Author Produced

Isolering och analysen av sammansättningen av Kutikula Lipid Polyester monomerer

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jenkin, S., Molina, I. Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers. J. Vis. Exp. (105), e53386, doi:10.3791/53386 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kärlväxter beroende av extracellulära skikt som fungerar som vattentäta barriärer mellan växtvävnader och den yttre miljön. Dessa lipofila cellväggsassocierade strukturer begränsar patogena infektioner och reglera passiv transport av gaser, vatten och lösta ämnen i och ut ur växtvävnader 1. Sådana hinder är Kutikula, en synapomorphic struktur unik för växter 2, och olika suberin innehåller diffusionsbarriärer. Nagelbanden är en oleofil skikt syntetiseras genom epidermala celler och bundet till dem via ett pektinhaltigt skikt på den extracellulära sidan av cellväggen 3-5. Det omsluter de primära flygbilder organ högre växter, fungerar som en viktig förbindelselänk mellan växtvävnader och miljö.

Inkoppling, strukturmatrisen av nagelband, och suberin är två olösliga glycerolipid polyestrar i samband med lösningsmedelsutvinnings växer 2,4. Dessa polymera lipids består av mättade och omättade fettsyraderivat och är både strukturellt och funktionellt likartade. Men de kan särskiljas genom karakteristiska skillnader i kemisk sammansättning och deponeringsplatser.

Suberin är en alifatisk polyester ligger innanför cellväggarna i vissa yttre och inre vävnader som bildar en sekundär vägg. Korkaktiga vävnader inkluderar periderms av rötter, stammar och bark, rot endodermis, fröskal skikt, och läkta sår 2. Till skillnad kutin, innehåller suberin polyestern typiskt alkoholer, mättade och mono-omättade dikarboxylsyror, och en stor andel av mycket-långkedjiga monomerer (C≥20).

Inkoppling är den vanligast förekommande lipiden polyester i kärlväxter 6, och består av glycerol och C16-C18 interesterifierade fettsyraderivat, såsom hydroxi och hydroxi-epoxi substituerade fettsyror 4. Även sammansättningen av inkopplings polymerervarierar mellan tracheophyte arter, de mest dominerande primära monomerer är 10, 16-dihydroxi 16: 0, 18-hydroxy-9,10-epoxi 18: 0 och 9,10,18-trihydroxi 18: 0 fettsyror. Intressant Arabidopsis blad och stam kutin består huvudsakligen av 18: 2 dikarboxylsyra 7,8.

Växtnagelband presenterar också en betydande variation i tjocklek, som sträcker sig från några få nanometer till flera mikrometer 9. Eftersom nagelband isolering är en mödosam och tidskrävande steg, i synnerhet för mycket tunna bladnagelband, såsom de från Arabidopsis thaliana 8 har metoder som kringgår ytterhud isolering utvecklats och validerats 7,8. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att studera monomerkompositionen av kutin i Arabidopsis thaliana blad med natriummetoxid (NaOMe) -catalyzed depolymerisation och efterföljande gaskromatografi / masspektrometri (GC / MS) analys. Detta protokoll har en robust metod för att analysera comställning av växt lipid polyestrar i hela delipiderade vävnader, och har anpassats från tidigare rapporterade protokoll 7,10,11. Hela vävnadsprover är första homogeniseras och uttömmande delipiderade, ta bort lösningsmedelsutdragbara lipider inklusive cuticular och epicuticular växer, membranlipider och triacylglyceroler. Cellvägg berikade rester sedan depolymeriseras i sina ingående metyl estermonomerer av natriummetoxid katalyserade metanolys. Fettsyrametylestrar extraheras vid surgöring, och derivatiserad för erhållande av deras motsvarande trimetylsilyl eller acetylderivat. Derivatiserade rester är mycket flyktigt, och kan elueras från en gas-kromatografikolonn vid en rimlig temperatur utan att deras strukturella konforma under GC / MS-analys.

Protocol

Obs: Detta protokoll anpassades från Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Stegen 1-5 är sammanfattade i fig 1.

1. Vävnads delipidering

Obs: Skölj alltid alla glas och mössor med kloroform, låter torka under dragskåp, innan du använder.

VARNING: Utför vävnads homogenisering och alla lösningsmedelsöverförings stegen under dragskåp; alltid bära labbrock, handskar och stänkskyddsglasögon för att undvika direktkontakt med kemikalier och för att skydda proverna från föroreningar.

  1. Värm vattenbad och värmeblock till 85 ° C.
  2. Väg upp ca 0,5 g av varje prov blad i förväg vägda 20 mm x 125 mm glasprovrör med polytetrafluoreten (PTFE) -faced skruvlock. Innehålla fyra replikat per prov.
  3. Placera 2-propanol i en Erlenmeyer-kolv (ca 125 ml, 25 ml per g av sample). Lägg 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (även känd som butylerad hydroxitoluen, BHT) till en slutkoncentration av 0,01% (vikt / volym).
    Obs: Lägg BHT från en 5% (vikt / volym) stamlösning i metanol (BHT hjälper till att minimera oxidation av omättade fettsyror).
  4. Värm 2-propanol-lösning till 85 ° C i vattenbad.
  5. Tillsätt 12 ml varm 2-propanol-lösningsmedel till varje provrör och värm i 15 minuter vid 85 ° C i värmeblock. Detta steg inaktiverar lipaser som kan frigöras från sönderdelade celler.
  6. Låt rören svalna till rumstemperatur och slipa vävnad noggrant med homogenisator tills en homogen suspension erhålls.
  7. Placera proven i en skakapparat och skaka under 1-2 timmar vid 100 rpm och rumstemperatur.
  8. Centrifugera i 10 minuter vid 800 x g och kasta supernatanten.
  9. Tillsätt en lika volym av 2-propanol och skaka i 12 timmar vid rumstemperatur.
  10. Centrifugera i 10 minuter vid 800 x g och kasta supernatanten.
  11. Lägg 12 ml CHCl 3: CH3OH (2: 1, vol / vol) till grupp (25 ml per g prov) och skaka över natten vid 100 rpm och rumstemperatur.
  12. Centrifugera i 10 minuter vid 800 x g och kasta supernatanten.
  13. Lägg 12 ml CHCI3: CH3OH (1: 2, vol / vol) till grupp och skaka över natten vid 100 rpm och rumstemperatur.
  14. Centrifugera i 10 minuter vid 800 xg och avlägsnande av lösningsmedel.
  15. Låt prover torka under dragskåp över natten vid rumstemperatur.
  16. Lufttorka återstoden och sedan placera i en vakuumexsickator över vattenfri CaCl2 eller CaSO 4 tills konstant vikt nås (3-5 dagar).

2. depolymerisation: Metanolys med natriummetoxid (Figur 2)

VARNING: Utför steg från 2,3 till 2,4, 2,7 till 2,8, 2,10 till 2,11, från 2,13 till 2,15 och 2,17 till 2,18 i dragskåp; alltid bära labbrock, handskar och stänkskyddsglasögon.

  1. Värm värmeblock till 60 ° C.
  2. Väg provrör innehållande den torra återstoden (viktigt för ytterligare beräkningar).
  3. Lägg till interna standarder för varje rör: 25 coL metyl heptadecanoate (1 mg / ml lager) och 25 pl ω-pentadecalactone (1 mg / ml lager).
  4. Lägg 0,9 ml metylacetat, 1,5 ml natriummetoxid, och 3,6 ml metanol till varje rör och locket dem. Alternativt bereds en reaktionsblandning med dessa tre reagens och tillsätt 6 ml alikvoter till varje prov.
  5. Värme prover för 2 timmar vid 60 ° C och virvelperiodiskt i 15 minuters intervall.
  6. Låt proverna svalna till rumstemperatur.
  7. Tillsätt 10 ml metylendiklorid (CH 2 Cl 2) och 1,5 ml isättika för att extrahera fettsyra-metylestrarna.
  8. Lägg saltlösning (0,5 M NaCl) för att fylla varje rör och lock.
  9. Vortex prover för 1 min och centrifugera i 10 minuter vid 800 x g.
  10. Överför den organiska fasen (lägre) för att rengöra medelstora rör (16 x 125 mm provrör med polytetrafluoretylen (PTFE) -faced skruvkork).
  11. Lägg saltlösning (0,5 M NaCl) för att fylla varje rör och lock.
  12. Vortex prover för 1 min och centrifugera i 10 minuter vid 800 x g.
  13. Ta bort vatten (övre) fasen och upprepar steg från 2,11 till 2,12.
  14. Ta bort alla vatten (övre) fasen.
  15. Tillsätt vattenfritt natriumsulfat (Na 2 SO 4) till lösningsmedlet, mössa rören, och vortexblanda i 1 min; prov kan nu lämnas till nästa dag. Vid denna tidpunkt prover kan lämnas över natten under dragskåp.
  16. Centrifugera under 2 min vid 800 xg för att kompaktera Na 2 SO 4 salt i botten.
  17. Överför den organiska fasen till en engångs röret litet glas (13 x 100 mm glasprovrör med polytetrafluoreten (PTFE) -faced skruvlock).
  18. Indunsta lösningsmedlet till torrhet under kväve och fortsätt till derivatisering steget. Om inte behandlas omedelbart, avdunstat butik prover vid -20 ° C (prov kan vara enLSO lagras innan indunstningssteget).

3. Framställning av derivat för gaskromatografi

VARNING: Utför steg 3.1.2 och 3.1.5 - 3.1.8 under ett dragskåp; alltid bära labbrock, handskar och stänkskyddsglasögon.

  1. Trimetylsilylderivat
    1. Värm värmeblock till 100 ° C.
    2. Tillsätt 100 ni pyridin och 100 ul av BSTFA (N, O-bis-trimetylsilyl-trifluoracetamid) till varje rör och locket dem.
    3. Värme proverna vid 100 ° C under 10 min.
    4. Låt proverna svalna till rumstemperatur.
    5. Indunsta proverna under kväve vid rumstemperatur. Undvik att hetta till prover, monomerer är mycket volatila på det här stadiet.
    6. Tillsätt 500 pl av 1: 1 (volym / volym) heptan: toluen.
    7. Vortex prover för 1 min och centrifugera i 2 min vid 800 x g.
    8. Lägg prover till GC flaskor och vidare till GC / MS-analys.
  2. Acetylderivat
    Obs! För acetylering, ändra steg 3.1.1-3.1.3 ovan på följande sätt (ej visad i video); steg 3.1.4-3.1.8 är desamma:
    1. Värm värmeblock till 60 ° C.
    2. Tillsätt 100 ni pyridin och 100 pl ättiksyraanhydrid (AC2O) och rören.
    3. Värme prover 1 timme vid 60 ° C.

4. GC / MS-analys

  1. Använd en HP-5 kapillärkolonn (30 mx 0,25 mm x 0,25 um filmtjocklek) eller motsvarande (dvs.., 5% difenyl, 95% dimetylpolysiloxan). Programmera GC med helium bärgasflödet inställd på 1,5 ml / min och ugnstemperaturen programmeras från 150 till 300 ° C vid 3 ° C / min.
  2. Använd delad insprutning (split 1:10) och ställ masspektrometer för att skanna läge över 40-600 amu (elektron stötjonisering).
  3. Skapa en sekvenstabell inräknat lösningsmedel (blank), WT och muterade replikat, varje användning av den angivna inkopplings analysmetoden.
  4. Last lösningsmedeloch provflaskor på karusellen, tillsätt hexan till sprutsköljningsinjektionsflaskorna i autosampler om nödvändigt, och starta sekvensen. Efter det att sekvensen är fullbordad, totala jonkromatogrammet spår är tillgängliga för samtliga prover.

5. Dataanalys

  1. Identifiera lipid polyester monomerer genom att jämföra varje topp massa spektrum publicerade masspektra eller genom att söka en kommersiell bibliotek om det finns.
  2. För varje identifierad topp i den totala jonströmmen kromatogram, använder sina respektive retentionstider för att hitta de områden på bordet resultatintegrations från GC / MS programvara (Supplemental figur 1).
  3. För varje monomer (kolumner AB), lägg till värden i området finns i integrations tabellen (Supplemental figur 1, kolumn D) till motsvarande kolumnen för varje replikera provet i Excel-tabell av monomerer (Supple File 2, pelare CF), som är ett kalkylprogram för att kvantifiera Arabidopsiskutin TMSI derivat. Använd Kompletterande fil 3 om acetylerade derivat framställs i stället.
  4. Lägg områdena för interna standarder (IS) till IS-kolonner (HK). För de monomerer som inte är derivatiserade, nämligen fettsyrametylestrar (FAME) och dikarboxylsyra dimetylestrar (DCA DMEs), använd 17: 0 FAME (IS1) såsom IS för kvantifiering (lila-skuggade celler i monomeren tabellen, Supple Filer 2/3). För hydroxylerade monomerer, inklusive primära alkoholer, ferulsyra och ω-hydroxisyror, använder 15: 0 15-hydroxy FAME (IS2) som är valet för förening kvantifiering (grön shadded celler i monomeren tabellen, Supplemental filer 2/3) .
  5. Lägg till torra löv vikt för varje replik kolumner AX-BA (Supplemental File 2) eller AQ-AT (Supplemental File 3); alternativt skanna blad att beräkna ytor och lägg området värden monomeren bordet för att uttrycka monomera laster per enhetytarea.

Representative Results

Protokollet som beskrivs i detta manuskript är inställd för att bestämma lipid polyester monomerer, minimera bidragen från icke-inkopplings lipider 10 Figur 1 visar en översikt av analysen, vilket sammantaget tar mellan 8 (dvs inkoppling eller suberin.) -. 10 dagar (från första vävnad skörd att få GC uppgifter), beroende på hur länge prover torka.

Den valda baskatalyserad metanolys (Figur 2) för att depolymerisera polyestrar tidigare validerat för Arabidopsis frön, som innehåller både inkoppling och suberin. Vävnader först homogeniseras och uttömmande delipiderade att avlägsna lösningsmedel extraherbara lipider. Återstoden Utbytet efter extraktion, i procent av initial färskvikt är vanligtvis 6% för A. thaliana Col-0 blad. Cellvägg berikade rester torkas i en vakuumexsickator och depolymeriseras i sina ingående metyl estermonomerer dåbaskatalyserad transmetylering. Två timmars inkubation valdes som den kritiska tid som krävs för korrekt depolymerisation och återvinning av lipid polyesterkomponenter. Längre inkubationstider medförde ökning av 2-hydroxisyror; dessa potentiellt härrör från membran sfingolipider 10.

Ett typiskt kromatogram om Arabidopsis vildtyp blad kutin visas i fig 3, för O -TMSi eterderivat (Figur 3A) och O-acetyl-derivat (Figur 3B). Varje topp identifierades genom jämförelse med masspektra från litteraturen 7,8 och en offentlig databas 12 Vårt video protokoll visar hur man förbereder TMSI derivat, men prover kan alternativt acetyleras att derivatisera hydroxylgrupper. Silylerade derivat är bra för identifiering eftersom de ger diagnostisk masspektra. Men acetylerade derivat är mer stabila och ett bra alternativ till Silyleringgång monomerer har identifierats 10. För att underlätta genomförandet av detta protokoll i laboratorier som bara har GC kopplat till flamjoniseringsdetektor (FID), GC / FID spår motsvarande acetylerade derivat av WT blad kutin monomerer och till en homolog serie av fettsyrametylestrar standarder visas också (Supplemental figur 4).

Denna metod är kvalitativ och detekterar kvantitativa skillnader mellan prover, därav dess värde för mutantanalys. Mängderna av enskilda monomerer bestäms med den interna standardmetoden för kvantifiering, vilket möjliggör jämförelser av monomer överflöd mellan prover. Det bör klargöras, dock att toppstorleken (totalt jon räknas) inte kan återspegla de molära förhållandena mellan monomerer i polyester. Vi är bland annat redigerbara tabeller av monomerer för att beräkna monomerer belopp i Arabidopsis blad kutin som fettsyrametylestrar och TMSI derivat (Supplemental Arkiv 1), eller ess Tyl derivat (Supple File 2) av alkoholer. Dessa tabeller kan behöva anpassas om prover extraheras från olika organ eller växtarter.

Som ett exempel, har vi analyserat Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0) vildtyp blad och två tidigare karakteriserade null-mutanten alleler av CYP86A2 / ATT1 genen att1-1 (m-1) och att1-2 (m-2 ) 13,14. Cytokrom P450 monooxygenases av CYP86A underfamiljen koda förmodade co-oxydases och delta i suberin och biosyntes inkopplings monomer. Våra resultat (Figur 4) visar betydande minskningar av massor av tre stora lipid monomerer i de muterade bladen jämfört med WT blad. I överensstämmelse med enzymets förutsagda funktion, 16: 0, 18: 2 och 18: 1 dikarboxylater specifikt påverkas ATT1 mutanter.

"Src =" / filer / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg "/>
Figur 1. Översikt av lipid polyester analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Mekanism av NaOMe-katalyserad transmetyleringsaktivitet reaktionen. De nukleofila metoxidanjoner anjoner attackera cabonyl kolet i lipid polyestrar för bildning av en instabil tetraedrisk mellanprodukt (A), som lätt dissocierar till fettsyrametylestrar och alkoxid anjoner (B). Dessa alkoxider är konjugatbaser, och reagerar med metanol, regenerering av katalytiskt aktiva metoxidanjoner anjoner och därmed upprätthålla ytterligare depolymeriseringsprodukter reaktioner (C). Om vatten är närvarande i densystem, kommer den att reagera med natriummetoxid för att bilda natriumhydroxid, en stark bas som irreversibelt hydrolyserar estrar för att producera oönskade fria fettsyror. Metylacetat tillsätts som ett co-lösningsmedel 15 för att avlägsna små mängder av natriumhydroxid i systemet (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Representant total jonkromatogram av vildtyp Arabidopsis thaliana blad inkopplings monomerer. (A) O trimetylsilyl (TMSI) eter och (B) acetat hydroxylderivat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. kutin monomerkomposition från Arabidopsis thaliana WT och två null mutanta alleler av CYP86A2-genen. (Mutant-1 = att1-1; mutant-2 = att1-2) Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet (n = 4) . Anpassad från 13, med tillstånd av © Blackwell Publishing (2007). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Kompletterande Figur 1. Peak resultat integrationsbord från GC / MS programvara. Peaks motsvarande identifierade monomerer och interna standarder identifieras genom sin retenti i tid (kolumn C) och området värden i tabellform i kolumn D. Klicka här för att ladda ned den här filen.

Figur 2
Kompletterande File 2. Tabell över Arabidopsis inkopplings monomerer (trimetylsilyleter derivat av hydroxi fettsyrametylestrar). Klicka här för att ladda ned den här filen.

Figur 3
Kompletterande fil 3. Tabell över Arabidopsis inkopplings monomerer (O-acetyl derivat av hydroxi fettsyrametylestrar).com / filer / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ned den här filen.

Figur 4
Kompletterande Figur 4. GC / FID spår av (AB) fettsyrametylester (FAME) retentionstid index standarder (toppar är märkta med varje mättad FAME kedjelängd); och (C) acetylerade A. thaliana WT blad inkopplings monomerer. Tal på topp motsvarar: 16: 0 FAME (1), ferulat (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-Dioh 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dikarboxylsyradimetylester; FAME: fettsyrametylester; IS1: intern standard 1, 17: 0 FAME; IS2: intern stAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. Klicka här för att ladda ned den här filen.

Discussion

Till skillnad från andra biopolymerer såsom DNA och proteiner, är växt lipid polyestrar inte görs från en mall. Istället deras kompositioner beror på specificiteten av de enzymer som förekommer i vävnaderna som gör dessa extracellulära polymerer. Som sådan, kemiska analyser av de ingående komponenterna är viktigt att förstå lipid polyesterkomposition.

Kemiska metoder för att klyva esterbindningar inkluderar förtvålning, hydrogenolys, syrakatalyserad transmetylering och baskatalyserad transmetyleringsaktivitet 2. Var och en av dem har sina fördelar och nackdelar. Förtvålning producerar fria fettsyror hydroxisyror som kan genomgå sekundära reaktioner. Hydrogenolys med litiumaluminiumhydrid (LiAlH4) 16 har använts för kutin analys 7. Hydrogenolys minskar funktionaliserade kol till alkoholer och de ursprungliga strukturerna måste sluta med deuteriolysis med litiumaluminiumhydrid deuteride (LiAlD 4). DeNackdelen med detta tillvägagångssätt är kravet på hög upplösning GC / MS för att jämföra graden av deuteriation av fett polyoler erhållna att göra tilldelningar av deras strukturer. Syrakatalyserad omförestring med metanolisk bortrifluorid (BF3) har ofta använts i kutin och suberin depolymerizations 8,17,18, men reagenset har en begränsad hållbarhet och kan införa artefakter på grund av sidoreaktioner 15. Metanol svavelsyra ger också metylestrar av monomererna men med större andelar av 2-hydroxifettsyror, som förmodligen inte är sant lipid polyesterkomponenter, jämfört med andra metoder 10.

Den NaOMe-katalyserad transförestring metod beskrivs i detta protokoll producerar fettsyrametylestrar som derivatiseras genom silylering av hydroxylgrupper, vilket ger karakteristiska Masspektra för identifiering, eller genom acetylering för att ge mer stabila derivat av hydroxylgrupper for kvantifiering. En nackdel med denna teknik är att hydrolys konkurrerar med omförestring när vatten är närvarande i reaktionen. Vatten reagerar med NaOMe (katalysatorn) och producerar NaOH, vilket i sin tur hydrolyserar fettsyrametylestrar för erhållande fria syror (figur 2D). Detta är en icke önskvärd sidoreaktion eftersom två toppar kommer att vara närvarande för varje fettsyra: en metylester och en TMSI esterderivat, vilket således komplicerar analysen. Med hjälp av vattenfria reagens och lägga metylacetat som ett samlösningsmedel för att konkurrera med förtvålning är således viktiga åtgärder för att förhindra hydrolys (figur 2D).

Kutin och suberin innehåller mellan 1 och 26% glycerol 4. Emellertid kommer denna monomer inte detekteras genom de experimentella förhållanden som beskrivs i detta protokoll. Glycerol är mycket hydrofila och, till skillnad från de fettsyrametylestrar monomerer, kommer att elimineras under de vattenhaltiga lösningsmedelstvättningssteg. Denna begränsning också enpplies till andra inkopplings depolymeriseringsprodukter metoder, men glycerol kan bestämmas i vattenskiktet erhölls efter transförestring med användning av en enzymatisk metod. Alternativt kan det kvantifieras med hjälp av mildare betingelser (t ex., 0,05 M NaOMe) utan ytterligare vattenuttag för att upptäcka alla monomerer, inklusive glycerol 19,20 .Även användbara för ändamålet av glycerol kvantifiering, milda förhållanden brukar ge ofullständig depolymerisation av kutin och suberin.

Om en GC kopplad till en flamjonisationsdetektor (FID) finns tillgänglig kan alla replikat analyseras i detta instrument för kvantitativa ändamål, efter toppar i ett representativt urval har identifierats av GC / MS. Alternativt kan monomerer i GC / FID spår identifieras om deras behålla index är kända. Flamjonisationsdetektorn har speciellt hög känslighet och ett brett spektrum av proportionalitet, som är kritisk för kvantifiering av större och mindre provkomponenteri enstaka körningar. Dessutom är det robust och enkel att underhålla och driva 15.

Det beskrivna protokollet möjliggör för tillförlitlig och reproducerbar isolering, identifiering och kvantifiering av växt lipid polyester monomerer, så att den kemiska karakteriseringen av mutanter som skiljer sig i kompositionen av en eller flera lipid-polyester monomerer. Proceduren är skalbar, det kan lätt anpassas för att behandla både små och stora kvantiteter av olika växtmaterial, inklusive rötter, frön, blad, stjälkar och blommor. Masspektraldata av lipid polyester monomerer från många arter har publicerats t.ex.., 21-26 och utgör värdefulla resurser för att identifiera okända monomerer vid anpassningen detta protokoll till andra vävnader och / eller arter. Denna metod är tillämplig på undersökningar av biosyntesen, reglering och distribution av lipid polyestrar i högre växter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2-propanol Fisher Scientific BPA451-4 Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate Fisher Scientific S421500
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102 Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) Sigma-Aldrich 15222 Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT) Sigma-Aldrich 101162 Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous Fisher Scientific C614-3 Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) Acros Organics 219090020 Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane) Fisher Scientific C6074 Organic solvent
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401212 Acidification agent
Helium carrier gas, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1046 Carrier gas, GC/MS
Heptane Fisher Scientific H3501 Organic solvent
Hexanes Fisher Scientific H3024 Organic solvent
Methanol Fisher Scientific A4124 Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate Sigma-Aldrich 296996 Organic solvent
Methyl heptadecanoate Sigma-Aldrich H4515 Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane) Fisher Scientific D374 Organic solvent
Nitrogen, compressed Air Liquide ALPHAGAZ1-UN1044 Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone Fluka 76530 Internal standard (1 mg/ml stock)
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 Co-solvent for derivatization
Sodium chloride Fisher Scientific BP358212 Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%) Sigma-Aldrich 156256 Nucleophile
Toluene FIsher Scientific T2904 Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX Premier Tech Horticulture Ltd Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Purdue Methods for Arabidopsis Growth. 
PermaNest Humidity Dome  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch  Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN  P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap Kimble Chase Life Science and Research Products LLC 45066A-20125
GC vial caps National Scientific C400051A
GC vial microinserts National Scientific C4011631
GC vials National Scientific C40001
Disposable pasteur pipets Fisher Scientific 1367820B
Flasks Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge Beckman Coulter
Analytic balance Fisher Scientific
Belly dancer A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column J&W Scientific, CA, USA;  30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer Thermo Scientific
Heat block Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph Thermo Scientific
Two-stage regulator Air Liquide Q1-318B-580
Vacuum desiccator Fisher Scientific
Vortex mixer Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolattukudy, P. Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science. 208, (4447), 990-1000 (1980).
  2. Kolattukudy, P. E. Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).
  3. Yeats, T. H., Rose, J. K. C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol. 163, (1), 5-20 (2013).
  4. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends Plant Sci. 13, (5), 236-246 (2008).
  5. Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 15, (3), 329-337 (2012).
  6. Heredia, A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. Biophys. Acta. 1620, (1-3), 1-7 (2003).
  7. Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component. Plant J. 40, (6), 920-930 (2004).
  8. Franke, R., et al. Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin. Phytochemistry. 66, (22), 2643-2658 (2005).
  9. Vogg, G., et al. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55, (401), 1401-1410 (2004).
  10. Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds. Phytochemistry. 67, (23), 2597-2610 (2006).
  11. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
  12. Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. LipidHome. Available from: http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html (2015).
  13. Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant J. 53, (3), 437-449 (2008).
  14. Xiao, F., et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23, (14), 2903-2913 (2004).
  15. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446 (2010).
  16. Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry. Biochemistry. 11, (10), 1885-1896 (1972).
  17. Matzke, K., Riederer, M. A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L. Planta. 185, (2), 233-245 (1991).
  18. Riederer, M., Schönherr, J. Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin. J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).
  19. Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis. Plant Physiol. 119, (3), 1137-1146 (1999).
  20. Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry. 61, (2), 205-215 (2002).
  21. Eglinton, G., Hunneman, D. H. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle. Phytochemistry. 7, (2), 313-322 (1968).
  22. Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. 9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin. Chem. Phys. Lipids. 32, (1), 13-26 (1983).
  23. Holloway, P. J. Intracuticular lipids of spinach leaves. Phytochemistry. 13, (10), 2201-2207 (1974).
  24. Holloway, P. J., Deas, A. H. B. Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins. Phytochemistry. 12, (7), 1721-1735 (1973).
  25. Holloway, P. J. The chemical constitution of plant cutins. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. Academic Press. London. 45-85 (1982).
  26. Croteau, R., Fagerson, I. S. The constituent cutin acids of cranberry cuticle. Phytochemistry. 11, (1), 353-363 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics