माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं का समुच्चय की पीढ़ी समरूपता तोड़कर, ध्रुवीकरण और आकस्मिक सामूहिक व्यवहार चलता है कि
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
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Developmental Biology
 

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Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

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Abstract

हम वर्तमान embryoid शरीर (ईबी) आत्म संगठन के अध्ययन की अनुमति देता है, जो संस्कृति, समरूपता को तोड़ने, अक्षीय बढ़ाव और निलंबन संस्कृति में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) का समुच्चय का उपयोग करते हुए सेल भाग्य विनिर्देश में सुधार के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। MESCs की कम संख्या से वे प्रयोगात्मक संकेतों का जवाब करने के लिए सक्षम हैं, जिसके बाद गैर-ऊतक संस्कृति का इलाज, यू तली 96 अच्छी तरह प्लेटें, में 48 घंटे के लिए बेसल मध्यम में एकत्रित कर रहे हैं। उपचार के बाद, इन समुच्चय ध्रुवीकृत जीन अभिव्यक्ति के लक्षण दिखाने के और धीरे-धीरे बाहरी विषमता संकेतों के अभाव में एक लम्बी, अच्छी तरह से संगठित संरचना करने के लिए कोशिकाओं का एक गोलाकार जन से उनकी आकृति विज्ञान को बदलने के लिए शुरू करते हैं। इन संरचनाओं न केवल तीन रोगाणु परतों के मार्कर प्रदर्शित करने के लिए सक्षम हैं, लेकिन सक्रिय रूप से महत्वपूर्ण लम्बी संरचना की एक क्षेत्र में होता है, जो सकल, से व्यक्ति की कोशिकाओं के एक दिशात्मक dislodgement इसका सबूत है gastrulation जैसे आंदोलनों, प्रदर्शित करते हैं। इस protocराजभाषा इन समुच्चय की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गठन, ऐसे Wnt / β-catenin सक्रियण और बीएमपी निषेध और एकल समय बिंदु या समय चूक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने विश्लेषण के रूप में संकेतों के साथ उनकी उत्तेजना के लिए एक विस्तृत तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, हम तय समुच्चय के भीतर विशिष्ट मार्कर के Immunocytochemical विश्लेषण के लिए वर्तमान पूरे माउंट माउस भ्रूण धुंधला प्रक्रियाओं के लिए संशोधन का वर्णन है। आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और समुच्चय की लंबाई में परिवर्तन मात्रात्मक संकेतों अक्षीय भाग्य बदल सकते हैं के बारे में जानकारी प्रदान करने, मापा जा सकता है। यह इस प्रणाली में इस तरह के अक्षीय विकास और संगठन के रूप में जल्दी विकास की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए दोनों लागू किया जा सकता है कि परिकल्पना की गई है, और अधिक मोटे तौर पर, आत्म संगठन और सेलुलर निर्णय लेने की प्रक्रियाओं। यह भी इस तरह के रीढ़ की हड्डी और मोटर neurones के रूप में पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति से नायाब हैं कि भ्रूण में मौजूद प्रकार की कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक उपयुक्त आला प्रदान कर सकता है।

Introduction

जल्दी स्तनधारी विकास में अध्ययन और सेल भाग्य का निर्णय की समझ भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की संस्कृतियों (ESCs), नवीनीकृत और एक जीव की सभी प्रकार की कोशिकाओं में अंतर स्वयं करने की क्षमता है जो blastocysts से निकाली गई प्रतिरूप आबादी का उपयोग कर सकते हैं अर्थात्।, वे pluripotent 1,2 हैं। इन संस्कृतियों किया गया है और सेल भाग्य का निर्णय के आणविक आधार को समझने के लिए उपयोगी होने के लिए जारी कर रहे हैं, वे gastrulation दौरान भ्रूण में उत्पन्न कर रहे हैं कि स्थानिक व्यवस्था और वैश्विक व्यवहार में से कुछ को पुन: पेश करने में असमर्थ हैं। भ्रूण में, gastrulation की प्रक्रिया तीन अलग रोगाणु परतों में एक भी उपकला परत बदल देती है और एक खुला अग्रपश्च संगठन 3-5 के साथ भ्रूण endows। इन घटनाओं के पूर्व vivo पुनरावृत्ति करने के लिए प्रयास ESCs के तीन आयामी समुच्चय की पीढ़ी के आधार पर किया गया है, के रूप में embryoid निकायों (ईबीएस) करने के लिए भेजा है, और उन्हें टी subjectingभेदभाव की स्थिति 6.7 ओ। । जैसे, खून 8 और मौलिक जनन कोशिकाओं 9; ये समुच्चय प्राप्त या पक्षपाती संस्कृति में कम क्षमता के साथ प्रेरित किया जा सकते हैं या तो असमर्थ हैं या बिल्कुल भी उत्पादन नहीं किया जा सकता, जिनमें से कुछ कई विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए राजी कर लिया जा सकता है। ईबीएस के उपयोग में कमी, हालांकि वे स्थानिक विप्लव 6,10, जिसके परिणामस्वरूप विकासशील भ्रूण की प्रमुख विशेषताओं, कर रहे हैं कि मॉर्फ़ोजेनेटिक व्यवहार, रोगाणु परत वितरण या अक्षीय संगठन प्रदर्शित करने में असमर्थ रहे हैं। एक रिपोर्ट में, Wnt साथ ईबीएस के इलाज के कुछ समुच्चय में जीन की अभिव्यक्ति में एक कमजोर ध्रुवीकरण की ओर जाता है, लेकिन कोई स्पष्ट morphogenesis 7 मनाया जाता है। अधिक हाल की रिपोर्ट में, समय की विस्तारित अवधि के लिए संवर्धित किया गया है कि ईबीएस उनके भ्रूण समकक्षों की नकल, जो इस तरह रेटिना, छाल और भीतरी कान संवेदी कोशिकाओं के रूप में पूर्वकाल संरचनाओं को विकसित करने, लेकिन एक अक्षीय संगठनों के संदर्भ के बिना विकसितआयन 11-13।

