Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)

1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center
Published 12/24/2015
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Immunology and Infection

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Summary

Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC) aparecen cada vez más relevante para la aplicación clínica. El uso de un sistema de co-cultivo de MSCs y leucocitos de sangre periférica pre-manchado con la succinimidil éster colorante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), se describe la evaluación in vitro de MSC sobre la proliferación de leucocitos inmunomodulación efector y subpoblaciones específicas.

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Hsu, P. J., Liu, K. J., Chao, Y. Y., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs). J. Vis. Exp. (106), e53265, doi:10.3791/53265 (2015).

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Abstract

Introduction

Células madre mesenquimatosas humanas (MSCs) son progenitores somáticas que pueden diferenciarse en los linajes mesodérmicos paraxiales de hueso, cartílago, y tejido adiposo 1-4, así como a unos pocos linajes extramesodermal 5. En primer lugar aislado de la médula ósea de adultos, estos progenitores multilinaje ahora se han encontrado en numerosos tejidos y 6-8, de forma inesperada, que se muestra a tener fuertes propiedades inmunomoduladoras que aparecen altamente susceptibles a la aplicación clínica 9-12. Mecanismos detallados implicados en los efectos inmunomoduladores activamente están siendo investigados por la aplicación efectiva de entidades patológicas específicas. Una de las formas más sencillas para evaluar la inmunomodulación es mediante la evaluación para la supresión de la proliferación de leucocitos efector 13. La mayoría de los leucocitos efectoras tales como linfocitos y monocitos T proliferan prodigiosamente cuando es estimulado o activado. La función inmunomoduladora se puede evaluar cuando la supresión de laproliferación se evidencia.

Tradicionalmente, la proliferación de leucocitos efector ha sido evaluada por detección de [3 H] timidina en el ADN. Sin embargo, este método tiene inconvenientes significativos debido a las preocupaciones de la radiación y la post-uso disposición, así como el equipo complejo sea necesario. Si bien hay ensayos no radiactivos para evaluar la proliferación celular, el éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) de ensayo tiene otras ventajas tales como permitir que para la identificación de poblaciones celulares específicas, lo cual es especialmente útil en los experimentos de co-cultivo que implican múltiples tipos de células. CFSE es un colorante fluorescente celular que puede ser evaluado mediante análisis de citometría de flujo. Como las células se dividen, la intensidad de esta etiqueta celular se reduce proporcionalmente; Esto no sólo permite la determinación de la proliferación celular en general, pero también permite la evaluación del número de divisiones celulares hasta 8 divisiones antes de la fluorescencia se vuelve difícil en Detect contra la señal de fondo. Por otra parte, la estabilidad de la CFSE fluorescente permite el seguimiento in vivo de células marcadas tales que las células pueden ser visualizadas hasta muchos meses 14.

Este ensayo también se puede variar para evaluar tipos específicos de leucocitos efectoras o la función inmunomoduladora de las poblaciones específicas de MSC inducida por leucocitos-tales inmunomoduladores como la interleucina-10 (IL-10) que produce monocitos CD14 + 15 mediante la realización de talón marcador de selección superficie magnética del poblaciones de células de interés antes o después de co-cultivo según sea apropiado. Nuestro protocolo describe el ensayo básico de la evaluación de los efectos inmunomoduladores de MSCs en los leucocitos efectoras (diagrama de flujo mostrado en la Figura 1) y una variación de este ensayo básico para la evaluación de la inducida por MSC inmunomodulación de leucocitos en alogénicas CD4 + efectoras linfocitos T (diagrama de flujo mostrado en la Figura 4).

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Protocol

El consentimiento informado del paciente aprobado por la junta de revisión institucional debe ser obtenido por el uso de las células humanas.

