Uso del análisis confocal de

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Este protocolo describe un método para visualizar ligandos distribuidos a través de un campo de células. La facilidad de expresar proteínas exógenas, junto con el gran tamaño de sus células en embriones tempranos, hacen de Xenopus laevis un modelo útil para la visualización de ligandos GFP-etiquetados. MRNAs sintéticos se traducen de manera eficiente después de la inyección en las primeras etapas de embriones de Xenopus, y las inyecciones pueden ser dirigidos a una sola célula. Cuando se combina con un trazador de linaje tales como membrana atado RFP, la célula inyectada (y sus descendientes) que están produciendo la proteína sobreexpresada fácilmente pueden ser seguidos. Este protocolo describe un método para la producción de etiquetado con fluorescencia Wnt y Shh ligandos de mRNA inyectado. Los métodos implican la micro disección de los explantes ectodérmicas (CAPS animales) y el análisis de la difusión ligando en múltiples muestras. Mediante el uso de formación de imágenes confocal, información sobre la secreción de ligando y la difusión sobre un campo de células se puede obtener. Los análisis estadísticos de imágenes confocal proporcionan datos cuantitativos sobre la forma de gradientes ligando. Estos métodos pueden ser útiles para los investigadores que quieran probar los efectos de los factores que pueden regular la forma de gradientes morfógeno.

Introduction

Durante el desarrollo embrionario temprano, las células se comprometen progresivamente para seguir linajes específicos de diferenciación: esto significa un grupo de totipotente (o pluripotentes) las células se restringen gradualmente a establecer poblaciones de células progenitoras determinadas para dar lugar a un tipo de célula. Señalización de las células de la célula es fundamental para la regulación de la especificación de linaje durante el desarrollo embrionario. Se requerirá la manipulación de estas señales para dirigir las células madre hacia destinos específicos para apoyar tratamientos médicos nuevos.

Un número relativamente pequeño de las vías de señalización se reiteró durante el desarrollo, incluyendo las vías que responden a la superfamilia de TGF (Nodals y BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnts 4, 5 y erizos. Estas proteínas secretadas se unen a receptores presentes en la membrana celular para activar la transducción de señales alterando de este modo la expresión génica y / o comportamiento de la célula. La regulación estricta de la señal celularAlling es esencial para la especificación de linaje celular y el desarrollo normal. Mientras que la cruz de hablar entre estas vías es importante en la determinación del destino celular, un solo ligando puede suscitar en sí respuestas distintas a diferentes concentraciones. Gradientes morphogen fueron descritos hace más de 100 años como una teoría para explicar cómo los diferentes tipos de células pueden derivar de un campo de 6 células. Señalización moléculas producidas por un grupo de células puede difundir durante un cierto rango, la disminución en la concentración con una mayor distancia de la fuente. Las células expuestas a la señal responderán a la concentración local en su posición en el campo de las células, con las células en las posiciones distintas de responder de manera diferente a los diferentes niveles de la señal. La evidencia de la existencia de morfógenos proviene de estudios en el embrión de Drosophila 7 y el disco de ala 8, así como la extremidad de vertebrados 9 y 10 del tubo neural.

Se necesitan métodos envestigate cómo gradientes morfógeno se estableció e identificar otras moléculas importantes en la regulación de estos gradientes. Elegantes experimentos utilizando inmunohistoquímica para visualizar proteínas endógenas in vivo en el contexto de diferentes orígenes genéticos se han utilizado para investigar los gradientes de morfogenes 11-12. Sin embargo, los buenos anticuerpos y mutantes específicos no siempre están disponibles, por lo que se describe aquí un protocolo mediante la sobreexpresión de ligandos fluorescentes en Xenopus, para proporcionar una alternativa, método sencillo para diseccionar cómo los productos de genes exógenos pueden influir en la distribución de ligandos a través de un campo de las células. Xenopus laevis ofrece un excelente sistema para llevar a cabo este tipo de experimentos que sus embriones se desarrollan externamente por lo que son accesibles en las primeras etapas. Su gran tamaño (1-1.5mm de diámetro) simplifica la microinyección y manipulación quirúrgica y por blástula etapas las células son fáciles de imagen, ya que todavía son relativamente grandes (alrededor de 2081; m de ancho). Estudios de sobreexpresión en Xenopus son fáciles de hacer: ARNm inyectados en el embrión temprano pueden ser dirigidos a células particulares y se traduce de manera eficiente.

Las construcciones Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP fluorescencia etiquetados se generaron utilizando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 y eGFP. El péptido HA es importante incluir, no sólo para proporcionar una etiqueta molecular adicional, pero también porque se cree que actúa como un espaciador que separa las proteínas Wnt y eGFP permitiendo que ambos productos génicos para funcionar. La construcción utilizada para la visualización de Shh fue utilizado anteriormente para generar un ratón transgénico que expresa una proteína de fusión Shh-eGFP 15; este fue proporcionado amablemente por Andy McMahon. Es importante destacar que la etiqueta GFP para todos los constructos se clona 3 'a la secuencia señal de tal manera que se retiene después de procesar. También es esencial para asegurar que la proteína final incluye secuencias requeridas para modificaciones, tales el addition de los lípidos como es el caso de Shh y Wnt ligands.The ADNc se subclonaron en el vector pCS2 + expresión que está optimizado para la produción de ARNm sintético; que incluye un promotor SP6 y la señal de poliadenilación (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

El trabajo que se describe aquí proporciona un protocolo simple para comparar la secreción y la difusión de fluorescencia etiquetada Wnt y Shh etiquetados ligandos. Mediante la inyección de cantidades definidas de mRNA sintético, el protocolo circunnavega cualquier problema asociado con la expresión variable a partir de diferentes vectores usando diferentes promotores. Estos métodos se han aplicado recientemente a investigar los efectos de la endosulfatase heparán sulfato SULF1 en Shh-eGFP y Wnt8a / secreción Wnt11b-HA-eGFP y difusión en Xenopus, 16-17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ética declaración: Los experimentos con animales se realizaron bajo una licencia oficina del Reino Unido Inicio de MEP y los experimentos llevados a cabo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de York, en el cumplimiento de la LLEGADA (Animal Investigación: Reporte de experimentos in vivo) directrices. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Estrategia para generar fluorescencia Tagged ligandos