की एक रिपोर्ट में Marikawa एट अल। 14, फांसी ड्रॉप विधि द्वारा गठित माउस P19 भ्रूण कार्सिनोमा (ईसी) की कोशिकाओं के समुच्चय के साथ काम कर रहा है, जबकि उभयचर में exogastrulae के साथ मनाया जाता है कि elongations की याद ताजा mesodermal मूल की लम्बी संरचनाओं के उद्भव सूचना दी और समुद्री साही भ्रूण और केलर 15-18 explants। इस माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) के साथ मनाया नहीं किया गया था के रूप में, हम P19 चुनाव आयोग कोशिकाओं mESCs 19 का समुच्चय का उपयोग कर के साथ मनाया व्यवहार को पुन: पेश करने का प्रयास किया और हम उनके तोड़ने समरूपता और अक्षीय बढ़ाव के लिए नेतृत्व कि संस्कृति की स्थिति की रिपोर्ट। P19 कोशिकाओं के साथ काम से एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि यहाँ वर्णित एकत्रीकरण प्रोटोकॉल के बजाय बूँदें फांसी की, Eiraku एट अल। 20 से वर्णित है कि इसी तरह एक 96 अच्छी तरह से थाली में किया जाता है। यह परिवर्तन कुल वसूली की और दोनों में मामले में एक वृद्धि की दक्षता में हुईअंतर और अंतर-प्रयोगात्मक reproducibility। उत्पन्न नहीं होती है (फांसी बूंदों से समुच्चय पूलिंग जब आम) महत्वपूर्ण बात है, व्यक्तिगत कुओं में समुच्चय को बनाए रखने के समुच्चय के बीच कि संलयन सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता एकत्रीकरण निम्नलिखित GSK3 अवरोध करनेवाला CHI99021 (ची), Wnt / β-catenin संकेतन का एक शक्तिशाली उत्प्रेरक, 24 घंटा के संपर्क में है।

यहाँ वर्णित विधि अनुमान विवो 19,21 में अक्षीय विकास के विषय में किए जाने के लिए अनुमति देता है, संस्कृति में आत्म संगठन, अक्षीय संगठन और रोगाणु परत विनिर्देश की प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक आधार प्रदान करता है। इन कारणों के लिए विधि भ्रूण में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है कि प्रक्रियाओं की विस्तृत यंत्रवत विश्लेषण की अनुमति देने की क्षमता है। इसके अलावा, एक संभावित आवेदन की वजह से एक संरचित सेलुलर आला की कमी के कारण इस तरह के रूप में करने के लिए पक्षपाती संस्कृति में आसानी से प्राप्य नहीं हैं कि ऊतकों और अंगों की पीढ़ी में हैरीढ़ की हड्डी में 21 और मोटर neurones व्यापारियों। तीन आयामी कुल संस्कृति एक स्थानिक संगठित तरीके से भ्रूण प्रजातियों की व्युत्पत्ति के लिए एक नया दृष्टिकोण के लिए अग्रणी, पारंपरिक तरीकों से प्राप्त नहीं हो सकता है कि एक शारीरिक संरचना और संकेत वातावरण प्रदान करता है।

Protocol

1. संस्कृति की स्थिति एकत्रीकरण से पहले

  1. सीओ 21-25 फ़रवरी 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में जिलेटिन लेपित 25 सेमी 2 टिशू-संस्कृति का इलाज बोतल पर ESLIF माध्यम में mESCs (सूत्रीकरण के लिए विशिष्ट सामग्री और उपकरण की तालिका देखें) को बनाए रखने और 5%।
  2. इस प्रोटोकॉल में उपयोग करने से पहले विगलन पोस्ट पर कम से कम दो मार्ग के लिए कोशिकाओं को विकसित; कम मार्ग पर कोशिकाओं प्रयोगात्मक प्रतिकृति भर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विशेषताओं पैदा करने में आम तौर पर अधिक सफल रहे हैं (यानी।, संस्कृति में कोई 15 से अधिक मार्ग), अलग ते सेल लाइनों के बीच हालांकि मामूली बदलाव (देखें उम्मीद की जा रही है का परीक्षण सेल लाइनों के लिए 2 टेबल )।
  3. 40-60 confluency% कोशिकाओं को विकसित। एकत्रीकरण के लिए अधिक-मिला हुआ कोशिकाओं का प्रयोग न करें।

समुच्चय के 2. जनरेशन

  1. पूर्व गर्म पीबीएस (+ सीए 2 + 2 मिलीग्राम +), ESLIF, N2B27 26,27
  2. टिशू कल्चर कुप्पी से महाप्राण संस्कृति के माध्यम से (1.3 चरण)। दो बार, 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धीरे कुप्पी कुल्ला। पीबीएस Aspirate और कोशिकाओं को अलग कर देना 1 पूर्व गर्म trypsin EDTA (0.25%) की मिलीलीटर 2 में जोड़ें।
    1. <5 मिनट के लिए या कोशिकाओं को पूरी तरह कुप्पी की सतह से अलग कर दिया है जब तक इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें। पिपेट और सटीक गिनती और वर्दी कुल आकार गठन के लिए एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ नीचे।
  3. 5-10 मिलीलीटर ESLIF साथ trypsin बेअसर; सेल वसूली को अधिकतम और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण करने के लिए वृद्धि की सतह के नीचे धो लें। अपकेंद्रित्र ट्यूब से एक 1 मिलीलीटर विभाज्य निकालें और एक रुधिरकोशिकामापी के साथ कोशिकाओं की गिनती।
  4. 10 कोशिकाओं / μl देने के लिए आवश्यक निलंबन की मात्रा (एक पूरे 96 अच्छी तरह से थाली एक 5 मिलीलीटर निलंबन में 5x10 4 कोशिकाओं की आवश्यकता है) का निर्धारण करते हैं। बड़े deviat के रूप में, सही ढंग से कोशिकाओं की गणनाकहा सेल नंबर से आयनों प्रतिकूल उत्तेजनाओं को समुच्चय की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं।
  5. 5 मिनट के लिए ~ 170 XG पर एक ताजा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन में 5 मिलीलीटर पूर्व गर्म पीबीएस 5x10 4 कोशिकाओं जोड़ें।
  6. ध्यान से पीबीएस महाप्राण और 5 मिलीलीटर जोड़ने पीबीएस धीरे पूर्व गर्म; ट्यूब के नीचे गोली परेशान नहीं है। 5 मिनट के लिए ~ 170 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. ध्यान से एक दूसरी बार के लिए पीबीएस महाप्राण। प्रतिकूल एकत्रीकरण को प्रभावित कर सकते पीबीएस भार के रूप में गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा पीबीएस निकालें। आवश्यक मात्रा को N2B27 के आगे अलावा द्वारा पीछा एक समरूप सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए एक P1000 पिपेट, साथ 1 मिलीलीटर गर्म N2B27 में सबसे पहले गोली Resuspend (जैसे, एक 5x10 के लिए 4 कोशिकाओं / 5 मिलीलीटर निलंबन 4 मिलीलीटर जोड़ें)।
  8. एक बाँझ जलाशय सेल निलंबन स्थानांतरण और इलाज के लिए एक गैर-ऊतक संस्कृति के प्रत्येक कुएं के तल में एक 40 μl छोटी बूंद पिपेट, '96-W U'तलीएक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग पक्ष थाली। अपनी इसी ढक्कन के साथ 96 अच्छी तरह से थाली कवर और एक औंधा पीठ टॉप माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) के साथ कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि।
    नोट: यह इन प्लेटों पालन कोशिकाओं की संभावना को सीमित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि आवश्यक है। नहीं कोट जिलेटिन, फ़ाइब्रोनेक्टिन या कोशिका आसंजन को बढ़ावा देता है कि किसी अन्य कोटिंग के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के नीचे मत करो।
  9. एकत्रीकरण के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और 5%।

3. उत्तेजनाओं को लागू करने और मध्यम बदलने

  1. 48 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, सफल एकत्रीकरण (चित्रा 1E) की पुष्टि के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर mESCs की उपस्थिति का निरीक्षण। नोट: समुच्चय प्रकृति में गोलाकार और व्यास में लगभग 150-200 माइक्रोन दिखाई देंगे। समस्याओं (1 टेबल) उत्पन्न होती है, तो समस्या निवारण अनुभाग का संदर्भ लें।
  2. 0; (N2B27 19 में 3 माइक्रोन Chi99021 (ची); DMSO में 10 मिमी पर तैयार शेयर) 150 μl ताजा माध्यमिक मध्यम जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए। पर्याप्त बल के साथ पिपेट कुओं के नीचे का पालन करने के लिए शुरू हो सकता है कि किसी भी समुच्चय को बेदखल करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (चित्रा 1 ए) पर एक humidified इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए माध्यमिक माध्यम में समुच्चय सेते हैं।
    नोट: प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लम्बी और ध्रुवीकृत समुच्चय इस माध्यमिक माध्यम का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। अन्य माध्यमिक मध्यम रचनाओं भी प्रयोगात्मक शर्तों की आवश्यकता है और उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है के आधार पर किया जा सकता है।
  3. बाद में मध्यम परिवर्तन के लिए, धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक की ओर से माध्यमिक माध्यम के 150 μl दूर करने के लिए एक कोण (लगभग 30 डिग्री) में आयोजित एक multichannel विंदुक का उपयोग करें। फिर, अच्छी तरह से पर्याप्त बल के साथ प्रत्येक में N2B27 ताजा पिपेट 150 μl प्रारंभ हो सकता है कि किसी भी समुच्चय को बेदखल करने के लिएएड कुओं के नीचे का पालन करने के लिए।
  4. समय पाठ्यक्रम तक हर 24 घंटा दोहराएँ बिंदु 3. 3 पूरा हो गया है (एक समग्र संस्कृति प्रयोग के ठेठ लंबाई 120 घंटा) है।
    नोट: यह सुनिश्चित करें समुच्चय स्वतंत्र रूप से भीतर और प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के बीच reproducibility और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए माध्यम परिवर्तन के बाद आगे बढ़ रहे हैं। मध्यम एकत्रीकरण अवधि के बाद दैनिक परिवर्तित किया जाना चाहिए।

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा immunostaining और विश्लेषण के लिए समुच्चय के 4. तैयारी