1. Densidad aislamiento degradado de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)

  1. Añadir 25 ml de sangre entera heparinizada en un tubo de 50 ml con una pipeta 25 ml.
    1. Diluir las células con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Añadir 15 ml de gradiente de densidad de Ficoll-Paque en un nuevo tubo de 50 ml, y mientras se inclina el tubo, muy lentamente y cuidadosamente añadir en 25 ml de la suspensión celular diluido a lo largo del gradiente de densidad de manera que no hay mezcla de la sangre entera con el gradiente de densidad, es decir., ninguna perturbación de la interfaz de gradiente de densidad de sangre.
  3. Centrifugar la suspensión de la etapa 1.2 a 400 × g durante 30 a 40 min en un rotor oscilante-cubo de temperatura controlada sin freno a 20 ° C.
    Nota: Tres capas distintas deben ser evidentes después de la centrifugación: THe plasma ser capa superior; la capa transparente de fondo es el gradiente de densidad de Ficoll-Paque; y una capa celular fina, medio estando las PBMCs
  4. Aspirar y descartar la capa superior por aspiración con una pipeta Pasteur, con cuidado de no alterar la capa de interfase de células mononucleares (es decir, linfocitos, monocitos y plaquetas).
  5. Recoger cuidadosamente esta capa de células mononucleares con una pipeta de 10 ml a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
  6. Llenar el tubo con 20 ml de PBS, se mezcla bien, y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo después de la centrifugación.
  7. Resuspender el sedimento celular en 20 ml de PBS y centrifugar a 200 × g durante 10-15 minutos a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo después de la centrifugación.
    Nota: Este paso elimina las plaquetas-que no son deseados, dentro de los PBMCs; este paso se puede repetir para asegurar la eliminación completa de las plaquetas.
  8. Si no hay selección de poblaciones específicas esdeseada, sedimento celular se resuspende en medio completo de leucocitos (suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina / estreptomicina en medio RPMI-1640) para el cultivo después de realizar un recuento de células 16 para suspender 1 ml de medio por cada 10 7 PBMC antes de proceder al siguiente paso.

2. Etiquetado magnética de leucocitos Poblaciones (vaya al paso 4 si no hay selección de poblaciones específicas es necesario)

  1. Centrifugar la suspensión de PBMC a 300 × g durante 10 min y el sobrenadante aspirado por completo.
  2. Resuspender el sedimento celular en 80 l de PBS por 10 7 células totales.
  3. Añadir 20 l de perlas magnéticas especificados (es decir, perlas magnéticas CD14 para el aislamiento de monocitos, perlas magnéticas CD4 para el aislamiento de linfocitos T) por 10 7 células totales.
  4. Mezclar bien e incubar durante 15 min a entre 2 y 8 ° C en el refrigerador.
  5. Añadir 1-2 ml de PBS por 10 7 células para lavar y centrifugara 300 × g durante 10 min.
  6. Aspirar el sobrenadante y resuspender completamente hasta 10 8 células en 500 l de PBS.

3. Selección magnética de subpoblaciones de leucocitos

Nota: Una variedad de separadores de cuentas magnéticas y las columnas están disponibles para el aislamiento de la población específica de leucocitos por marcador de superficie celular de un número de fabricantes. El aislamiento puede ser por selección positiva basada en uno o unos pocos marcadores positivos o por selección negativa después de la depleción de las poblaciones no deseados. Un enfoque general de la realización de la selección positiva utilizando un marcador (es decir, CD4 de los linfocitos T helper, o CD14 de monocitos) se describe a continuación.

  1. Preparar y separador magnético prime incluyendo la columna de separación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Aplicar tubo que contiene la muestra de PBMCs etiquetados. Proporcionar dos 15 ml tubos de centrifugación para la recogida del y unlabel marcado positivamentefracciones celulares ed, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Contar el número de células 15 y resuspender los leucocitos seleccionados positivamente (es decir, linfocitos T CD4 + CD14 + o células) en medio completo de leucocitos, utilizando 1 ml de medio por 10 7 células.