A continuación se muestra un protocolo de ejemplo para la subclonación Wnt8a-HA y eGFP en pCS2, a fin de producir la fusión en el marco construir WNTA-HA-eGFP:

  1. Configurar y ejecutar las reacciones de PCR para Wnt8a-HA y eGFP. Utilice la información cebador que se muestra en Tabla1 y la reacción PCR Ejemplo y el Ejemplo de PCR condiciones mostradas en la Tabla 2. Nota: El ADN molde puede variar dependiendo de la construcción que se producen, en este ejemplo, Wnt8a-HA se utiliza como plantilla de ADN.
  2. Limpie las reacciones de PCR utilizando un kit de extracción de gel, lleve a cabo la elución final en 30μl de agua de grado molecular.
  3. Comprobación 2 l de producto de PCR en un gel de agarosa al 1% preparado en TAE.
  4. Productos eGFP PCR Digesto Wnt8a-HA y pCS2 y utilizando las enzimas de restricción apropiadas (ver Tabla 1), creado reacciones como se describe en la Tabla 2 (producto Ejemplo PCR digerido).
  5. Incubar reacciones durante 3 horas a 37 ° C y luego almacenar productos Wnt8a-HA y las buenas prácticas agrarias de PCR en hielo.
  6. Añadir 1μl de fosfatasa intestinal de ternero alcalina (CAIP) para pCS2 compendio e incubar durante 6 minutos a 37 ° C.
  7. Heat inactivar CAIP por incubación durante 15 min a 65 ° C.
  8. Run pCS2 y PCR digiere en un gel de agarosa ultrapura 1% preparado en TAE.
  9. Extracto de gel y limpiar productos pCS2 y PCR utilizando un kit de extracción de gel, llevan a cabo la elución final en 30μl de agua de grado molecular.
  10. Configurar la ligadura tal como se describe en la Tabla 2 (Ejemplo T4 ligadura) y se incuba a 12 ° C durante 16 hr.

2. ARNm Síntesis: Generación de la Templat

  1. Producir plantillas usando la digestión con enzimas de restricción de los plásmidos siguientes (todas en el vector de expresión pCS2): membrana Cerulean (memCerulean), membrana de RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Establecer restricción digiere como se describe en la Tabla 2 (Ejemplo de plantilla digerir).
    2. Mezclar suavemente e incubar las reacciones de 2 horas a 37 ° C.
  2. Ejecutar 2,5 l de plásmido digerido en un gel de agarosa al 1% (TAE) para comprobar que la reacción ha cortado hasta su finalización.
  3. Limpie las digestiones utilizando un kit de extracción de gel, lleve a cabo la elución final en 50 l de agua de grado molecular.

3. ARNm Síntesis: Transcripción in vitro

  1. Sintetizar ARNm funcionales utilizando el kit de transcripción SP6 ARNm. Montar las reacciones en 1,5 ml ADNasa / ARNasa tubos de microcentrífuga gratuita.
  2. Establecer reacciones ARNm de transcripción como se describe en la Tabla 2 (Ejemplo de síntesis de ARNm).
  3. Mezclar elreacciones suavemente con una pipeta y luego se incuba a 37 ° C durante 4 hr.
  4. Comprobación 1 l de la reacción sobre un gel de agarosa al 2% (TAE).
  5. Añadir 1 l de ADNasa a la reacción, la mezcla suavemente con un P20 y se incuba la reacción durante otros 15 min a 37 ° C.
  6. Añadir 340 l de agua de grado molecular, 40 l de acetato de amonio y 400 l de fenol-cloroformo a la reacción. Vortex las reacciones durante 30 segundos.
  7. Haga girar el ARNm durante 5 min, 14,000 × g, 4 ° C.
  8. Pipetear la capa superior (acuosa) de cada reacción de moverlo a un nuevo máximo de 1,5 ml tornillo tubo de microcentrífuga gorra.
  9. Añadir un volumen igual de cloroformo para cada una de las reacciones decantó. Vortex las muestras durante 30 segundos.
  10. Haga girar el ARNm durante 5 min, 14,000 × g, 4 ° C
  11. Pipetear la capa acuosa superior de cada reacción de moverlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresca tapón de rosca.
  12. Añadir un volumen igual de isopropanol a cada una de las reacciones y precipitar el mRNA a -80 ° C durante 30 min.
  13. Girar cada una de las reacciones durante 15 min a 14.000 xg, 4 ° C para sedimentar el ARNm
  14. Eliminar el sobrenadante con cuidado de no perturbar el ARNm peletizado
  15. Añadir 200 l de etanol al 70% a cada una de las reacciones, mezclar las reacciones y luego girar durante 10 minutos a 14.000 xg, 4 ° C.
  16. Eliminar el etanol teniendo cuidado de no perturbar el ARNm, secar el sedimento a temperatura ambiente usando un desecador de vacío o Speed-Vac.
  17. Vuelva a suspender el ARNm de 10-20 l de agua de grado molecular. Haga girar brevemente y mantener las muestras en hielo. Nota: El calentamiento de la muestra a 80 ° C durante 1 min puede ayudar a que se disuelva.
  18. Ejecutar 1μl de ARNm en un gel de agarosa al 2% (TAE) y analizar de 1,2 l en un espectrofotómetro para obtener una lectura precisa de la concentración.
    PASO CRÍTICO: Se requiere una concentración de 400 ng / l de ARNm sintético para llevar a cabo los siguientes experimentos.

    PASO CRÍTICO: Si la relación 260/280 esfuera del rango de 2,00 a 2,20, o la cantidad total de ARNm por encima de 12 mg, llevar a cabo una precipitación con cloruro de litio.
  19. Tienda mRNA en 1 alícuotas a -80 ° C. Use alícuotas y luego tirar a la basura; No vuelva a congelar ARNm.

