प्रकट होता दिखा। तस्वीर-सक्रियण अवधि के दौरान, पुटिकाओं लाइसोसोम (चित्रा 1 बी) के लिए किस्मत गॉल्जी प्रस्थान देखा जा सकता है। TGN में तस्वीर सक्रियण है, जबकि अवरोध करनेवाला उपचार के बिना, paGFP प्रतिदीप्ति लाइसोसोम में दिखाई जाएगी। Photoactivation के रोकने के बाद, βAPP-paGFP तेजी से (1 बी को चित्रा 1 ए तुलना) लाइसोसोम से मंजूरी दे दी है। Nocodazole के साथ उपचार के डिब्बों लेबल Galt-सीएफपी भीतर एपीपी के संचय की ओर जाता है और लाइसोसोम (चित्रा -1 सी) के लिए अवैध व्यापार को रोकता है।

एपीपी के स्वीडिश उत्परिवर्तन (APPsw) 10 गुना 34 से β-दरार की दर बढ़ जाती है। ΒAPPsw-paGFP का तेजी से दरार के साथ, paGFP प्रतिदीप्ति cytosol में एक फैलाना प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में प्रकट होता है। मुमकिन है इस मैंएस कोशिका द्रव्य करने में सी टर्मिनल paGFP मुक्ति γ-secretase (चित्रा 2) द्वारा तेजी से βAPP दरार का नतीजा है। Γ-secretase अवरोध की उपस्थिति में, βAPP लाइसोसोम भीतर जम जाता है।

लाइसोसोम को βAPP की प्रसव के बाद, paGFP प्रतिदीप्ति तेजी से मंजूरी दे दी है। लघु निवास समय एक और डिब्बे में लाइसोसोम से तस्करी का नतीजा हो सकता है। इसके विपरीत, γ-secretase द्वारा βAPP की दरार लाइसोसोमल झिल्ली (चित्रा 3 ए) से paGFP प्रतिदीप्ति का प्रसार करने के लिए नेतृत्व की उम्मीद होगी। फैलाना प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाने के लिए और अधिक कठिन है। ΒAPP एक और डिब्बे के लिए दिया या मंजूरी दे दी है, यह निर्धारित करने के लिए, SN56 कोशिकाओं γ-secretase (L685, 458) या एक alkalinizing एजेंट (क्लोरोक्वीन) के खिलाफ एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया गया। या तो L685, 458 या क्लोरोक्वीन के अलावा लाइसोसोम में एपीपी संचय के परिणामस्वरूप ( रोंग> चित्रा 3 बी और सी)।

यह आमतौर पर एपीपी endocytosed जा रहा से पहले सेल सतह के लिए दिया और endosomes में कार्रवाई की और 35 लाइसोसोम है कि स्वीकार कर लिया जाता है। हालांकि, हमारे अनुपचारित कोशिकाओं में, सेल सतह βAPP confocal माइक्रोस्कोपी से नहीं पाया जा सकता है। फोटो-सक्रिय βAPP प्लाज्मा झिल्ली का एक विशिष्ट क्षेत्र में केंद्रित नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, प्लाज्मा झिल्ली के बड़े सतह क्षेत्र भर में फैलाना प्रतिदीप्ति हो सकता है। दिलचस्प बात यह है γ-secretase अवरोध करनेवाला उपचार कोशिका की सतह पर βAPP-paGFP detectable की ओर जाता है (चित्रा 3 बी)। γ-secretase अवरोध करनेवाला उपचार एंजाइम कार्य में बाधा के अलावा, कोशिका की सतह को βAPP मार्ग और अधिक हो सकता है। प्रोटीन डिब्बे में तस्करी की जाती है इसलिए, हालांकि प्लाज्मा झिल्ली के बड़े सतह क्षेत्र, एक बड़े क्षेत्र पर paGFP से फैलता है और पता लगाने के लिए मुश्किल बना देता है।

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लाइसोसोम के लिए एपीपी की तस्करी इमेजिंग चित्रा 1.। SN56 कोशिकाओं। LAMP1-mRFP, Galt-सीएफपी, और βAPP-paGFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे क) सेल सही रूप में सफेद हलकों से चिह्नित गॉल्जी (ROIs पर रखा ROIs भीतर फोटो सक्रिय हो गया था )। सेल वैकल्पिक तस्वीर सक्रिय और βAPP-paGFP की तस्करी का निर्धारण करने के लिए 15 मिनट के लिए उतारी थी। इनसेट गॉल्जी से लाइसोसोम को perinuclear क्षेत्र के भीतर अवैध व्यापार से पता चलता है। सह स्थानीय पिक्सल पीला। ख) लाइसोसोम को βAPP-paGFP युक्त एक पुटिका की तस्करी दिखाई देते हैं। पीला पिक्सल LAMP1 निरूपित और βAPP-paGFP colocalization। ग) SN56 कोशिकाओं TGN से βAPP-paGFP निकास को रोकने के लिए इमेजिंग से पहले nocodazole के साथ इलाज किया गया। एक प्रतिनिधि छवि फोटो सक्रियण की अवधि के अंत से लिया। सही पैनल में, एक ही सेल की एक Z ढेर तस्वीर-सक्रियता के बाद तुरंत लिया। गु ई Galt-सीएफपी colocalized Galt-सीएफपी और βAPP-paGFP के दृश्य में सुधार करने के लिए झूठी रंग लाल हो गया है। पीला पिक्सल Galt-सीएफपी और βAPP-paGFP बीच colocalization निरूपित। स्केल सलाखों 5 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
ΒAPPsw-paGFP। SN56 कोशिकाओं की चित्रा 2. तस्करी LAMP1-mRFP, Galt-सीएफपी और βAPPsw-paGFP (पारिवारिक स्वीडिश उत्परिवर्तन के साथ βAPP) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। स्वीडिश उत्परिवर्तन एपीपी cleaved है कि दर बढ़ जाती है। प्रकोष्ठों गॉल्जी तस्वीर सक्रिय और imaged भीतर वैकल्पिक रूप से थे। PaGFP कोशिका द्रव्य में फैलाना लाइसोसोमल झिल्ली से अलग होने के बाद एक फैलाना प्रतिदीप्ति देखा जा सकता है। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।53 / 53153fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. टर्मिनल organelle निर्धारण। SN56 कोशिकाओं LAMP1-mRFP, Galt-सीएफपी और βAPP-paGFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। तस्वीर-सक्रियण के बाद, कोशिकाओं एक अतिरिक्त 45 मिनट के लिए पीछा किया गया था। दो बाएं सबसे पैनलों कोशिकाओं photoactivation के पहले (बाएं सबसे) और photoactivation (मध्य) के बाद 15 मिनट दिखा। पर पैनल अभी तक सही एक) अनुपचारित, ख) γ-secretase अवरोध करनेवाला में कुल इमेजिंग के 45 मिनट में इलाज, या ग) क्लोरोक्वीन में इलाज के बाद एप्लिकेशन प्रतिदीप्ति पता चलता है। तीर एपीपी सह स्थानीय इमेजिंग के 45 मिनट के बाद LAMP1 के साथ करने के लिए इशारा करते हैं। स्केल सलाखों 5 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। वें में से एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

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Discussion

इस तकनीक को बाद में तस्करी और दरार कल्पना करने के लिए TGN में paGFP के साथ टैग झिल्ली प्रोटीन की सही तस्वीर-सक्रियण वर्णन करता है। PaGFP 25 एक दशक पहले बनाया गया था, वहीं इस बहाव के डिब्बों को नवजात प्रोटीन की तस्करी का पालन करने के लिए सही तस्वीर-सक्रियता का पहला उदाहरण है। एपीपी-paGFP का उपयोग कर पिछले अध्ययनों तस्वीर सक्रिय गॉल्जी 11 माना जाता था, जो सेल के एक पेरी परमाणु क्षेत्र निर्माण करती है। हालांकि, हमारे micrographs, लाइसोसोम, जल्दी endosomes, और देर endosomes में स्पष्ट रूप में भी इस क्षेत्र (चित्रा 1 और संदर्भ 30) में पाया जा सकता है। माउस न्यूरॉन्स की अभिकर्मक क्षमता कम है, हालांकि इन प्रयोगों, HEK293 कोशिकाओं, Cos7 कोशिकाओं, न्यूरोनल SN56 कोशिकाओं, एसएच SY5Y कोशिकाओं, और माउस न्यूरॉन्स में सफलतापूर्वक चलाया जा रहा है। इसी तरह के प्रयोगों पिछले 112 अमीनो शामिल हैं, जो पूरी लंबाई एपीपी निर्माणों और छोटा निर्माणों का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया हैएपीपी के एसिड, β- और γ-दरार साइटों के साथ, paGFP से जुड़े हुए। छोटा निर्माणों transfect और एक उच्च फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करने के लिए आसान कर रहे हैं, और इन साथ आंकड़े में दिखाया जाता है। हमारा छोटा निर्माणों भी अपरिभाषित चोली और छँटाई संकेतों 38 है जो एन टर्मिनल ectodomain, कमी है। इन एन टर्मिनल संकेतों और चोली के बावजूद, हम अपने को छोटा निर्माण एक पूर्ण लंबाई एपीपी-paGFP 30, 33 के रूप में इसी तरह के स्थानीयकरण और अवैध व्यापार है कि लगता है।

क्योंकि सेल के पेरी परमाणु क्षेत्र में कई अंगों की, हर प्रयास तस्वीर-सक्रियण की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए बनाया गया था। इमेजिंग अवधि के दौरान, सेल और Golgi कदम होगा। इसलिए, फोटो सक्रियण ROIs ध्यान से फोटो सक्रियण अवधि के दौरान निगरानी और Golgi के शीर्ष पर रहने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। Confocal सूक्ष्मदर्शी तापमान में छोटे परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं। Microsco से अधिक उदाहरण के लिए, एसी या हीटिंग झरोखोंपीई इमेजिंग विमान के एक बदलाव हो सकता है।

प्रयोगों के बीच सामंजस्य बनाए रखने के क्रम में, हम प्रत्येक तस्वीर-सक्रियण / इमेजिंग चक्र के बीच एक समय में देरी की स्थापना की। समय ROIs और छवि सेल ब्लीच करने के लिए आवश्यक है। ROIs के सेल और संख्या के आकार पर निर्भर करता है, समय ब्लीच और एक छवि अलग अलग होंगे लेने के लिए। छवि के लिए छवि से स्थिरता बनाए रखने के क्रम में, विरंजन सहित प्रत्येक छवि है, इसलिए छवियों के बीच एक समय में देरी सेट लगभग 30 सेकंड की आवश्यकता है। बढ़ी हुई अस्थायी समाधान एक किरण शेपर (जैसे LSM5 लाइव डिटेक्टर) कि रोजगार का पता लगाने प्रणालियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। दूसरे प्रस्ताव में कोई हानि के साथ 120 फ्रेम / पर ये सूक्ष्मदर्शी छवि कर सकते हैं।

तस्वीर-सक्रियण की सटीकता की पुष्टि करने के लिए, यह एक nocodazole नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। तस्वीर-सक्रियण के दौरान गॉल्जी से बाहर परिवहन अवरुद्ध करके, इस paGFP काफी अन्य डिब्बों में सक्रिय नहीं किया जा रहा है कि यह सुनिश्चित करता है।सीएफपी फोटो विरंजकों तेजी के साथ इमेजिंग और विरंजन दोहराया और मुश्किल Galt-सीएफपी साथ colocalization बना सकते हैं। PaGFP प्रतिदीप्ति के थोक गॉल्जी क्षेत्र में रहता है, तो यह भी सही तस्वीर-सक्रियण संकेत कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, Galt अधिक तस्वीर-स्थिर सीएफपी से इन प्रयोगों में है जो mRFP, साथ टैग किया जा सकता।

गॉल्जी भीतर सुधार हुआ सक्रियण भी एक बहु फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इन प्रयोगों में confocal इमेजिंग विमान आम तौर पर एक 1 माइक्रोन टुकड़ा, पूरे सेल के माध्यम से पारित होगा इमेजिंग और फोटो सक्रियण के लिए लेजर है। एक बहु फोटॉन लेजर इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और सभी तीन आयामों 35 में सटीकता में सुधार हो सकता है। यहां प्रदर्शन किया लेकिन, जैसा कि एक पारंपरिक 405 एनएम लेजर डायोड सही रूप TGN भीतर βAPP-paGFP तस्वीर-सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है।

एक नियंत्रण के रूप में, हम VSVG-paGFP प्रतिदीप्ति के लिए इसी तरह के प्रयोगों का प्रदर्शन किया है। है जो VSVG-paGFP,अनिवार्यता से प्लाज्मा झिल्ली 30 के विशिष्ट उपक्षेत्र के लिए दिया जा रहा कल्पना की गई थी, कोशिका की सतह 27,37 के लिए दिया। इस intracellular डिब्बों को परिवहन के द्वारा ट्रिगर नहीं है भरोसा दिलाते हैं कि अधिक अभिव्यक्ति या paGFP टैग की उपस्थिति।

फैलाना paGFP प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थानीयकरण करने के लिए मुश्किल हो सकता है। हमारे अनुभव में, एपीपी तेजी से चिपके रहते हैं और लाइसोसोमल झिल्ली पर एक पूर्ण लंबाई प्रोटीन के रूप में एक छोटे से जीवन भर के लिए प्रकट होता है। यह समस्या एपीपी दरार 34 की दर को तेज करता है कि स्वीडिश धुनी उत्परिवर्तन द्वारा exacerbated है। तेजी से चिपके रहते प्रोटीन के लिए तकनीक को रोजगार के लिए, एक अवरोध करनेवाला अंतिम बहाव के डिब्बे निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। L685, 458 या लाइसोसोम में एपीपी के महत्वपूर्ण संचय करने के लिए क्लोरोक्वीन नेतृत्व द्वारा γ-secretase का निषेध; यहां तक ​​कि स्वीडिश उत्परिवर्तन के साथ।

बहुत ज्यादा अवरोध करनेवाला प्रयोग किया जाता है, तो यह इंट्रासेल्युलर एसी के लिए ले जा सकता हैβAPP-paGFP की cumulation, और प्रोटीन समावेशन को जन्म दे सकती है। प्रयोग शुरू कर दिया है इससे पहले सेल में फ्लोरोसेंट paGFP समावेशन में समावेशन परिणामों में paGFP संचित (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों, 40 माइक्रोन क्लोरोक्वीन के साथ रात भर इलाज आईई)। ब्याज की प्रोटीन की दरार से बचाता है, लेकिन शामिल किए जाने के गठन के लिए नेतृत्व नहीं करता है कि एक अवरोध करनेवाला एकाग्रता इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ओवर-अभिकर्मक paGFP के साथ कोशिकाओं के भी फोटो सक्रियण के बिना प्रतिदीप्ति जाएगा जो paGFP के स्पष्ट समावेशन, पैदा कर सकता है। नवनियुक्त तस्वीर सक्रिय paGFP अधिमान्यतया इन समावेशन के लिए यातायात और परिणाम की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप करेगा। छवि के लिए कोशिकाओं की तलाश में, स्पष्ट paGFP समावेशन के साथ कोशिकाओं से बचें। ΒAPP-paGFP के साथ हमारे अनुभव में, उचित स्तर पर βAPP-paGFP व्यक्त कि कोशिकाओं में एक बहुत ही बेहोश हरी प्रतिदीप्ति है। यह बेहोश प्रतिदीप्ति आम तौर पर imaged नहीं किया जा सकता है और केवल ऐपिस के माध्यम से देखा जा सकता है।

(यानी प्लाज्मा झिल्ली) को तस्करी कि प्रोटीन का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है। यह फ्लोरोसेंट संकेत, एक बड़े क्षेत्र में फैल रहा है, क्योंकि पतला या पार अनुभाग में झिल्ली प्रोफ़ाइल confocal खुर्दबीन के संकल्प के नीचे है, क्योंकि हो सकता है। यह एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग इमेजिंग द्वारा इस समस्या को दरकिनार करने के लिए संभव हो सकता है। बहरहाल, यह काफी तकनीक के स्थानिक संकल्प कम हो जाएगा।

इस तकनीक का एक लाभ यह अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए लागू है। इस तकनीक के कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति से अधिक पर निर्भर करता है, यह VSVG-paGFP और βAPP-paGFP 30 के साथ प्रदर्शन किया गया है के रूप में प्रोटीन की तस्करी खुलकर, बाधित नहीं है कि प्रतीत होता है। लाइसोसोम के अलावा, endosomal / लाइसोसोमल प्रणाली के अन्य मार्करों भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। ये जल्दी अंत के लिए rab5-mRFP शामिलosome और देर अतः इसके लिए rab9-mchFP (चेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन)। इस शक्तिशाली माइक्रोस्कोपी तकनीक TGN से अन्य प्रोटीन की तस्करी का पालन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। यह भी उतना ही अच्छी तरह से परिभाषित डिब्बे मार्कर उपलब्ध हैं प्रदान की असतत डिब्बों के बीच अवैध व्यापार का पालन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के संघर्ष है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

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References

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