4. CFSE tinción de leucocitos para la Evaluación de la proliferación

Nota: CFSE ha sido ampliamente utilizado en las investigaciones inmunológicas, por tanto in vivo e in vitro. Nuestro protocolo ha sido optimizado para el estudio in vitro de MSC / PBMC (u otros leucocitos) interacciones. Si bien los pasos generales involucrados en la realización de marcaje in vitro CFSE son similares, puede haber diferencias en la dosis específica y el momento del protocolo 14. Esto puede ser debido a un número de factores, es decir, el tipo de célula específico utilizado, el número de células utilizadas-que probablemente puede afectar a la intensidad de la señal fluorescente CFSE.

Diluir la solución CFSE madre (10 mM) en PBS a la concentración de trabajo deseada de 10 M (solución CFSE-trabajo). Preparar 10 7 células (es decir, PBMCs o células T) para el etiquetado con la solución CFSE-trabajo.
  • Centrifugar a 300 × g durante 10 min para obtener un sedimento de células y aspirar el sobrenadante.
  • Resuspender las células suavemente en 1 ml de solución (37 ° C) CFSE-trabajo precalentado y se incuban las células durante 10 minutos a 37 ° C.
  • Para lavar el exceso de CFSE, se diluye la suspensión celular con 10 veces (en volumen) de preenfriado (4 ° C) medio RPMI que contenía 10% de FBS. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Lavar el sedimento celular de esta manera dos veces más.
  • Re-sedimentar las células por centrifugación y contar el número de células 15. Resuspender 10 7 células (ya sea PBMCs o células T) en 1 ml de medio completo de leucocitos precalentado fresco.
  • 5. Co-cultura de MSC con leucocitos y activación de los leucocitos

    1. Medio Pre-caliente MSC completa (10% de FBS (previamente probado para un crecimiento óptimo MSC), 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina / estreptomicina en medio DMEM de baja glucosa) a 37 ° C durante no más de 30 min.
    2. MSCs semilla a 50.000 células en 1 ml de medio completo MSC en placas de 24 pocillos (densidad MSC: 25.000 células / cm 2) para la fijación O / N en una incubadora a 37 °, lo que permite que las células madre para alcanzar 80% de confluencia.
    3. Medio Aspirar, y en base a los números de MSC sin semillas, añadir PBMC marcadas con CFSE (previamente marcado con consulte protocolo Paso 4 arriba) para las MSC cultivadas (sembradas el día anterior en placas de 24 pocillos) en 1 ml de medio completo de leucocitos en una 1:10 (proporción de células) Relación de co-cultivo de MSCs a PBMCs.
    4. Añadir la fitohemaglutinina mitógeno (PHA), un activador de leucocitos no específica, a una concentración final de 10 mg / ml en un volumen total de 1 ml de medio completo por pocillo de leucocitos.
      1. AlternativEly, para estimular para la activación de los linfocitos T específicamente: utilizar alfa-CD3 / 28 microperlas y añadir a la de dos células de co-cultivo para obtener una relación de linfocitos bead-a-T de 1: 1.
    5. Para el control negativo, la placa de 500.000 PBMCs / pocillo (o una población específica de leucocitos efector; densidad celular: 250.000 leucocitos / cm 2) en una placa de 24 pocillos con 1 ml de medio completo de leucocitos solamente; para el control positivo, además de chapado en el mismo número de PBMC / pocillo, añadir PHA a una concentración final de 10 mg / ml.
    6. En el tercero y quinto día del experimento de co-cultivo, evaluar la proliferación de leucocitos marcados con CFSE (colocados en tubos de fondo redondo) por análisis de citometría de flujo 17 con filtros adecuados para fluoresceína 488 nm de excitación y de emisión.
      Nota: tinción intracelular de citoquinas para el análisis de citometría de flujo también se puede realizar para estos leucocitos marcados con CFSE en este punto para evaluar los cambios en el perfil de expresión de citocinas de leucocitos como Modulated por MSC. Desde CFSE se evalúa con un apropiado filtro para fluoresceína, los anticuerpos seleccionados para evaluar diversas citoquinas necesitan ser conjugados a fluorocromos distintos de fluoresceína o espectro similar (es decir, ficoeritrina, peridinina clorofila complejo de proteína (PerCP)).

    6. Variación: Ensayo Supresión Efector Magnetic Bead-seleccionado, MSC inducida inmunomoduladora leucocitos en Activado marcadas con CFSE células T efectoras CD4 +

    1. MSC semilla a 250.000 células en 3 ml de medio completo MSC en placas de 6 pocillos (densidad MSC: 25.000 células / cm 2) para la fijación O / N en una incubadora a 37 °, lo que permite a las células madre para llegar a 80% de confluencia. Al menos 3 placas de 6 pocillos son necesarios para garantizar PBMCs-MSC cocultured suficientes para la selección sub-población.
    2. Aspirar medio, y agregue PBMCs separados según el Paso 1, pero en placas de 6 pocillos a 2,5 x 10 6 células / pocillo (densidad celular: 250 000 leukocytes / cm 2) con 3 ml de medio completo de leucocitos. Co-cultivo durante 48 a 72 horas en una incubadora a 37 °.
    3. Magnética talón seleccionar población específica de leucocitos inmunomoduladores inducidos por el MSC (es decir, células CD14 +) como por las Secciones 2-3.
      Notas: tinción intracelular de citoquinas para el análisis de citometría de flujo se pueden realizar en este punto para evaluar los cambios en el perfil de expresión de citocinas de leucocitos, es decir, la expresión de la interleucina-10-como moduladas por MSCs.
    4. Agregar CFSE marcado con células T CD4 + alogénicas generadas según las Secciones 2-4 en placas de 24 pocillos en 1 ml de leucocitos completa (densidad de células T: 250.000 células / cm 2) medio de leucocitos inducida por MSC talón-seleccionados en diversas proporciones , es decir, 1:10, 1: 5, 1: 2, y 1: 1 (una célula a otra) ratios.
    5. Para estimular las células T CD4 +, añadir alfa-CD3 / 28 microperlas conjugados para obtener una proporción de grano a célula de 1: 1.
    6. Para un control negativo, placa 500.000 células T CD4 + / pocillo en un (densidad de células T: 250.000 células / cm 2) placa de 24 pocillos con 1 ml de medio completo de leucocitos solamente; para el control positivo, además de chapado en el mismo número de células T CD4 + / pocillo, añadir alfa-CD3 / 28 microperlas conjugados para obtener una proporción de grano a célula de 1: 1.
    7. En el día 3 rd de co-cultivo, evaluar la proliferación de las células T CD4 + marcadas con CFSE (colocados en tubos de fondo redondo) por el flujo de análisis de citometría de 16 con filtros apropiados para fluoresceína 488 nm de excitación y de emisión.

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    Representative Results

    La Figura 1 indica el esquema general del experimento, y la Figura 2 muestra el aspecto de las distintas condiciones de cultivo celular como se visualizaron mediante contraste de fase invertida microscopía. MSCs son células adherentes con una fibroblástica, la morfología en forma de huso, mientras que PBMCs y leucocitos son pequeñas células no adherentes redondas. Estos dos tipos de células morfológicamente diferentes pueden verse claramente en el co-cultivo. Al final del ensayo, cuando las PBMCs (o leuckotyes) se aspiran por citometría de flujo análisis, incluso si MSCs adherentes se inadvertidamente incluidos (es decir, debido a la mala unión o desprendimiento por aspiración vigorosa), no debería haber problemas con la evaluación de la fracción / leucocitos PBMC ya que estas células podría ser etiquetado con CFSE. Cuando no hay proliferación, resultados histograma para células marcadas con CFSE se ven como un pico muy positiva y aguda; Sin embargo, cuando se ha producido la activación, proliferación será evidente que se manifiesta bY múltiples picos más pequeños con una pérdida y izquierda-desplazamiento de la intensidad de fluorescencia (Figura 3). Cuando se ha producido supresión de la proliferación, es decir., Con el co-cultivo de MSCs, las múltiples picos más pequeños disminuirá con un aumento concomitante de la intensidad de fluorescencia como se evidencia por el desplazamiento de los picos a la derecha y el aumento de la nitidez de la derecha . pico que representa la mayor parte de las células que no se dividen Figura 4 indica el esquema general de una variación del experimento: la evaluación de la supresión efectora de leucocitos inmunomoduladores inducidos-MSC sobre efectoras alogénico activado las células T CD4 +. Los resultados de tales como una variación en el experimento son similares al ensayo original, con la información adicional de la supresión dependiente de la dosis de la proliferación visto (Figura 5).

    Figura 1/> Figura 1. Diagrama de flujo para la evaluación de los efectos inmunomoduladores de células madre mesenquimales (MSC) en leucocitos efectores alogénicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2. La morfología celular de MSC, leucocitos, y co-cultivo de dos poblaciones celulares. De contraste de fase fotografías de microscopía de la cultura de una sola célula de MSC o leucocitos, y MSC-leucocitos co-cultivo. Barra de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Cifra 3. MSC efectos supresores sobre la proliferación de leucocitos. Citometría de flujo histograma de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) la proliferación de leucocitos marcada con (A), (B) de co-cultivo no estimulado solo cultivadas con MSC, (C) se cultivaron con anti-CD3 / CD28 microbead estimulación (α-CD3 / CD28) solo, (D) y con MSCs. Los porcentajes que se muestran en histogramas denotan proporción de leucocitos en proliferación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4. Diagrama de flujo para la evaluación de la inducida por MSC inmunomodulación de leucocitos en CD4 alogénico + linfocitos T efectoras.cargar / 53265 / 53265fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5. capacidad supresora de los monocitos CD14 MSC-co-cultivadas en la proliferación de linfocitos CD4. Gráfico de dispersión y flujo de citometría de histograma de la capacidad supresora de MSC-co-cultivadas monocitos CD14 + (M-CD14 +) en anti-CD3 / CD28 microperla estimuladas, marcado con CFSE efectoras CD4 + linfocitos T (S-CD4 +). Se muestra relación de co-cultivo de S-CD4 + a M-CD14 +. Linfocitos T CD4 + fueron cerrada (R1) y se evaluaron para la intensidad de CFSE. Los porcentajes que se muestran en histogramas denotan proporción de la proliferación de células T CD4 +. Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 71-7167-00 AG Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
    Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) Life Technologies V12883 Cellular label for detection of cell division
    Phytoagglutinin (PHA) Sigma L8902 Activation of human PBMCs
    Dynabeads Human T-Activator CD3/28 Life Technologies 111.32D Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
    autoMACS™ Separator Miltenyi Biotec autoMACS™ Separator Magnetic based cell separator
    autoMACS® Columns Miltenyi Biotec 130-021-101 separation columns
    CD14 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-050-201 For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
    CD4 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-045-101 For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
    RPMI 1640 Medium Life Technologies 11875 Human PBMC/leukocyte culture medium
    DMEM, Low glucose, pyruvate Life Technologies 11885 Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
    L-glutamine Life Technologies 25030-081 Supplementation for MSC complete medium
    Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
    Fetal bovine serum (FBS) 1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) 1) SH30070.03M 2) 10091-148 Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
    24-well cell culture plate Corning COR3524 Co-culture plate
    50 ml centrifuge tube Corning 430291 Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
    15 ml centrifuge tube  Corning 430766 Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
    Round-bottom tubes BD Falcon  352008 Collection of cells for flow cytometric analysis

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    References

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