4. Generación de Xenopus laevis embriones

  1. Primer Xenopus laevis hembras mediante inyección subcutánea con 50 unidades de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG; Chorulon) una semana antes del experimento.
  2. Inducir Xenopus laevis mujeres la noche antes del experimento mediante la inyección de 250 unidades de HCG y su incubación en la oscuridad, O / N a 19 ° C.
  3. Diseccionar testículos de rana macho eutanasia y almacenar en 1xNAM a 4 ° C. NOTA: rana masculina es eutanasia por la anestesia de terminales de conformidad con el Anexo 1 de Animales (Procedimientos Científicos) Ley 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Femenina Masaje Xenopus laevis para inducir la ovulación, recoger el lahuevos id en un 55 mm de diámetro placa de Petri y vuelta.
  5. Producir una suspensión de esperma por aplastamiento ¼ de un testículo Xenopus laevis en 1 ml de agua desionizada.
  6. Cepillo Xenopus ovocitos con la suspensión de esperma aplastado con una pipeta y pipeta de bulbo Pasteur PASO CRÍTICO:. Realizar reacciones fertilización aproximadamente a las 4:30 pm en el día de la prueba.
  7. Embriones Cultura a 21 ° C en NAM / 10 (ver Tabla 3 para soluciones) en 55 mm placas de Petri recubiertas de agarosa al 1% diluido en agua (agua).
  8. Embriones De-jalea después de 45 min utilizando cisteína / HCL (Tabla 3). Nota: A 21 ° C, los embriones se llega a la etapa 2 de células después de 90 min y se unirá cada 20 min después de eso.

5. microinyección de embriones de Xenopus

  1. Usando 1 X capilares de vidrio de 90 mm y una de doble etapa micropipeta de vidrio tirador Narishige PC-10, tire micropipetas para inyectables. Ajustar la configuración empíricamente para lograr una punta fina (Diame menos de una micrater).
  2. Adjunte una micropipeta (aguja) a un microinyector de gas (por ejemplo, el de Harvard Appartaus PLI-100 PICO-inyector) para entregar en repetidas ocasiones volúmenes precisos de líquido mediante la aplicación de una presión regulada por un período establecido de tiempo digital. Ajustar la presión neumática para suministrar un volumen de 1,25 a 10 nanolitros según se determina usando una retícula o calibración de diapositivas.
  3. Escudo una placa de Petri de 55 mm con 5 ml de 1% de agarosa (agua). Corte un cuadrado 35-35 mm de agarosa fuera del plato, esto proporcionará una superficie estable para microinyectar embriones.
  4. Embriones transferir a NAM / 3 + Ficoll (Tabla 3) y mover al plato de la inyección.
  5. Inyectar embriones en el hemisferio animales una vez que alcanzan la etapa necesaria para el experimento.
    1. Para analizar la distribución de ligandos etiquetados GFP en la superficie celular, inyectar los embriones bi-lateralmente en la etapa de dos células, 10nl por célula. Ejemplo diluciones de ARNm se muestran a continuación para Wnt8a-HA-eGFP. PASO CRÍTICO: Asegúrese de que todas las concentraciones de ARNm starte en 400 ng / l.
      Nota: La cantidad de mRNA a inyectar debe determinarse empíricamente ensayando concentraciones y encontrar la cantidad mínima necesaria para visualizar el ligando fluorescente. Transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-HA es un paso esencial para determinar que los ARNm se traducen a niveles similares a fin de permitir la comparación de dos ligandos etiquetados con fluorescencia diferentes; hemos hecho esto por Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP en Fellgett et al., 2015.
      Nota: Al evaluar el efecto de una inyección de ARNm (tal como uno que codifica para un regulador candidato), un control típico es inyectar un ARN no activo, tal como LacZ, en embriones de hermanos con el fin de controlar los posibles efectos de la adicional transcripciones en el embrión.
      1. Diluir memRFP mRNA 1 en 4 (1μl + 3μl dH 2 O) con agua de grado molecular para reducir la concentración de 100 ng / l.
      2. Diluir Wnt8a HA-eGFP-mRNA 1 en 4 (1μl + 3μl dH2 O) con agua de grado molecular para reducir la concentración de 100 ng / l.
      3. Mezclar memRFP ARNm en una relación 1: 1 con Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. Mezclar ARNm a partir 5.5.1.3 en una proporción de 1: 1, ya sea con el control de ARNm LacZ o un modulador tal como SULF1.
      5. Inyectar embriones bilateralmente en la etapa de 2 células con 10nl de mRNA por célula (total de 20NL). Nota: Esto se traduce en 250 pg de RFP m em, 250 pg de Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg de Wnt11b-HA- e GFP y 2 ng de LacZ o SULF1 ARNm que se inyecta en cada celda.
    2. Para analizar la difusión de GFP etiquetada ligandos, inyectar ARNm que codifica ligando-GFP junto con un marcador de linaje tales como memRFP en la fase de 16-32 celular, 1,25 nl por célula.
    3. Para analizar los efectos de cualquier modulador potencial de la difusión ligando, co-inyectar ARNm que codifica para el modulador junto con el ligando y el linaje trazador. Alternativamente, se inyectan células vecinas: una con los ARNm que codifican la ligan-GFP etiquetadod y un trazador de linaje (memRFP) y el otro con mRNAs que codifican para el modulador y un trazador de linaje diferente (memCerulean).
  6. Embriones de transferencia a una incubadora y la cultura 12.5 ° hasta el día siguiente, Nieuwkoop y Faber (NF) Etapa 8.

6. extirpando animales Cap explantes

  1. Embriones transferencia a un 55 mm placas de Petri recubiertas con 5 ml de agarosa al 1% (agua). Llene el plato con NAM / 2 (Tabla 3).
  2. Tome las tapas animales circulares con agujas de tungsteno PASO CRÍTICO:. Tomar gran capitalización en esta etapa ya que se curan mejor y sean más fáciles de imagen, mantenga las tapas de control para asegurar que no se produce la extensión convergente.
  3. Traslado explantes animales a 55 mm placas de Petri recubiertas de agarosa al 1% (agua) y embriones de cultivo a 21 ° C durante 4 horas PASO CRÍTICO:. Se requiere que la incubación de 4 horas para permitir que las proteínas fluorescentes para madurar.
  4. Generar las diapositivas de socorro por pegar a dos capas de PVC insulation cinta en portaobjetos de microscopio. Cortar unos 14 mm por 10 mm rectángulo de la cinta para dejar una cámara para el montaje de las tapas animales PASO CRÍTICO:. Acoplar dos capas de cinta a fondo sobre el portaobjetos antes de cortar el rectángulo.
  5. Pipetear 2 gotas separadas de NAM / 2 (Tabla 3) en la diapositiva relieve, de aproximadamente 30 l por gota.
  6. Transferencia explantes animales a las diapositivas de socorro usando una punta de corte P20 y orientar de manera que el lado apical orientada hacia arriba. Nota: Cada diapositiva puede contener 10-15 tapas animales PASO CRÍTICO:. En esta etapa, las tapas de los animales deberían haber sanado parcialmente, esto significa que son menos delicados y pueden ser orientados con unas pinzas.
  7. Baje suavemente una hoja de cubierta de vidrio sobre el portaobjetos de alivio y deje que la hoja de la cubierta se seque durante 20 minutos PASO CRÍTICO: El tamaño de la tapa de los animales es crucial;. asegurar la tapa es lo suficientemente grande que cuando el cubreobjetos de vidrio se baja sobre el portaobjetos alivio que comprime la capa apical de las células animales tapa lo suficiente para produce una superficie plana para la imagen. Si las tapas de los animales son demasiado pequeños siguen a continuación, reducir la cinta de PVC de una sola capa.
  8. Selle la diapositiva con barniz de uñas PASO CRÍTICO:. No utilice demasiada laca de uñas para sellar las diapositivas de alivio ya que si la cinta de PVC se vuelve demasiado húmedo se levantará y arruinar la diapositiva.
  9. Diapositivas relieve en seco durante 20 minutos en la oscuridad y que están listos para la imagen, por lo general las tapas animales permanecerán sanos durante 4-6 horas, una vez sellada en la diapositiva.

7. Imaging

Nota: Imaging se llevó a cabo utilizando un microscopio confocal invertido. Modo Lambda fue elegido para la imagen ya que esto permite múltiples fluoróforos con las firmas que se utilizarán superposición, y se elimina el problema del potencial de movimiento de la muestra entre las exploraciones.

  1. Buscar explantes utilizando un objetivo de menor aumento y luego cambiar a 63x / 1,4 objetivo de aceite para obtener imágenes de mayor resolución.
  2. Encienda el láser necesarios; Para este ejemplo el 405láser se utilizó para excitar memCerulean, se utilizó el láser 488 para excitar GFP y el láser 561 para excitar memRFP usando 405 y 488/561 espejos dicroicos.
  3. Utilice el modo lambda (En 2011, el modo de lambda seleccione Zen - 32 contenedores).
  4. Seleccione el 405 nm, 488 nm y 561nm lasers.To permitir un campo de visión más amplio, alejar la imagen (a 0.6x).
  5. Ajuste el tamaño del marco con el tamaño de imagen deseado (1024 x 1024 con tamaños de píxel de 220 nm se utilizó para este conjunto de datos).
  6. Establecer un promedio de 4 a típicamente a 8 para aumentar la relación señal a ruido.
  7. Optimizar la (unidad 1 aireado según el láser 561nm se utilizó para este conjunto de datos) estenopeica.
  8. Optimizar los poderes láser PASO CRÍTICO:. Balance de los 405nm, 488nm y 561nm láseres tales que todos los fluoróforos se pueden detectar utilizando la matriz 32 detector de tiempo que se minimiza la cantidad de voltaje y la ganancia requerida.
  9. Recoger el ser de luz emitida desde memCerulean, GFP y memRFP. Por esta luz de trabajo se recogió cada ~10 nm de 415-720nm, aunque intervalos de recogida más grandes también son posibles (por ejemplo., Cada ~ 20 nm).