  1. फिक्सेशन और प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    नोट: एके Hadjantonakis 28 से वर्णित प्रोटोकॉल mESC समुच्चय के immunostaining के अनुरूप संशोधित कर दिया गया है। हमारे अध्ययन और उनके dilutions में इस्तेमाल किया ठेठ एंटीबॉडी के लिए, पहले से काम 19,21,24,25,29 और 3 टेबल प्रकाशित करने के लिए देखें।
    1. एक कोण पर आयोजित एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें (लगभग 30 डिग्री) धीरे पक्ष ओ से 150 μl मध्यम हटाने के लिए96 अच्छी तरह से थाली के च प्रत्येक अच्छी तरह से। अच्छी तरह से प्रत्येक में 150 μl पीबीएस pipetting द्वारा दो बार धोएं। समुच्चय व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक धोने के बीच कुछ मिनटों के लिए छोड़ दें।
    2. , 200 μl बांटना इसी विंदुक टिप देते हैं और बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ टिप के अंत से लगभग 3 मिमी नाश करने के लिए एक P1000 पिपेट सेट करें। टिप में 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर एक छोटा रास्ता पीबीएस के एक हिस्से को ड्रा और समग्र आंदोलन करने के लिए इसे निष्कासित।
    3. अच्छी तरह से अच्छी तरह से एक छोटा सा (30 मिमी व्यास) कांच ड्रोसोफिला विच्छेदन में समग्र और पिपेट सहित भीतर पूरी मात्रा को आकर्षित करने के लिए एक ही टिप का उपयोग करें। अच्छी तरह से एक ही गिलास विच्छेदन में समान immunostaining के शासनों से गुजरना होगा कि 96 अच्छी तरह से थाली से सभी समुच्चय स्थानांतरण।
      नोट: समुच्चय के भार को रोकने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों से समुच्चय स्थानांतरित जब एक नई कटौती पिपेट टिप का उपयोग करें।
    4. Aggregat होता है कि कांच अच्छी तरह से जगहएक विच्छेदन खुर्दबीन पर तों। एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ अच्छी तरह से एक तरफ से केंद्र और महाप्राण पीबीएस समुच्चय मजबूर करने के लिए अच्छी तरह से कांच भंवर। समुच्चय aspirated नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। बाहर सुखाने से उन्हें रोकने के समुच्चय को कवर करने के गिलास में अच्छी तरह से भीतर पीबीएस की एक छोटी मात्रा छोड़ दें।
    5. 1 मिलीलीटर हौसले से तैयार फॉर्मेल्डीहाइड (4%) पीबीएस में भंग कर दिया है और एक कम गति के लिए सेट एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते जोड़ें। सावधानी: Paraformaldehyde, एलर्जी कैंसर और विषाक्त हो जाता है। से निपटने whilst के उचित संरक्षण पहनें।
    6. धारा 4 1. 4 में वर्णित के रूप में निर्धारण के बाद, एक ही तरीके से formaldehyde समाधान निकालना और एक कम गति के लिए सेट एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर, प्रत्येक धोने के साथ के लिए, 1 मिलीलीटर पीबीएस तीन बार के साथ 10 मिनट समुच्चय धो लें।
    7. धारा 4 1. 4 में वर्णित के रूप में पीबीएस Aspirate और पीबीएस 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 0.2% त्रि युक्त के साथ एक और तीन, 10 मिनट washes प्रदर्शनटन एक्स 100 (PBSFT)। एक कम गति के लिए सेट एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 10 मिनट washes के प्रदर्शन करना।
      नोट: दूध का इस्तेमाल किया गया है, अन्यथा प्रोटोकॉल के दौरान खो जाएगा कि समुच्चय की संख्या को कम करने, एक स्पष्ट धोने बफर में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के परिणामों का उपयोग करना। यह निर्धारण के बाद, प्रतिरक्षाऊतकरसायन प्रक्रियाओं नीचे विस्तृत उन के अलावा अन्य विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है और निर्धारित किया है और अन्वेषक द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है।
    8. एक कम गति के लिए सेट एक कक्षीय घुमाव पर PBSFT में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए समुच्चय ब्लॉक। प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रुका हुआ है, और समुच्चय 4 डिग्री सेल्सियस पर एक क्षैतिज gyratory घुमाव पर लगातार आंदोलन के साथ, हे / एन अवरुद्ध हो सकता है।
    9. पहले से वर्णित के रूप में PBSFT महाप्राण (धारा 4. 1. 4 देखें) और कम गति के लिए सेट एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर PBSFT हे / एन में पतला आवश्यक प्राथमिक एंटीबॉडी के 500 μl साथ समुच्चय सेते हैं। वाष्पीकरण को रोकने के लिए आयल फिल्म के साथ कवर।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान Aspirate और निम्नलिखित तरीके से (4 डिग्री सेल्सियस पर) 1 मिलीलीटर PBSFT से धो लें: दो बार 5 मिनट के लिए; तीन बार 15 मिनट के लिए; और 1 घंटे के लिए 4-7 बार। 4 डिग्री सेल्सियस पर और कम गति के लिए सेट एक कक्षीय घुमाव पर प्रत्येक धोने कदम प्रदर्शन। नोट: चिल का उपयोग करने के लिए मध्यम से पहले धो लें। यह टुकड़ा करने के लिए समुच्चय पैदा कर सकता है के रूप में बर्फ पर washes के प्रदर्शन नहीं करते।
    2. अंतिम धोने मध्यम Aspirate और एक क्षैतिज gyratory घुमाव पर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 μl PBSFT हे / एन में आवश्यक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ समुच्चय सेते हैं। यदि जरूरी हुआ तो ऐसे Hoechst के रूप में परमाणु दाग ​​जोड़ें।
  3. Confocal microcopy से बढ़ते और इमेजिंग
    1. 4 डिग्री सेल्सियस PBSFT साथ धारा 4 1. 4 में वर्णित के रूप समुच्चय को धो लें। अंतिम धोने के बाद, 1 मिलीलीटर पीबीएस निम्नलिखित तरीके में 0.2% FBS और ट्राइटन X-100 (पीबीटी) युक्त साथ समुच्चय कुल्ला: दो बार 5 मिनट के लिए; 15 मिनट के लिए तीन बार। Washes के प्रदर्शन करनाआरटी पर एक कक्षीय घुमाव पर प्रकाश से रक्षा की।
    2. ग्लिसरॉल का एक समाधान: पीबीटी (1 मिलीलीटर) एक 7 के साथ एक दूसरे को 30 मिनट ऊष्मायन के बाद: 3 समाधान के लिए एक 1 के साथ अंधेरे में 30 मिनट के लिए पहले से वर्णित के रूप में मध्यम महाप्राण (धारा 4. 1. 4) और सेते ग्लिसरॉल: पीबीटी (1 मिलीलीटर)।
      नोट: एक रोटेटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल और पीबीटी समाधान मिलाएं।
    3. अंतिम ग्लिसरॉल महाप्राण: पीबीटी समाधान और मध्यम 24 बढ़ते 1 मिलीलीटर के साथ बदलें। प्रोटोकॉल (रुका हुआ है, तो आयल फिल्म के साथ कुओं सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला कुओं स्टोर) से पहले बढ़ते करने के लिए इस बिंदु पर रोक दिया जा सकता है।
    4. एक कट P20 टिप (चित्रा 2) के साथ 17 μl बूंदों में उन्हें pipetting द्वारा खुर्दबीन स्लाइड पर समुच्चय माउंट। स्पेसर पैदा करते हैं और स्लाइड के प्रत्येक के अंत करने के लिए संलग्न करने के लिए वापस पर ही चार बार डबल पक्षीय टेप मोड़ो। (चित्रा 2) इन स्पेसर पर शीर्ष coverslip (22 मिमी x 60 मिमी) रखें।
      नोट: यह एक कट टिप है कि जरूरी हैनमूनों को नुकसान करने के रूप में नहीं तो इस स्तर पर प्रयोग किया जाता है। स्पेसर समुच्चय कुचल coverslip रोका जा सके।
    5. समुच्चय मुहिम शुरू कर रहे हैं, प्रोटोकॉल का उपयोग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि के नमूने पहले से 19,21,24,25 का वर्णन किया। एक बार जब माइक्रोस्कोप पर रखा, समुच्चय बढ़ते मध्यम भीतर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए कुछ मिनट के लिए मंच पर undisturbed स्लाइड छोड़ दें।

Representative Results

इसके तत्काल बाद चढ़ाना के बाद और एकत्रीकरण के बाद कोशिकाओं की उपस्थिति

इसके तत्काल बाद चढ़ाना के बाद, एक एक मानक उल्टे ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के भीतर एकल कक्षों की उपस्थिति का निरीक्षण कर सकते हैं। चढ़ाना के 8 घंटे के भीतर, इन कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण के लिए अच्छी तरह से कारण की तह तक उतरना शुरू कर दिया है जाएगा और असतत समूहों (चित्रा 1 सी) में सम्मिलित करने के लिए शुरू कर दिया जाएगा। 24 घंटे के बाद, coalescing कोशिकाओं प्राथमिक एकत्रीकरण पूरा कर लिया जाएगा, और व्यक्ति की कोशिकाओं को एक दूसरे (चित्रा -1) से अस्पष्ट हैं, जहां अच्छी तरह से परिभाषित किया है, फिर भी प्रचंड समुच्चय में जमा कर लिया जाएगा। दूसरे दिन (48 घंटे), समुच्चय, 'साफ' दिखना चाहिए के अंत तक अच्छी तरह से (चित्रा 1E) के भीतर सभी कोशिकाओं को ले जाया होने; अच्छी तरह से नीचे इस चरण में कुल से बहाया गया है कि कुछ कोशिकाओं हो सकता है। उपलब्ध करानासमुच्चय इस समय बिंदु पर, N2B27 में एकत्रित किया गया है, वे व्यास में लगभग 150-200 माइक्रोन और स्वतंत्र रूप से अच्छी तरह से भीतर चलती है (यानी।, कुओं के नीचे का पालन नहीं), गोलाकार होना चाहिए। अन्य मीडिया में एकत्रीकरण (यानी।, ESLIF या विशिष्ट कारकों के साथ N2B27) (तैयारी में, टर्नर एट अल।) प्रारंभिक कुल आकृति विज्ञान और बाद में उत्तेजनाओं के जवाब दोनों में परिवर्तन करने की क्षमता है।

प्रतिनिधि रूपात्मक बदलाव

(चित्रा 1 ए, 5 ए) घंटा 48 के बीच और 72 ची युक्त माध्यमिक माध्यम की एक 24 घंटा नाड़ी के अलावा अच्छी तरह से रोगाणु परतों 19,21 के विशिष्ट मार्करों में ध्रुवीकृत अभिव्यक्ति चलता है कि लम्बी समुच्चय परिभाषित उत्पन्न करता है। इसके तत्काल बाद ची पल्स (72 घंटा) के बाद, समुच्चय कोशिकाओं बहाया और इस दिन (चित्रा 3) के अंत में इन संकेतों के लिए उनकी प्रतिक्रिया को दिखाने के लिए शुरू करने के लिए शुरू हो जाएगा। ये प्रतिक्रियाएंसमुच्चय N2B27 (चित्रा 3 बी) में प्रारंभिक 48 घंटा एकत्रीकरण अवधि के बाद प्राप्त हुआ है कि इलाज पर निर्भर कर रहे हैं, जो दोनों के जीन की अभिव्यक्ति और आकृति विज्ञान में परिवर्तन, द्वारा प्रकट कर रहे हैं। केवल एक समापन बिंदु विश्लेषण की आवश्यकता है, तो छवि समुच्चय को अनुकूलतम समय में लगभग 96-120 घंटा है। इस बिंदु पर समुच्चय स्पष्ट morphologies और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न (चित्रा 3) विकसित करना होगा, और P200 पिपेट से मध्यम की है कि इंजेक्शन संलग्न हो सकता है कि किसी को बेदखल करने के लिए पर्याप्त है तो उनके आकार और द्रव्यमान अभी भी काफी कम हैं। अच्छी तरह से करने के लिए कुल का लगाव को रोकने के लिए विफलता पर प्रतिकूल कुल गठन (चित्रा 5Biv) को प्रभावित करेगा। समुच्चय के morphologies और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न उपचार के आधार पर बदला जा सकता है। एकल उपचार या कारकों के संयोजन के साथ या तो निरंतर या स्पंदित व्यवस्थाओं के लिए प्रतिनिधि परिणाम BMP4, Dorsomorphin एच 1 (बी लिए दिखाए जाते हैंसांसद रिसेप्टर अवरोध करनेवाला), ActivinA, SB43 (Activin / नोडल अवरोध करनेवाला), bFGF या PD03 (खल्क अवरोध करनेवाला) (चित्रा 3 बी)।

सकल इमेजिंग और मात्रात्मक छवि विश्लेषण

समुच्चय (मुख्यतः समय चूक इमेजिंग 19 के लिए) या ​​तो widefield माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए उत्तरदायी है, या तय की और confocal इमेजिंग 19,21 (चित्रा 2) के लिए immunostained हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल और इमेजिंग वर्णन ऊपर मात्रात्मक जानकारी इन समुच्चय से प्राप्त की जा सकती है। निम्नलिखित confocal या व्यापक क्षेत्र छवि पर कब्जा, लंबाई और (क्रमशः गोलाकार या लम्बी, चित्रा -4 ए, बी) के कुल का व्यास या रीढ़ साथ इसी जीन अभिव्यक्ति मापा जा सकता है। ये विश्लेषण भी एक अलग परिस्थितियों में समुच्चय के विकास, आकार और बढ़ाव की दर के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं जहां समय चूक छवियों, (चित्रा 4 को सीधे लागू कर रहे हैं

चित्र 1
चित्रा 1. ठेठ समय पाठ्यक्रम और जल्दी morphologies। (ए) एकत्रीकरण प्रयोगों के लिए विशिष्ट समय पाठ्यक्रम। प्रकोष्ठों एक 96 अच्छी तरह से थाली में (P1, P2) माउस ते कोशिकाओं के निलंबन (10 कोशिकाओं / μl) युक्त N2B27 में 48 घंटे के लिए एकत्रित कर रहे हैं। (बी) के तुरंत (टी = ~ 5min) चढ़ाना के बाद, व्यक्ति की कोशिकाओं पर किया जा सकता है निलंबन में देखा जाता है और कोशिकाओं लगभग 100 मीटर व्यास में है, जो अच्छी तरह से प्रत्येक में एक भी कुल का गठन किया है 24 घंटे के बाद 8h (सी)। (डी) द्वारा गुच्छों के रूप में करने शुरू कर दिया है। (ई) 48 घंटा एकत्रीकरण के बाद, सकल व्यास 150-200 माइक्रोन से चलता है। इस बिंदु पर, एकत्रीकरण मध्यम (N2B27) को हटा दिया है और एक माध्यमिक मध्यम ख परिवर्तित किया जा रहा से पहले (भाग एक में पी 1) प्रयोग के आराम के लिए या 24 घंटे के लिए या तो जोड़ा जाता हैN2B27 (भाग एक में p2) के लिए ack। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ते समुच्चय। समुच्चय तय किया गया है एक बार, immunostained और बढ़ते मध्यम में रखा गया है, प्रत्येक कुल एक 17 μl छोटी बूंद के रूप में एक खुर्दबीन स्लाइड पर pipetted है (ए, बी, बी ')। पर्याप्त जगह उनकी विलय को रोकने के लिए कुल बूंदों के बीच छोड़ दिया है। Spacers डबल पक्षीय टेप के साथ बनाया गया है और माइक्रोस्कोप स्लाइड (ए, ए ', बी) के प्रत्येक कोने में रखा जाता है। यह एक गिलास coverslip रखा गया है कि इन पर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. एकत्रित ES कोशिकाओं की आकृति विज्ञान पर अलग उपचार के प्रभाव। N2B27 में 2 दिनों के बाद, ते कोशिकाओं समुच्चय का गठन किया है। विशिष्ट कारकों के अलावा या तो जीन अभिव्यक्ति, बढ़ाव संभावित है, या उनके समग्र आकार के polarity के लिए सम्मान के साथ समुच्चय के phenotype बदल सकते हैं एक 1 दिन नाड़ी (ए) या ​​लगातार (बी) के रूप में। इस आंकड़े में उदाहरण 120 घंटे के बाद imaged और संकेत के रूप में व्यवहार किया जाता है या तो ब्रा से गठित समुच्चय :: GFP 30 (ए) या ​​Sox1 :: GFP 27 (बी) के माउस ते कोशिकाओं रहे हैं। ची: चीड़ 99021 31; SB43: एस.बी. 431,542 32; डीएम: DorsomorphinH1 33,34; PD03:। PD0325901 वीं का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

चित्रा 4
समुच्चय के चित्रा 4. मात्रात्मक विश्लेषण। ब्रा से गठित एक विशिष्ट कुल :: ची के एक 24 घंटा नाड़ी के बाद और 120 घंटे पर imaged GFP mESCs 25,30। उज्ज्वल क्षेत्र और GFP चैनल के मर्ज किए गए छवि कुल की प्रतिदीप्ति और लंबाई मापी जा सकती है, जो साथ बी (ए) के लिए एक बिंदु से कुल की 'रीढ़' अंकन खंडों लाइन, (बी) के साथ दिखाया गया है। लंबाई (सी) और एक ही प्रयोग के भीतर 24 समुच्चय से 'गोलाई' (डी) दिखाए जाते हैं। ऐसे गोलाई (डी), घेरा, परिधि और क्षेत्र के रूप में आकार वर्णनकर्ता छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी 35 से छवि विश्लेषण कुकबुक प्लगइन का उपयोग करके मापा जा सकता है। प्रत्येक समय बिंदु पर क्षैतिज रेखा से संकेत मतलब;त्रुटि सलाखों के मानक विचलन संकेत मिलता है; (ए) में बड़े पैमाने बार 200 माइक्रोन इंगित करता है। संवाददाता सेल लाइनों के बीच सूक्ष्म अंतर देखते हैं के रूप में, यह ची की एक नाड़ी के बाद, समुच्चय की औसत अधिकतम लंबाई और औसत न्यूनतम गोलाई भिन्न हो जाएगा उम्मीद है। विभिन्न सेल लाइनों के बीच, हम औसत अधिकतम लंबाई 400-800 माइक्रोन और 0.4 और 0.6 के बीच औसत न्यूनतम गोलाई ~ की सीमा के भीतर हो सकता है कि लगता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा कुल गठन में विफलताओं की 5. उदाहरण हैं। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समुच्चय (ए) उत्पन्न करने की क्षमता प्रारंभिक एन गिनती में इस तरह के (बीआई) ताजा और अच्छी तरह से मिश्रित माध्यमिक मध्यम, (Bii, Biii) के रूप में महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर करता है सटीकतासमुच्चय सुनिश्चित कोशिकाओं और (Biv) का भूरा रंग पक्षपाती कालोनियों यानी फार्म नहीं है। 'दुर्घटना' अच्छी तरह से की सतह में। वर्णित शर्तों (बी) में से प्रत्येक के लिए कुल गठन में त्रुटियों की विशिष्ट उदाहरण दिखाए जाते हैं। संकेत के रूप में स्केल-बार; जानकारी के लिए मुसीबत शूटिंग तालिका (तालिका 1) देखते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
समस्या निवारण करने के लिए तालिका 1. गाइड। एकत्रीकरण प्रोटोकॉल के साथ जुड़े विशिष्ट त्रुटियों को अपने संकल्प के रूप में सुझाव के साथ दिया जाता है।

सारणी 2
टेबल सेल लाइनों की 2. टेबल Agg के गठन के लिए परीक्षण कियाregates। सेल लाइनों के बीच सूक्ष्म अंतर उम्मीद कर रहे हैं, हालांकि, समुच्चय और के गठन के लिए विशेषता किया गया है और देखा गया है 19,22,27,30,36-40 सेल लाइनों की संख्या, सब से ऊपर लाइनों मामले में इसी तरह की गतिशीलता दिखाने बढ़ाव और आकृति विज्ञान की। जीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में, अभिव्यक्ति पैटर्न जीन व्यक्त करने के लिए विशिष्ट है, लेकिन प्रत्येक कोशिका लाइन के भीतर, अभिव्यक्ति पैटर्न मार्ग की एक संख्या से अधिक आम तौर पर संगत है। स्थिरता के लिए, हम संस्कृति में 15 मार्ग को पार नहीं किया है कि कोशिकाओं से समुच्चय उत्पन्न करते हैं।

टेबल तीन
इन अध्ययनों में प्रयुक्त प्रतिनिधि एंटीबॉडी की तालिका 3. सूची। एंटीबॉडी और कुल immunostaining के लिए इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने कारकों का।

Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक कुशलता और reproducibly Marikawa एट अल। 14 और ईबी गठन के द्वारा वर्णित दोनों फांसी ड्रॉप संस्कृति के संयोजन, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) कि प्रदर्शन का आयोजन किया समरूपता को तोड़ने और बढ़ाव 19 का समुच्चय उत्पन्न करता है। इन समुच्चय जैसे ऑप्टिक कप 11 और सेरेब्रल कॉर्टेक्स के रूप में 13 ते कोशिकाओं से पूर्वकाल अंगों की पीढ़ी के लिए मौजूदा तरीकों के पूरक, अक्षीय elongations को विकसित करने पर जाना है, और जो प्रदर्शन gastrulation दौरान उन लोगों के लिए इसी तरह की प्रक्रिया तीन रोगाणु परतों की पहचान के साथ सेल होते हैं ऐसे तेजी से सेल आंदोलन 19,21 के रूप में।

यह बाहरी patterning के ऊतकों के अभाव में होता है और युग्मज विषमता 19 cues, क्योंकि यह समरूपता तोड़ने घटना की प्रकृति पर सट्टा करने के लिए दिलचस्प है। एक अल्पविकसित अक्ष का सहज गठन पूर्व मौजूदा heterogen से पैदा हो सकता हैविषमता के विकास के लिए आधार के रूप में है, जो कोशिकाओं का मूल्य उस संस्कृति में eities। दरअसल, ESLIF की स्थिति में संवर्धित कोशिकाओं की आबादी स्वयं renewing और फर्क कोशिकाओं का एक मिश्रण प्रदर्शित करते हैं, जिनमें से रिश्तेदार अनुपात दूसरे के लिए एक समग्र से भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला में प्रारंभिक काम कोशिकाओं की एक पूर्ण pluripotent आबादी से समुच्चय (डीए टर्नर और तैयारी में ए मार्टिनेज एरियस,) का आयोजन पैटर्न गठन में विविधता के लिए एक भूमिका है, सुझाव patterning में देरी विकास और दोषों को पता चलता है कि पता चलता है। यह एक प्रतिक्रिया-प्रसार तंत्र दूर कुल की सतह से एक अवरोध करनेवाला के प्रसार के साथ, पैटर्न उत्पन्न हो सकता है कि विचार के लायक है। Warmflash एट अल। 41 एक ऐसी व्यवस्था है कि यह तीन आयामों में patterning के लिए एक संभावित उम्मीदवार बना रही है, पक्षपाती संस्कृति में रेडियल विषमता के विकास के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि सुझाव।

पहल के दौरानएल 48 घंटा एकत्रीकरण अवधि, कोशिकाओं वे माध्यमिक मध्यम 19,21,24 से संकेतों पर प्रतिक्रिया करने के लिए सक्षम हैं जिसमें postimplantation आद्यबहिर्जनस्तर, भीतर है कि इसी तरह के एक राज्य तक पहुँचने। आमतौर पर, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बढ़ाव के लिए पर्याप्त संकेत है कि उपलब्ध कराने के (जैसे Wnt / β-catenin एगोनिस्ट के रूप में) कारकों में शामिल है जो माध्यमिक माध्यम की एक नाड़ी के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है। लैंकेस्टर एट अल द्वारा वर्णित पिछला संस्कृति तरीकों। और (मानव ESCs 13 का उपयोग) Eiraku एट अल। (MESCs 11) के साथ एकत्रित कोशिकाओं ऑन के लिए Matrigel बूंदों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया 96 अच्छी तरह प्लेटें से पहले कम आसंजन में एकत्रीकरण की एक छोटी अवधि के लिए इस्तेमाल किया संस्कृति जा रहा है। एकत्रीकरण और Matrigel प्रविष्टि के बीच के समय पढ़ाई के बीच अलग था हालांकि, दोनों ही मामलों में, कोशिकाओं की बड़ी संख्या कुल गठन (लगभग 3,000-4,500 कोशिकाओं) के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके विपरीत, प्रोटोकॉल 19 अब तक कम कोशिकाओं (लगभग 400 कोशिकाओं का उपयोग करता यहाँ वर्णितबढ़ाव, समरूपता को तोड़ने और 19 मनाया जाता है कि ध्रुवीकरण की प्रक्रिया के लिए बिल्कुल जरूरी होने के लिए निर्धारित किया गया है जो कुल) के अनुसार। इसके अलावा, इन लम्बी संरचनाओं कृत्रिम matrices में एम्बेड करने के बिना एक बहुत कम समय अवधि में उत्पन्न किया जा करने में सक्षम हैं: लैंकेस्टर एट अल द्वारा परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों की पीढ़ी की तुलना (> 20-30 दिन) Eiraku से 13 और ऑप्टिक कप। एट अल। (~ 11 दिन) ध्रुवीकृत लम्बी संरचनाओं की पीढ़ी के लिए आवश्यक 5 दिन के साथ 11।

हालांकि यहां वर्णित संस्कृति विधि के साथ सीमाओं में से एक है, उनके आकार कुओं के नीचे सिंक और गैर पर भी एक आसंजन के लिए मजबूर करने के लिए गंभीरता के तहत उन्हें सक्षम renders जब तक वे केवल चढ़ाना पोस्ट लगभग 5-6 दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है कि लेपित प्लास्टिक के बर्तन। ऐसे में पहले उल्लेख किया उन लोगों के रूप में कृत्रिम मेट्रिसेस का उपयोग करते हुए आगे के प्रयोगों, हमें की अवधि बढ़ाने के लिए अनुमति दे सकता हैअवलोकन और प्रयोग, और काम पर जा रहे इस तरीके से समुच्चय में बाधा के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए है। इस तकनीक का एक और सीमा समुच्चय को हटाने के बिना मध्यम बदलने के क्रम में, मध्यम की एक छोटी मात्रा अच्छी तरह से नीचे में छोड़ दिया जाना चाहिए। रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण के लिए परिणाम यह कमजोर पड़ने और पिछले मीडिया से किसी भी अवशिष्ट प्रभाव पर विचार करने की जरूरत है: 3 सुक्ष्ममापी ची नाड़ी के दिन पर, 2.37 माइक्रोन के समाधान वास्तव में वितरित, और बाद में मध्यम परिवर्तन 0.499 के एक कैरी ओवर में परिणाम है माइक्रोन (72-96 घंटा) है और यह समय बिंदुओं के बीच 0.105 माइक्रोन (96-120 घंटा)। वर्तमान काम कमजोर पड़ने के लिए सही नहीं है और यह दैनिक मध्यम परिवर्तन अवशिष्ट प्रभाव को कम कर देंगे कि माना जाता है।

अंतर और अंतर-प्रयोगात्मक दोनों reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, mESCs के शुरू संस्कृति में अच्छी तरह से बनाए रखा है और नहीं सह से अधिक होना चाहिएnfluent, और मध्यम हमेशा अच्छी गुणवत्ता यानी होना चाहिए।, ताजा और अच्छी तरह से मिश्रित (चित्रा 5 ए, बी)। गरीब संस्कृति की स्थिति पर प्रतिकूल एकत्रीकरण (चित्रा 5Bi) प्रभावित करते हैं। बड़ा समुच्चय के लिए असफल के रूप में एक ~ 400 कोशिकाओं / 40 μl सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की सटीक गिनती आवश्यक है, स्वयं को व्यवस्थित और छोटे समुच्चय सही नहीं पहुंच पा रहे हैं, जबकि प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 5Bii) के भीतर डबल समुच्चय के रूप में होने की संभावना है वे प्रोत्साहन (चित्रा 5Biii) के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम होते हैं जहां घनत्व। एक प्रमुख अनुकूलन कदम सेल निलंबन से दूषित पदार्थों सीरम निकालता है कि एक दूसरे पीबीएस धोने (2.6 चरण) को शामिल किया गया; इस एकत्रीकरण आवृत्ति सुधार हुआ है और लगभग 24 घंटे से समुच्चय के विकास को त्वरित। इसके बाद, यह सुनिश्चित करने के माध्यम के परिवर्तन के साथ-साथ की सतह का पालन करने की क्षमता है कि किसी भी समुच्चय को बेदखल करने के लिए पर्याप्त बल के साथ लागू कर रहे हैं; इसलिए resu ऐसा करने में विफलतासमुच्चय 'दुर्घटनाग्रस्त' (चित्रा 5Biv) में एलटीएस। (और नीचे) जैसा कि पहले उल्लेख इसके अलावा, और, यह समुच्चय निलंबन संस्कृति में रखा जाता है और किसी भी सतह का पालन करने से रोका जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। समुच्चय पालन किया है एक बार, जीन अभिव्यक्ति और उनके बढ़ाव क्षमता का पैटर्न बाधित कर रहे हैं।

इस तकनीक अपेक्षाकृत सरल है, और अच्छी तरह से अच्छा ऊतक संस्कृति तकनीक के साथ व्यक्तियों के परिहार के भीतर है, एकत्रीकरण के साथ जुड़े समस्याओं के अधिकांश अपेक्षाकृत तेजी से इन महत्वपूर्ण कदम का पालन कर रहे हैं, तो हल किया जा सकता है; मुसीबत शूटिंग का एक पूरा तालिका उपलब्ध (तालिका 1) है। में महारत हासिल करने के बाद, इस तकनीक का अक्षीय विकास, समरूपता को तोड़ने और सेल निर्णय घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिक विशेष रूप से, इन समुच्चय इस तरह के रीढ़ की हड्डी और मोटो के रूप में अब तक संस्कृति में उपलब्ध नहीं किया गया है कि कोशिकाओं के पूल, उत्पन्न करने की क्षमता हैआर neurones।

एथिकल नोट: यह मानव ते या आईपीएस सेल संस्कृति के लिए इस प्रोटोकॉल का अनुवाद करीब मानव भ्रूण शोध पर चौदह दिन की सीमा, एक आदिम लकीर के अर्थात् पीढ़ी के कानूनी आधार के लिए प्रयोगकर्ता ला सकता है की वजह से सावधानी के साथ ध्यान दिया जाना चाहिए, मानव निषेचन और भ्रूणविज्ञान अधिनियम 2008 (ब्रिटेन) 42 में विस्तृत रूप में। अधिनियम की परवाह किए बिना सृष्टि के अपने तरीके के सभी जीवित मानव भ्रूण को शामिल किया गया के बाद से, चरण की तरह आदिम-लकीर से परे मानव gastruloids की संस्कृति लाइसेंस अनुसंधान के दायरे से बाहर होगा।

Acknowledgements

इस काम के एएमए, पीबी जम्मू और इरास्मस, Stichting डॉ करने के लिए एक EPSRC छात्रवृत्ति के लिए वेलकम ट्रस्ट से एक परियोजना अनुदान के योगदान के साथ ए एम ए करने के लिए एक ईआरसी उन्नत अन्वेषक पुरस्कार (डीएटी, टीबी) द्वारा वित्त पोषित है। SCvdB को हेंड्रिक मुलर के Vaderlandsch Fonds और Fundatie वैन डे Vrijvrouwe वैन Renswoude ते 's-Gravenhage। हम चर्चा और रचनात्मक आलोचनाओं के लिए, जे Briscoe, एस MUNOZ-Descalzo, सी Schroeter, और टी रोड्रिगेज का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, बढ़ते मध्यम प्रोटोकॉल के लिए जोकिन डे Navascués और दोनों एके Hadjantonakis और सी Budjan उनकी प्रयोगशाला के प्रोटोकॉल को बांटने के लिए पूरे माउंट भ्रूण का धुंधला करने के लिए संबंधित। इस लेख के एक पहले संस्करण पहले से bioRxiv प्रीप्रिंट सर्वर 29 पर उपलब्ध कराया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

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References

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