Análisis 8. Imagen

  1. La investigación de los efectos de los moduladores de la expresión en la superficie celular de ligandos GFP-etiquetados
    NOTA: Los siguientes pasos son una guía detallada de cómo se llevó a cabo el análisis en nuestro laboratorio. El usuario final puede querer hacer más eficiente el proceso escribiendo un guión ImageJ o FIJI para eliminar algunos de los pasos manuales.
    PASO CRÍTICO: Es importante las muestras de usuario final los espectros de los fluoróforos utilizados en las mismas condiciones que el último experimento se lleva a cabo con el fin de Perf orm desmezcla espectral efectiva de las múltiples fluoróforos utilizados en el experimento final.
    Existen dos tipos principales de análisis se llevan a cabo en esta sección:
    1. Cálculo del número total de Wnt-HA-eGFP pixeles co-Localising con la membrana celular.
      1. Unmix el verde,canales rojo y azul zafiro utilizando espectros muestreados de inyecciones únicas de estos fluoróforos en el software ZEN. Guarde estas imágenes como documentos LSM separadas para su uso en todos los siguientes pasos.
      2. Abrir LSM archivos directamente en el software de edición de imágenes. Nota: Las siguientes instrucciones son para FIJI Imagen J.
      3. Guarde las imágenes LSM como documentos de secuencia de imagen, esta se dividirá automáticamente las imágenes en los canales separados.
      4. Guarde la secuencia de imágenes en la misma carpeta que los guiones para el software de análisis de secuencia de comandos que se van a utilizar para analizar los datos (ver archivos de código suplementarios para la escritura real). Nota: Las siguientes instrucciones son para Matlab.
      5. Abre el software de análisis de secuencia de comandos y abrir el directorio en el que los guiones se escriben.
      6. Introduzca el nombre del archivo que se analiza la ubicación, el software tomará el nombre de archivo y realizar el análisis.
        Nota: Los nombres de archivo leerán ImageA0000 y ImageA0001 para cada image. El software de análisis de secuencia de comandos utilizar la imagen marcada 0001 como la máscara y analizar el porcentaje de píxeles en la imagen 0000 que co-localizar con esta máscara.
      7. Tome el número porcentaje de co-localización (anotado como membrana celular poblado) y copiar esto a una hoja de cálculo. Nota: Las siguientes instrucciones son para Excel.
      8. Trazar el número porcentaje co-localización en un gráfico de barras, ya sea como un valor absoluto o relativo.
    2. Analizando el número, el tamaño y la forma de Wnt-HA-eGFP puntos lagrimales.
      1. Abrir LSM sin mezclar archivos directamente en el software de edición de imágenes. Nota: las siguientes instrucciones son para FIJI Imagen J.
      2. Dividir cada imagen en sus canales separados (Imagen> Color> canales Split).
      3. Umbral tanto la Wnt-HA-eGFP y los canales de marcadores de membrana (Imagen> Ajuste> Auto-umbral) PASO CRÍTICO:. Pruebe con un número de umbrales para ver cuál produce una imagen representativa, sin la sobreexposiciónel canal.
      4. Convertir el canal marcador de membrana a una máscara (Proceso> Binary> Crear máscara).
      5. Invertir esta máscara (Edición> Invertir).
      6. Convertir los puntos lagrimales Wnt-HA-eGFP a una máscara como anteriormente.
      7. Reste la máscara marcador de membrana de la máscara ligando-GFP (Proceso> calculadora Imagen> máscara Wnt en tapa de la caja, la máscara de membrana en el cuadro de abajo).
      8. Utilice la función de partículas analizar. Desde aquí, seleccione los parámetros necesarios y analizar los datos (partículas Analyse> Analizar).
      9. Copia el número de partículas, tamaño medio de las partículas y los datos de circularidad en una hoja de cálculo y luego trazar gráficos a partir de estos datos. Nota: Para este análisis, sólo entre partículas se analizaron 0.1-10μm 2 tamaño, no se impusieron restricciones a la circularidad de las partículas. Esta instrucción es para Excel.
  2. El análisis de la gama de la difusión ligando
    1. Abre todas las imágenes sin mezclar en im confocalenvejecimiento de software y luego exportar los archivos en un formato TIF, como datos en bruto y como una imagen RGB Nota:.. Esta instrucción es para Zen Lite 2011 PASO CRÍTICO: Incluye una barra de escala en al menos una de las imágenes para que la distancia puede ser calculado durante el análisis.
    2. Abra las imágenes para ser analizadas en el software de análisis de imágenes. Nota: Las siguientes instrucciones son para Photoshop 8.2.3) Haga clic derecho en el fondo de la imagen y seleccionar "capa de fondo ', para crear una nueva capa..
    3. Establecer los canales de marcadores de membrana a 0, por lo que sólo el canal ligando-GFP es visible (Capa> Nueva capa de ajuste> Mezclador de canales) PASO CRÍTICO:. Clip de la nueva capa de ajuste a la imagen que se está analizando, la opción de clip de la nueva capa que esta imagen está disponible como una casilla de verificación después de hacer clic en la opción de mezclador de canales.
    4. Abrir un nuevo espacio de trabajo. Ajuste la resolución de 300 píxeles por pulgada y el modo de color al color RGB (Archivo>Nuevo> Portapapeles).
    5. Copia todas las imágenes que se analiza en el único espacio de trabajo (click en la imagen y se recorta mezclador de canales mediante la celebración de control a continuación, mantenga el control y la tecla Alt y arrastre la imagen en el espacio de trabajo).
    6. Orientar todas las imágenes de modo que la longitud máxima de difusión para cada imagen puede medirse a lo largo del eje horizontal, con las células que expresan Wnt-HA-eGFP orientado hacia la izquierda.
    7. Guarde el espacio de trabajo como TIF y luego abrir este en el software de análisis de imágenes. Nota: Las siguientes instrucciones son para FIJI Imagen J.
    8. Abra la ventana del administrador de retorno de la inversión (Analizar> Herramientas> Gestor de retorno de la inversión).
    9. Dibujar un rectángulo en la primera imagen, el tamaño exacto del rectángulo se puede especificar (Seleccionar herramienta rectángulo y dibujar cualquier rectángulo> Editar> Cambios> Especificar). Nota: un tamaño de 650 x 100 píxeles longitud x anchura se utilizó en este estudio.
    10. Coloque el rectángulo en el borde mismo del dominio expresando Wnt-HA-eGFP. Coloque el rectángulo sobre la región con la distancia máxima de difusión Wnt-HA-eGFP. PASO CRÍTICO: Incluso sin el marcador de membrana de las regiones que expresan Wnt-HA- e GFP debe ser visible debido a la fluorescencia de fondo; si no entonces consultar imágenes en bruto.
    11. Cambie la caja de 10 M a la derecha. Determinar el número de micrómetros midiendo la longitud de la barra de escala incluido en una de las imágenes (Dibuja una línea trazar la barra de escala> Análisis> escala establecida). Nota: Esto proporciona un valor para 10 uM en píxeles.
    12. Añadir la casilla a la gerente de ROI pulsando el botón Agregar en la ventana de gestor de retorno de la inversión.
    13. Mover rectángulo a la siguiente imagen para medirse haciendo clic de nuevo en la herramienta de rectángulo para mover el rectángulo. Repita los pasos 8.2.10-11.
    14. Una vez que todos los paneles se han medido, seleccione multiplot en el menú administrador de retorno de la inversión (ROI gerente> Más> G. múltiple> Lista).
      Nota: los datos representan inte píxeles Wntnsity (Y) al aumentar la distancia a lo largo del eje horizontal (X, medida en píxeles). El valor de Y es la intensidad media de la señal de ligando-GFP en el punto X y el promedio se calcula a partir de todos los píxeles en el eje Y para cada valor de X. En consecuencia, el más alto de la caja, se analizarán las más píxeles para producir este promedio. Una pequeña caja (en el eje Y) será más ruidoso; una caja de altura tendrá intensidad de píxel promedio muy bajo.
    15. Copie los datos del cuadro de gráficos múltiples en una hoja de cálculo y re-etiqueta en consecuencia. Nota: Las siguientes instrucciones son para Excel.
    16. Desechar la primera 10-20μm de los datos de cada análisis, ya que representa la fluorescencia de fondo a partir de células que expresan el ligando-GFP y distorsiona los gráficos.
    17. Abre el análisis y la representación gráfica de software científico y crear un nuevo cuaderno. Nota: Las siguientes instrucciones son para Sigmaplot 13.
    18. Marque el número requerido de columnas para los datos haciendo doble clic sobre los números horizontales on la hoja de trabajo y etiquetarlos distancia en m, Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Copie los datos de la hoja de cálculo en las columnas relevantes en el análisis y la representación gráfica de software científico.
    20. Crear un gráfico de dispersión (Crear gráfico> Scatter> dispersión múltiple> Seleccione X muchos Y> Seleccione la columna de la distancia para X> Seleccione Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP para los valores de Y> Finalizar).
    21. Realizar un análisis de regresión de la curva Wnt8a-HA-eGFP haciendo clic izquierdo en un punto Wnt8a-HA-eGFP en el gráfico de dispersión. Todos los puntos deben resaltar. Haga clic en Análisis> Asistente de regresión.
    22. Seleccione la categoría ecuación de la curva (decaimiento exponencial) y el nombre de la ecuación (individual, 3 parámetros) a continuación, pulse siguiente.
    23. Seleccione los valores de X e Y a la que debe instalarse la curva (si los datos se destacó anteriormente, esto se debe hacer de forma automática) a continuación, pulse siguiente.
    24. Continúe con el asistente hasta que la opción de salida NuméricoLa página de s, garantizar "Crear informe" está marcada a continuación, pulse siguiente. Nota: Los parámetros de la curva ajustada se le aparecen en el Informe 1 *.
    25. En la página de opciones de gráficos garantizar "añadir ecuación para graficar título 'está marcada a continuación, pulse el final. Nota: El asistente habrá creado Informe 1 * y Gráfico 1 * pestañas en la parte superior del cuaderno. Además se han añadido la curva de la gráfica producida en (2.8.20).
    26. Repita los pasos 8.2.21-8.2.25 para ajustar una curva para Wnt11b-HA-eGFP PASO CRÍTICO:. Tratar de ajuste múltiples categorías de ecuaciones y los nombres de la ecuación a los datos. Nota: La curva con el mejor ajuste debe producir el mayor valor R 2 con la suma residual de cuadrados más bajo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Confocal análisis de los explantes animales tapa expresar proteínas etiquetadas con fluorescencia proporciona un sistema eficaz para la visualización de la distribución ligando bajo diferentes condiciones experimentales. En un ejemplo, la distribución de GFP etiquetada Shh se muestra (Figura 1). En la etapa de 2 células, embriones de Xenopus se inyectan en ambas células con ya sea con un ARNm de control o con el ARNm que codifica para SULF1, una enzima que modifica el heparán sulfato de la superficie celular e influye en el gradiente de morfógeno Shh 16. Estos embriones se cultivan hasta la etapa de 32 celdas y una sola célula es co-inyectados con ARNm que codifica para Shh-GFP y memRFP (como un trazador de linaje). Esto crea un clon de células que expresan Shh-GFP que está marcado con la membrana celular RFP atado. En la fase de blástula, animales tapa explantes se toman para el análisis por microscopía confocal. La Figura 1 muestra que bajo condiciones de control, Shh-GFP se secreta y se difunde fuera de la reregión expresar los mRNAs inyectados. Sin embargo, en la presencia de SULF1, Shh-GFP es más restringida en su distribución y, en esta muestra, no se detecta fuera del clon de células que lo producen. Los efectos de SULF1 sobre la distribución Shh-GFP se ha analizado más a fondo 16.

Cuando se expresa en embriones de Xenopus, marcado con fluorescencia ligandos Wnt son secretadas, se acumulan en la membrana celular, y difundir a través del campo de las células. En la Figura 2, caracterizamos las propiedades quantitaive y cualitativos de los dos diferentes fluorecently etiquetada ligandos Wnt en células inyectadas y expresar las proteínas. Figura 2A-H muestra ejemplos de cómo Wnt8a y Wnt11b-HA-eGFP se acumulan en la membrana de las células animales tapa . Mediante la comparación de los paneles 2B y 2F está claro que Wnt8a-HA-eGFP se acumula de manera más eficiente en la membrana celular de Wnt11b-HA-eGFP. La información cuantitativa se ha extraído de las imágenes confocal utilizando un comcombinación de imagen y software de análisis de secuencia de comandos (archivo de código suplementario). Figura 2I muestra la acumulación relativa de Wnt8a-HA-eGFP en la membrana celular en comparación con Wnt11b-HA-eGFP. Los datos se obtuvieron usando una secuencia de comandos del ordenador que determina el número total de Wnt-HA-eGFP pixeles co-Localising con los pixeles de la membrana celular en cada imagen. En otro enfoque, el número total de Wnt-HA-eGFP puntos lagrimales que co-localizar con la membrana celular se cuentan usando software de análisis de imagen (Figura 2J). La información cualitativa sobre el tamaño y la forma de puntos lagrimales individuo también puede ser extraído de los datos utilizando el software de análisis de imagen. Además de menos Wnt11b-HA-eGFP puntos lagrimales co-localización de con la membrana celular (Figura 2J) estos puntos lagrimales también tienen un tamaño medio menor que Wnt8a-HA-eGFP puntos lagrimales (Figura 2C). Por otra parte, puntos lagrimales Wnt11b-HA-EGFP tienen una circularidad reducido en comparación con Wnt8a-HA-eGFP puntos lagrimales (Figura 2L). Circularity es una medida de cómo de cerca un objeto se asemeja a un círculo perfecto, con 1 se representa un círculo perfecto y 0.1 una forma no circular alargada. Este enfoque puede ser utilizado para probar cualquier regulador candidato de la difusión ligando Wnt. Para ello, las células de control deben ser inyectados con una mRNA control de codificación para una forma inactiva del regulador candidato o una proteína irrelevante tal como la beta-galactosidasa (lacZ); esto proporciona un control más válido que simplemente no inyectar el regulador. Los datos de estos ejemplos se analizó mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney 18-19. Un programa de análisis estadístico se utilizó para realizar la prueba.

En la figura 3, se investiga la difusión ligando Wnt. Un solo blastómero se inyectó en la fase de 4-célula de manera que los explantes animales tapa representan un campo de células en las que sólo algunas células expresan ya sea Wnt8a-HA-eGFP o Wnt11b-HA-eGFP. Al incluir un trazador linaje celular, podemos identificar expressing frente a las células que no expresan y esto permite que la gama de Wnt8a-HA-eGFP y difusión ligando Wnt11b-HA-eGFP lejos de las celdas de origen para ser analizados (Figura 3B y 3C). Debido a la curvatura de los explantes animales tapa, la distancia máxima que puede ser medido de forma fiable utilizando este ensayo fue 160μm, que no era suficiente para medir la distancia absoluta de difusión ligando. Sin embargo, mediante el uso de una combinación de análisis confocal, análisis de imágenes y análisis científico y software de graficación la forma general del gradiente morfógeno Wnt-HA-eGFP podría ser analizado (Figura 3D). Estos datos se puede utilizar para investigar si la sobreexpresión de otra proteína junto con los ligandos marcados en las mismas células puede afectar a la secreción de Wnt o difusión. En otro tipo de experimento (Figura 3E-3J) los efectos de un regulador de potencial en la recepción de células se puede medir por la sobreexpresión de la proteína candidato en clones de células adyacentes a las células expresionando Wnt8a o Wnt11b-HA-eGFP. Esto permite que los efectos no-celulares-autónoma del regulador de la difusión ligando Wnt-HA-eGFP para ser examinados. De acuerdo con la Figura 2, más Wnt8a-HA-eGFP se puede detectar la difusión de distancia a partir de células que Wnt11b-HA-eGFP en ambos experimentos de difusión.

Los tipos de experimentos descritos en este documento se han utilizado para analizar el efecto de SULF1 de Shh y Wnt de señalización 16,17.

Figura 1
Figura 1. Modulación de la distribución de Shh-GFP se puede detectar por análisis confocal de polos animales de Xenopus. (A) Un dibujo animado que representa ensayo experimental donde embriones son primero inyectados con ARNm que codifica para SULF1 o un ARNm control, los mismos embriones son después inyectadas en la fase de 32 células con el ARNm que codifica para Shh-GFP en una sola celda. (BC) explante tapa del Animals fueron tomadas en la etapa 8 y la imagen después de 4 horas. Las imágenes se muestran en el borde de un clon que expresa Shh-GFP + memRFP de las células. En los embriones de control (B), Shh-GFP se distribuye fuera de la memRFP marcada clon de células productoras de señal. En los embriones que expresan SULF1 (C), Shh-GFP es más restringido en su distribución, véase 16. memRFP se muestra en magenta y Shh-GFP en verde. Las barras de escala representan 20 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. cuantitativa y análisis cualitativo de Wnt8a y Wnt11b-HA-eGFP puntos lagrimales en la membrana celular. (AH) Los embriones fueron microinyectó bilateralmente con ARNm que codifica memRFP (500 pg) en el hemisferio animal en la etapa de dos células. Además embriones fueron inyectados con mR Codificación NA (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 pg) o [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1 ng). Los embriones también fueron inyectados con mRNA de codificación para LacZ para proporcionar un control para el ARNm / proteína adicional al analizar los efectos de cualquier regulador de potencial. Los cuadros blancos en (C) y (G) marcan las áreas ampliadas en los paneles (D) y (H), respectivamente. La cantidad total de Wnt-HA-eGFP fluorescencia co-localización de con la membrana celular se calculó utilizando la imagen y software de análisis de secuencia de comandos y luego normalizada (I). La información cualitativa fue extraído por medio de software de análisis de imágenes. Wnt8a y Wnt11b-HA-eGFP punctae se analizaron para el número de partículas (J), tamaño de partícula (K) y la circularidad de las partículas (L). Mann-Whitney (** p <0,01), N = número de embriones. memRFP se muestra en magenta y Wnt8a / 11b-HA-GFP se muestra en verde, barras de escala representan 20μm.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Medición de la gama de difusión de fluorescentemente etiquetado ligandos Wnt. (A) Diagrama que representa el ensayo utilizado para medir la secreción y la difusión Wnt8a y Wnt11b-HA-eGFP lejos de las células que expresan. (BC) de codificación de mRNA (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) y Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) o (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) y Wnt11b-HA-eGFP (2 ng ) se inyectó en el hemisferio animales de un solo blastómero en la etapa de cuatro células. (D) El rango de difusión de Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP se midió a través de un fondo de control. (E) Diagrama que representa el ensayo utilizado para medir la difusión Wnt8a y Wnt11b-HA-eGFP través de un fondo que expresa LacZ, vea método para det aflige. (FG) ARNm que codifica memCerulean (600 pg) y (F y H) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) o (G e I) Wnt11b-HA-eGFP se inyectó en el hemisferio animales de un solo blastómero en el Four etapa de célula. Un blastómeros adyacente fue inyectado con ARNm que codifica memRFP (600 pg) y LacZ (4 ng) ver Key para obtener más información. (J) La gama de Wnt8a-HA-eGFP y difusión Wnt11b-HA-eGFP se midió a través de un fondo que expresa LacZ. Los datos se cuantificó y se representa mediante el análisis confocal, análisis de imágenes y análisis científico y software de gráficos. memCerulean (azul (CD) y amarillo (F y H)), Wnt-HA-eGFP (verde), memRFP (magenta), barras de escala representan 20 micras. Por favor haga clic aquí para descargar una versión más grande de este archivo.

archivos / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>

Tabla 1. Los cebadores usados ​​para subclonar Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP y Shh-GFP en pCS2.

Reacción Componentes
Ejemplo CS2 + digest 1,5 g de pCS2 +
2 l de la enzima de restricción 1
2 l de la enzima de restricción 2
5 l de tampón de enzima de restricción (10x)
Hecho de hasta 50 l con agua de grado molecular
Ejemplo de síntesis de ARNm 2 l plantilla linealizado
2 l 10x mezcla trx Megascript
2 l 50 mM ATP
2 l 50 mM CTP
2 l 50 mM UTP
2 l 5 mM GTP
2.5 l 40 mM Cap analógico (m7G (5 ')
2 l mezcla de enzima SP6
Agua de grado molecular 3,5 l
Ejemplo de reacción PCR 0,5 l de ADN polimerasa de alta fidelidad (2.000 unidades / ml)
ADN Plantilla 2 ng
2,5 l de adelante y atrás primers (10μM)
0.5l de dNTPs
5 l de tampón de ploymerase ADN (10x)
Hecho de hasta 50 l con agua de grado molecular
Condiciones Ejemplo de PCR Intial desnaturalización 2 min a 98 ° C
15 seg 98 ° C
15 seg 65 ° C 30 ciclos
40 seg 72 ° C
Extensión final de 10 min a 72 ° C
Ejemplo PCR producto de digestión 28 l de producto de PCR
2 l de restricción enzyme 1
2 l de la enzima de restricción 2
5 l de tampón de enzima de restricción (10x)
Agua de grado molecular 13 l
Ejemplo T4 ligadura 1 l Cortar CS2 +
3 l Cortar PCR producto 1
3 l Cortar PCR producto 2
1 l de ADN ligasa de T4
1 l tampón de ligasa de ADN T4 (10X)
Agua de grado molecular 1 l
Ejemplo de plantilla digerir ADN 5 ug plásmido
10 tampón de la enzima de restricción l (10X)
3 l Not1 (excepto Shh-GFP, Kpn1 se utiliza)
Hecho de hasta 100 l con agua de grado molecular

Tabla 2. Ejemplo condiciones de reacción utilizadas para la subclonación y la producción de mRNA sintético para Wnt8a-HA-eGFP.

<td>
Solución Componentes
La cisteína-HCl 0,1X NAM
2,5% de monohidrato de hidrocloruro de L-cisteína (pH 7,8)
Sales de NAM 110 mM NaCl
2 mM KCl
1 mM de Ca (NO3) 2
EDTA 0,1 mM
NAM / 2 Sales de 0,5X NAM
5 mM HEPES pH 7,4
0,25 mM Bicarbonato
25 ug / ml de gentamicina
NAM / 3 + Ficoll Sales 0.33x NAM
5 mM HEPES pH 7,4
0,25 mM Bicarbonato
2 5 ug / ml de gentamicina
5% de Ficoll
NAM / 10 Sales de 0,1X NAM
5 mM HEPES pH 7,4
25 ug / ml de gentamicina

Tabla 3. Soluciones utilizados durante la producción y la microinyección de Xenopus laevis embriones.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Una parte esencial de este protocolo es la generación de ligandos biológicamente activos que normalmente se procesan, secretadas, y capaces de provocar una respuesta en la célula receptora, a pesar de tener un resto fluorescente adjunto. Es fundamental para establecer que el producto del gen fluorescente de etiquetado es biológicamente activa mediante un ensayo apropiado. Para Shh-GFP, la capacidad de activar la expresión de ptc1 se confirmó 16. Wnt8a tiene una capacidad notablemente potente para inducir un eje secundario cuando se expresa en un solo blastómero ventral 20-21 y Wnt8a-HA-eGFP se demostró retener esta actividad biológica. Wnt11b inhibe activina tratados explantes ectodérmicas de someterse extensión convergente 21 a 22, y Wnt11b-HA-eGFP también conserva su actividad biológica 17. La capacidad de los ligandos etiquetados para provocar respuestas equivalentes a las proteínas sin etiquetar sugiere que las conclusiones basadas en experimentos utilizando los ligandos fluorescentes Will Be relevante a la proteína normal. La adición del epítopo HA entre el ligando y la proteína fluorescente proporciona una región espaciadora que permite que el Wnt construye para ser a la vez activo y fluorescente.

La principal limitación de este tipo de análisis es que no informa directamente sobre gradientes de morfógenos endógenos. Por ejemplo, la difusión de Shh a través del campo de células en casquillo animal puede no reflejar el camino mueve Shh endógenos a través del epitelio columnar neural en el embrión. Sin embargo, la simplicidad de este protocolo permite experimentos donde el efecto de los reguladores exógenos sobre la distribución de ligandos puede ser probado. Los resultados de estos enfoques pueden ser la base de las hipótesis que se prueba utilizando más exigentes en los análisis in vivo. Por ejemplo, la capacidad de sobre-expresado SULF1 para restringir la distribución de Shh-GFP usando los métodos descritos en este documento señaló el potencial para SULF1 en la modulación del morfógeno grad Shhient. Esto fue probado directamente y validada usando antisentido morfolino knock-down de SULF1 e inmunocitoquímica para visualizar endógena Shh en el tubo neural 16. Un método similar a la nuestra se ha utilizado para investigar los mecanismos específicos que podrían regular la difusión ligando. Smith y colegas demostraron que un nodal-GFP etiquetada (Xnr2) utiliza difusión simple, y no teléfonos extensiones (cytonemes) o transcitosis (utilizando vesículas) para formar un gradiente de 23.

Son posibles otras elaboraciones de estos métodos, donde otras proteínas que bloquean las vías particulares se pueden expresar en células diana para investigar si se necesita una respuesta a la molécula de señalización como intermediario para retransmitir señales de una célula a otra. Por ejemplo, la activina que expresa un receptor negativo dominante entre la fuente de activina y las células que responden mostró que la difusión ligando simple podría provocar una respuesta varios diámetros celulares de distancia de la fuente de correoncluso con células que no responden en el medio 24. Esta conclusión se apoya en el trabajo en el pez cebra donde las células de tipo salvaje pueden responder a una fuente de nodal, a pesar de estar rodeado de células mutantes que no responden que carecen de un co-receptor esencial para ganglionar 25. Otros estudios han utilizado el pez cebra para investigar la difusión de ligandos marcados con fluorescencia 28,29. Algunos estudios han observado ese epítopo etiquetado de la C-terminal de las proteínas Wnt puede tener un impacto sobre la actividad de señalización, posiblemente debido a las cisteínas altamente conservadas que contribuyen a la conformación de la proteína. Nuestro trabajo previo ha demostrado que la inclusión de un espaciador (tal como la etiqueta HA) resulta en ligandos Wnt etiquetados que son biológicamente activo 17. Esto es probablemente debido a que el espaciador proporciona flexibilidad necesaria para la interacción ligando receptor, como en el modelo de pulgar-índice de Wnt-Frz de unión 30.

El siguiente paso para avanzar en nuestros estudios es incluir a visUAL lectura para la activación de la vía de señalización. Por ejemplo, expresando a medir GFP-etiquetados Dvl 26 en las células distantes de la fuente de ligando permitirá el rango a través del cual Wnt11b tiene capacidad para señalar. El rango de actividad de señalización Wnt8a podría demostrar usando tinción de anticuerpos para medir la localización nuclear de b-catenina en las células 27 a una distancia de la fuente. Son posibles este tipo de experimentos utilizando las técnicas descritas en este documento. Mediante el empleo de una variedad de diferentes proteínas o fluoróforos fluorescentes, un nivel adicional de información se proporciona en el que no sólo se mide la distribución de un ligando pero el también la salida de las vías de señalización, y de esta manera la determinación de la gama umbral de un morfógeno .

Xenopus laevis es un modelo útil para visualizar ligandos GFP-etiquetados y más detalles sobre los métodos de embriones contratantes, la síntesis de ARNm, la microinyección y diseccionariones están disponibles 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por un BBSRC conceder a los MEP (BB / H010297 / 1), una cuota beca BBSRC a SAR y una beca MRC a SWF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134, (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154, (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15, (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12, (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22, (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5, (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24, (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135, (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398, (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24, (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320, (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120, (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135, (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391, (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128, (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111, (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15, (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127, (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14, (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7, (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411, (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146, (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129, (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics