Tuning en Parallel Segmenteret Flow kolonne og Aktivering Multiplexed Detection

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pravadali-Cekic, S., Kocic, D., Hua, S., Jones, A., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection. J. Vis. Exp. (106), e53448, doi:10.3791/53448 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Aktive Flow Technology kolonner

Aktiv flow teknologi (AFT) kromatografisøjler blev for nylig udviklet for at overvinde ineffektivitet i separationer forbundet med flow heterogenitet 1-6 og også for at muliggøre multiplex detektion. I dette særlige kommunikation, vi detalje den operationelle proces med den parallelle segmenteret flow (PSF) søjle med multiplex detektion. De vigtigste funktionelle fordele ved PSF kolonnen er: (1) strømmen fra den radiale midterområdet af søjlelejet isoleres fra det perifere eller væg region flow, (2) mængden af ​​mobil fase, der skal behandles af en påvisning kilde reduceres, og (3) påvisning kilder kan multiplekses for at udvide prøven information uden at bibringe forsinkelser detektion tværs over hver påvisning proces eller senere nødvendiggør opsplitning af en post-søjle gennemstrømningsstrømmen 7,8. Det centrale element i udformningen af ​​PSF kolonne, der gør det muligt for endvantage af multiplex opdagelse er den hidtil ukendte udløbsfittingen og fritte montering. Figur 1 er et fotografi af AFT kolonne sammenlignet med en konventionel kolonne. Det er vigtigt at forstå, at spaltningsprocessen opnået ved anvendelse af parallelle segmenteret flow kolonner er ikke det samme som post-søjle gennemstrømningsstrømmen opdelingen. I et indlæg søjlegennemstrømning stream split hele prøven band fra den førende kant til yderpunkterne af halen stikprøven lige (dvs. aksialt), hvorved hver gennemstrømningsstrømmen er lig med hensyn til effektivitet og følsomhed; størrelsen af ​​følsomheden og dermed bliver divideret med antallet splits. I polyesterfibre, dog spaltningsprocessen prøver bandet radialt, ikke aksialt. Som sådan er de centrale port prøver toppens spids - den mest koncentrerede område af toppen. Således følsomheden her er den højeste på toppen ikke fortyndes ved diffus hale regionen. Prøven eluering fra de perifere havne ikke er så effektiv som i central zone, men da bandet samples radialt, snarere end aksialt, bredden af top er smallere end det ville være tilfældet for en sampling proces, der opdeler top i den aksiale retning, dvs., en post-søjle split. Derfor følsomheden med en koncentrationsafhængig detektor ikke reduceres.

I PSF kolonnen, udløb montering omfatter flere udgangsporte og på indersiden af ​​dette formål montering der har til huse en ringformet fritte. Den indre del af denne ringformede fritte kanaler strømmer ud af søjlen via den radiale centrale udløbsåbning, medens den ydre radiale del af outlet fritte kanaler strømmer ud af søjlen via de perifere eller vægområde udsuget porte. De indre og ydre dele af udløbet fritten er adskilt af en uigennemtrængelig barriere, der forhindrer cross flow mellem disse strømningsområder 2. Som en konsekvens af dette motiv den centrale radiale flow stream gennem søjlen seng er adskilt fra væggen region flow insIdé kolonnen. Den relative del af strømmen fra disse to regioner kan varieres til næsten enhver ønsket forhold gennem trykstyring for at optimere forskellige funktionelle aspekter af søjlen teknologi, såsom separationseffektivitet eller detektion følsomhed. I det væsentlige, dette design effektivt etablerer inden for det større format kolonnen en "virtuel" kolonnen, der har en smallere indre diameter, og dermed de kolonne fungerer som en sand væg-mindre kolonne, overvinde kolonne seng heterogenitet og væggen effekter 9,10.

De største fordele ved PSF kolonner er forbedringer i kolonne effektivitet, minimering af opløsningsmidlet behandling til påvisning kilde (r) og gør det muligt multiplex detektion. , En ekstra fordel er, at eftersom hale og fronting regioner af et band fjernes fra den samlede elueringsprofil det opløste stof ved eluering eller detektering er til stede i en højere koncentration end det ellers ville blive observeret for de samme solute injektion og koncentration belastning på en konventionel kolonne, afhængigt af segmentering forholdet anvendes. Som en konsekvens er der ofte observeres en gevinst i signalintensitet til separationer udført på PSF kolonne 2. Faktisk, hvis segmentering forhold indstilles således, at 25% af flow udgange fra hver af de fire udgangsporte, signalintensiteten, som observeres ved hjælp af Ultra Violet (UV) påvisning viser praktisk taget nøjagtig samme signalintensitet som det fremgår ved hjælp af en konventionel kolonne, hvor hele (100%) af den mobile fase analyseres 7. Endvidere finjustering af udløbet forholdet mellem de centrale og væg strømningsområder tillader kolonnen effektiviteten skal optimeres. De gevinster i kolonne effektivitet observeret ved anvendelse af AFT søjler kan ikke angives til en enkelt værdi, da disse effektivitetsgevinster en funktion af tre faktorer: (1) strømningshastigheden, (2) segmenteringen forholdet, og (3) det opløste retentionsfaktor . Ikke desto mindre, effektivitetsgevinster forhold til conventional kolonner er næsten altid overholdes, og nogle gange disse gevinster er mere end 100% i antallet af teoretiske bunde 1,2. Evnen til at tune segmenteringen forhold tillader analytiker til effektivt at skræddersy diameteren af ​​"virtuelle" kolonnen, og det er en vigtig faktor i forhold til afsløring processen. For eksempel er en virtuel 2,1 mm indvendig (id) søjle diameter etableret ud fra et fysisk 4,6 mm id kolonne, når segmentering forholdet er 21% af mobil fase eluering fra den radiale centrale udgangsport. Under disse betingelser, det virtuelle 2,1 mm id kolonne optræder med en effektivitet, der kan være mere end 70% større end den konventionelle 2,1 mm id kolonne, afhængigt af strømningshastighed, og opløst stof retentionsfaktor 10.

Den nuværende PSF kolonne design, der anvendes til påvisning multiplekset indeholder en 4-port udløbsfitting, men søjlen kan være forsynet med en 2-port endefitting også, men dette detektionsgrænser to kun to detektorer. Den grundlæggende betjening af disse kolonner er dog den samme, bortset fra at fire detektorer kan kobles samtidigt til 4-port stikkontakt PSF kolonne udvide anvendelsesområdet for multiplex detektion. Bortset fra før og efter kolonnen forbindende slange, er de eneste yderligere krav drive en PSF søjle slange, der kan tilsluttes til de perifere udløbsporte og et middel, som kan måles mængden af ​​mobil fase, der passerer gennem hvert rør, typisk enten en masse måling eller en volumetrisk måling. For at lette tuning, bør den indre diameter af alle strømudledningskanal slanger være den samme. Strømmen forholdet mellem de perifere og radiale centrale udgangsporte derefter varieres ved anvendelse af trykstyring, blot ved at ændre længden af ​​slangen er placeret på den perifere udløbsfittingen eller ledningslængden indlæg detektor på den radiale centrale udløbsåbning.

Multiplexed Detection Brug PSF kolonner

En vigtig fordel ved PSF kolonner er, at hver af de outlet udgangsporte kan tilsluttes direkte til en kildedetekte, således at multiplex detektion. I en veltilrettelagt detektionssystem en enkelt analyse med multiplex detektion kan give væsentlige oplysninger i forhold til arten af ​​de komponenter inden prøven. Vigtigt er det, kan udføres destruktive og ikke-destruktive prøvninger på præcis samme tid, uden afsløring forsinkelse. Dette giver den absolutte overdragelse af for eksempel antioxidanter ved hjælp af DPPH reagens med komponenter observeret at eluere med UV og / eller massespektrometri (MS) detektion responser 7,11. Derfor kan fire uafhængige detektorer betjenes samtidig med passende dele af flow rettet mod hver detektor via enhver af de fire udgangsporte. Da strømmen gennem disse porte kan nemt justeres mængden af ​​opløst stof nå nogen af ​​detektorerne kan tilpassesfølsomheden af ​​detektoren bestemt kilde. Det skal dog bemærkes, at den mest effektive solut migration iagttages gennem den radiale centrale udløbsåbning. Hver af de perifere porte tilbyder tilsvarende adskillelse effektivitet, som når den er indstillet til 25% gennem hver port, er kun en smule mindre effektiv end en konventionel kolonne. Som sådan er det vigtigt, at den kvantitative detektor indstilles til at analysere prøven fra den radiale centrale udgangsport.

Ved opsætning af et PSF kolonne med henblik på multiplexing afsløring er der en række overvejelser, der skal gøres for at opnå effektive og høje resultater af høj kvalitet; der er rør dimensioner for hver port, valg af hvilken port for en type detektor og justering flow.

Tube Mål for hver havn

I kromatografi spiller længden af ​​post-søjle slange en afgørende rolle i effektivitet og ydeevne adskillelsen. Stor dead-volumen som følge af langt eller bredt id slange fra kolonne udløb til detektoren vil resultere i et tab af effektivitet, opløsning og følsomhed. Således skal passende slange dimensioner udnyttes, når opsætning af PSF kolonne for at opnå den maksimale potentiale i at yde en effektiv adskillelse og samtidig skabe fordelene ved multiplexing.

Port til Detektor

Figur 2 er en illustration af et eksempel opsætning af multiplex detektion (Ultra Violet-Visible (U-Vis), massespektrometer (MS) og 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) detektion). Illustrationen viser den centrale port er knyttet til MS-detektor, mens DPPH og UV-Vis detektorer er fastgjort til de perifere havne. Da MS er den mest følsomme detektor af de tre, tilgå denne detektor blev rettet fra den centrale udløbsåbning. Som DPPH detektion er selektiv for presence af antioxidanter, og de mindst følsomme og mest tolerante over for bandet udvidelse, tilflyde denne detektor blev rettet fra en perifer havn. UV-Vis var en sekundær "generisk" detektor, så strømme til denne detektor blev rettet fra en anden perifer havn.

Justering Flow

Når den relevante slangen er fastgjort fra en havn til detektoren, kan den udstrømmende strømning fra hver af detektorerne justeres til den ønskede mængde. En enkel måde at måle mængden af ​​strøm der kommer ud fra hver detektor er at afveje mængden af ​​mobil fase, der eluerer gennem hver port over en given tidsperiode. Den procentvise flow kan således bestemmes, og strømningen forhold kan justeres ved enten kortere eller længere slangen er fastgjort til udløbet linje på detektorerne overensstemmelse hermed for at passe til kravene i detektorerne af valg. Forskellige detektorer har forskellige krav til flow, f.eks flowcellen afen fluorescensdetektor (FLD) er ikke strømningshastighed begrænset, men skal være opmærksom på at undgå over-overtryk af strømmen celle. Derfor styring af strømningen gennem FLD opnås normalt ved at justere trykfaldet over de andre detektorer og resten af ​​strømmen passerer så gennem FLD. En detektor, der er følsom over for den mængde strøm, der leveres, er MS. Generelt kan de nuværende høje ende massespektrometre let behandle omkring 1 til 1,5 ml / min på moderat vandig mobil fase. Over denne strømningshastighed kan oversvømmelse af kilden gøre MS ubrugeligt. Imidlertid er detektion følsomhed i de fleste massespektrometre nydt ved hjælp lavere flowhastigheder; dermed PSF strømdeling kapaciteter er yderst nyttig for anvendelser, der involverer MS detektion. Høj kolonne volumetriske strømningshastigheder kan udnyttes, men med lav lydstyrke belastninger transporteres til MS-detektor. Tuning af strømmen til MS-detektor, men skal ske ved at justere trykfaldet forud forMS-detektor, i stedet for post-MS. Her anvendelsen af ​​smalle borerør (0,1 mm id) er meget nyttig, da trykket kan let indstilles uden tilsætning upassende dødvolumen.

Afhængigt af typen af ​​detektoren justeringen af ​​segmentering forholdet kan gøres enten før eller efter detektoren. Hvis, ville blive målt flow procentvise en ikke-destruktiv detektor, såsom UV-Vis anvendes og tunet indlæg detektor. Hvis en enkelt destruktiv detektor anvendes i multiplex oprettet strømmen procent bestemmes ved beregning tilbage med hensyn til andre port flow procenter. Hvis et reagens fremstillet detektor anvendes, såsom DPPH •, er strømmen i procent målt efter detektoren uden tilsætning af reagens; og hvis der anvendes to eller flere destruktive detektorer, så strømningsforholdet måles pre-detektor. Detection systemer, der kan kræve yderligere instrumentering, såsom DPPH vil have ekstra system, tryk, der kan ændre strømmenprocentdel engang knyttet til påvisning systemet. Derfor bør nøje overvejes udbetales til systemtryk på en destruktiv detektor, ved justering flow procent pre-detektor. Uanset flow ratio, der er sat gennem en af ​​portene, bør kvantitative oplysninger indhentes gennem passende standardisering. Når strømnings- forhold er angivet, men de er robuste, og de ​​ændrer ikke selv under gradientelueringsbetingelser 7,

Detaljeret video-protokol, der ledsager dette manuskript er beregnet til at vise, hvordan man bruger og tune en PSF kolonne fungere i en multiplex-mode for afsløring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Denne protokol indeholder instruktioner om, hvordan du bruger en PSF kolonne på et HPLC-system kombineret med flere detektorer til multiplex detektion. Protokollen er blevet skrevet under antagelse af læseren har grundlæggende viden og erfaring inden for kromatografi og forskellige HPLC detektionsmetoder.

Advarsel: Der henvises til sikkerhedsdatabladene (MSDS) for alle materialer og reagenser før brug (dvs. sikkerhedsdatablade for methanol). Sørg for brug af alle relevante sikkerhedspraksis ved håndtering opløsningsmidler og højtryksvæskekromatografi (HPLC) elueringsmiddel. Sikre en hensigtsmæssig brug af tekniske kontroller af HPLC, analytisk balance og detektor instrumentering, og sikre anvendelsen af ​​personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel, fuld længde bukser, og lukkede toe sko).

1. Opsætning af HPLC Instrument

  1. Forbered HPLC instrumentet med ultrarent vand (fx 100% Milli-Q vand) til line A og 100% methanol i linje B som den mobile fase og rense pumperne som pr producent krav. Hvis en af ​​detektorerne anvendes, er MS, da det er her, tilsættes 0,1% myresyre til både mobile faser A og B.
  2. Opsætning af HPLC instrumentale komponenter og detektorer, som illustreret i figur 2. Dette kræver praktisk placering af detektorer i forhold til søjlen for at minimere det døde volumen mellem detektoren og kolonne. Fleksibilitet i HPLC-systemet konfiguration er ønskelig.

2. Opsætning af UV-Vis og MS Detektorer

  1. Indstil UV-Vis detektor til den ønskede bølgelængde afhængig af prøven af interesse (fx 280 nm).
  2. Sæt MS-detektor i positiv tilstand for alt Ion Count (TIC) analyse ved hjælp Fuld scanning påvisningsmetode. Også justere følgende MS-parametre i overensstemmelse hermed: fordamper temperatur 500 ° C, kapillær temperatur 350 ° C, kappe gas sæt med en hastighed på 60 enheder, ekstra gasflow40 og feje gasstrømmen på 5 enheder, og spray spænding 3,5 kV. Disse indstillinger kan justeres senere for specifikke brugerkrav afhængige på prøven, der analyseres.

3. Fremstilling af 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Radical (DPPH •) Reagent Opsætning af DPPH System Detector

  1. 25 mg af DPPH afvejes og opløses i 250 ml methanol i en målekolbe.
  2. Tilsæt 250 pi myresyre til DPPH reagens. Dæk kolben i folie for at forhindre udsættelse for lys.
  3. Sonikeres kolben med DPPH reagens i 10 min.
  4. Rense DPPH pumpen med den forberedte DPPH reagens som pr producentens krav.
  5. Opsætning af DPPH systemet ifølge figur 2 ved at fastgøre pumpen linje til indløbet af et T-stykke.
  6. Vedhæft en 100 pi reaktion spole til the udløbet af T-stykket og fastgøre den anden ende af reaktionen spolen til detektoren.
  7. Encase reaktionen spole i en kolonne varmeren og indstil kolonnen varmelegeme temperaturen til 60 ° C.
  8. Indstil DPPH UV-Vis detektor til 520 nm.

4. Opsætning af PSF Kolonne

  1. Tilslut indløb PSF kolonnen til HPLC-instrumentet.
  2. Forbind den centrale port til MS-detektor, ved hjælp af en længde på 0,13 mm id slange 15 cm.
  3. Tilslut en perifer port til UV-Vis detektor ved hjælp af en længde på 0,13 mm id slange 15 cm.
  4. Tilslut et andet perifere port til T-stykke af DPPH detektionssystemet under anvendelse af en længde på 0,13 mm id slange 15 cm.
  5. Bloker ubrugte perifere port ved hjælp af en søjle prop.
  6. Bring strømningshastigheden af HPLC-pumpe til 1 ml min-1 ved 100% line B - 100% methanol (0,1% myresyre).
  7. Ækvilibrering af kolonnen med 100% methanol mobile phase i 20 min for en 4,6 mm diameter x 250 mm længde søjle. Denne gang er skaleret til dimensionerne af andre kolonner brugeren kan anvende.

5. Tuning PSF Kolonne for Multiplexed Detection

  1. Måle massen af mindst to tomme opsamlingsbeholdere (et for porten er forbundet til UV-Vis detektor og en for DPPH detektor) ved anvendelse af en analysevægt.
  2. Saml mobil fase fra UV-Vis og DPPH havnene i to separate, præ-vejet skibe indsamling (5.1). Optag den tidsperiode til samlingen. Saml mindst 500 mg opløsningsmiddel i hvert fartøj.
  3. De opsamlingsbeholdere vejes, og at bestemme massen af ​​mobil fase. I betragtning tætheden methanol 0,791 g ml-1, bestemme mængden af mobil fase opsamlet fra hver port.
  4. Ved forskel, der er, nominel pumpe indstillede strømningshastighed minus strømningshastigheden gennem DPPH og UV-Vis detector strømningsporte, fastlægge flowet til MS-detektor. Hurtig hver strøm andel som en procentdel af det totale flow.
    Bemærk: Ideelt flow procenter er: at MS er 18% af den samlede strømningshastighed, til UV-Vis 22%, til DPPH detektoren 60%.
  5. Hvis ikke, FLOWJUSTERING procenter ved at ændre modtrykket på UV-Vis detektor. For eksempel, hvis strømmen til UV-Vis er for høj, sænke andelen ved tilsætning tilføje en sektion på 0,13 mm id slange 15 cm til udløbet af UV-Vis detektor. Gentag derefter trin 5.1 til 5.5.

6. Afsluttende Setup Betingelser

  1. Indstil strømningshastigheden af DPPH reagens pumpe til samme strømningshastighed forlader udløbsåbningen forbundet til DPPH detektoren.
    Bemærk: PSF kolonne multiplekset med UV-Vis, DPPH og MS er nu klar til analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En multiplex HPLC-analyse blev udført ved hjælp af en AFT kolonne i PSF-funktion (figur 1) og sat op som illustreret i figur 2. Denne type opsætning tillod en kop kaffe prøve, der skal analyseres samtidigt ved hjælp af UV-Vis, DPPH og MS i alt Ion Count (TIC) tilstand. Forbindelserne med kaffe prøve, svarede på DPPH kunne derefter let matches til UV-VIS og MS - TIC svar baseret på tilpasning af retentionstid som illustreret i figur 3, idet kromatogrammerne blev registreret samtidigt. Hvor en positiv respons blev set fra MS-TIC detektor blev den molekylære masse af den top registreret. Tabel 1 viser de retentionstid for DPPH toppe, og svaret af sådanne toppe i UV-Vis og / eller MS detektor, der således tilvejebragt molekylmassen. Den lethed i matchende toppe mellem forskellige afsløring processer tilladt for AFast og mere effektiv form for screening og karakterisering af en kompleks prøve, såsom kaffe.

Figur 1
Figur 1. Et billede af Active Flow Technology kolonne sammenlignet med en konventionel kolonne. AFT kolonne er udstyret med en fire-port udløbsfitting der huser den ringformede fritte muliggør peak prøvetagning på tværs af radiale tværsnit af en prøve band. Venligst klik her for en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Et eksempel illustration af en multiplekset HPLC arrangement, ved anvendelse af en søjle med PSF DPPH •, UV-VIS og MS detektorer. Hver detecto R er knyttet til en separat udgangsport. I dette tilfælde MS anvendes til kvantificering og er indstillet til at indsamle prøve fra den radiale centrale udgangsport. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. kromatogrammer af en kop kaffe prøve analyseret via en multiplex HPLC-system under anvendelse af en søjle med PSF DPPH •, UV-VIS og MS detektorer: (a) DPPH 520 nm, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Hver detektor spor er helt sammenfaldende i tid, så ingen offset justering er nødvendig for at kompensere for død tid mellem hver detektor.Arget = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

">
Kaffe DPPH Peak respons og Mass
DPPH Peak Retentionstid DPPH UV-Vis MS - TIC svar Masse
(min) Svar Svar
1 6,74 Ja Ja Ja 123,84
2 </ td> 7,54 Ja Ja Ja 125,83
3 8,94 Ja Ingen Ingen -
4 10.05 Ja Ingen Ja 135,83
5 13.15 Ja Ingen Ingen -
6 16,22 Ja Ingen Ingen -
7 18,14 Ja Ja Ja 126,82
8 19.4 Ja Ja Ja 162,81
9 20.46 Ja Ja Ja 187,89
10 24,71 Ja Ja Ja 162,81
11 26,27 Ja Ja Ja 162,8
12 26.97 Ja Ja Ja 194,87
13 31.84 Ja Ja Ja 162,8
14 32.02 Ja Ja Ja 162,78
15 32.56 Ja Ja Ja 176,82
16 33,94 Ja Ja Ja 176,83
17 41.26 Ja Ja Ingen -
18 42,72 Ja Ingen Ja 284,93
19 46.07 Ja Ja Ja 190,83
20 49,21 Ja Ja Ja 162,75

Tabel 1. Opdagede DPPH toppe reaktion på UV-Vis og MS - TIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne undersøgelse indebærer karakterisering og profilering af kaffe ved hjælp af HPLC med multiplex detektion ansætte en parallel segmenteret flow (PSF) kolonne. Multiplekset HPLC under anvendelse af PSF kolonner muliggør karakterisering og identifikation af de vigtigste kemiske enheder ved at reducere data prøvens kompleksitet samtidig opnå en større grad af molekyle-specifikke oplysninger inden for en brøkdel af den tid, det tager ved anvendelse af traditionelle multi-detektion processer. Kolonnen PSF ikke kun tillader en platform for multiplex detektion, men også kombinationen af ​​både destruktive og ikke-destruktive detektorer, uden yderligere døde volumen og slange. DPPH •, UV-VIS og MS (TIC) blev multiplekset til analyse af espressokaffe.

En 4-port PSF søjle blev anvendt til den multipleksede analyse af kaffe ved hjælp af tre forskellige detektorer. Den centrale havn PSF kolonne stikkontakten i var forbundet til MS detektor og to af de three perifere havne blev forbundet til enten en DPPH detektionssystem eller et UV-Vis detektor. Den tredje tilgængelige perifere port ikke blev brugt, og derfor blokeret med en kolonne prop, men det kunne have været brugt til opsamling af prøven, eller for en anden detektor. Tuning processen med denne multiplex oprettet var specifik for detektoren, hvor måling af segmentering flow forekom post-detektor til UV-Vis og DPPH detektionssystemer. Da MS er en destruktiv detektor, blev strømmen procent bestemt af forskel (i alt nominelt flow minus strømmen fra de andre udløbsporte).

I denne undersøgelse, kaffe analyse med DPPH reagens resulterede i 20 godt opløst toppe, hvoraf de 13 også viste en respons i UV-Vis og MS detektorer. Figur 3 sammenligner kromatogrammer af hver detektor. Der er fire regioner, der har den samme kromatogram inden for hverkromatogram, angivet med de røde bokse. I disse kasser, hvor UV-Vis og MS viste lidt reaktion på disse forbindelser, der var en stærk reaktion fra DPPH detektoren. Fire komponenter, der reagerede på DPPH reagenset blev ikke påvist enten af UV-Vis eller MS-detektorer og tre af de komponenter, der reagerede på DPPH reagenset gav ingen UV-Vis eller MS svar på alle. Den molekylære masse af de komponenter, der svarede til MS'en er angivet i tabel 1. Komponenten som eluerede ved 10 min havde en stærk DPPH respons, med intet svar fra UV-Vis detektor og kun en meget lille reaktion fra MS-detektor .

Koblingen af ​​en AFT kolonne i PSF tilstand gav mulighed for at køre flere detektorer i multiplekset modus, hvor alle detektorer uanset HPLC-detektor krav blev kørt samtidig i en enkelt injektion og separation af dette kompleks SAMPle. Den multi-port ende montering design af AFT kolonne giver den ekstra fordel af at skabe muligheder for multiplexing afsløring processer, hvilket giver detaljerede oplysninger prøve og absolut pålidelighed i tildelingen af ​​komponenter mellem hvert afsløring tilstand. Multiplex detektion med PSF kolonner forudsat en stor mængde prøve oplysninger, tre detektorer drives samtidigt i flugt tid, der kræves for en enkelt detektor. Den nøjagtige match af retentionstiden af ​​toppe inden for hver afsløring tilstand var muligt. To af detektorerne bruges var destruktive detektorer.

De multiplexing kapaciteter en PSF søjle dog begrænset af de tilgængelige HPLC instrumentale komponenter og afsløring instrumentering. Teknikken kræver flere påvisningsmetoder og de ​​nødvendige tilføjelser for hver særlige bestemmelser for påvisning, dvs., pumper, reaktionstider spoler, varmeapparater osv Den primære fordel ved multiplexing påvisning ved hjælp af en PSF kolonne er reduction i analyse med op til fire gange (hvis der anvendes 4 detektorer), hvilket minimerer prøve variabilitet mellem analyser for hver enkelt form for afsløring. Endvidere tildele de indgående forbindelser i prøven detekteres fra en detektor til en anden er langt enklere, og udsat for mindre fejl, end hvis hver detektor blev anvendt separat. Derved undgår mismatch i komponent opgaver, hvilket ofte er et problem i analyse af komplekse prøver.

Det er vigtigt at understrege, at kvantificering bør foretages på grundlag af detektoren placeret på den radiale centrale udløbsåbning siden separationseffektivitet her er den højeste dermed peak tailing virkninger er minimale og kvantificering er således den mest præcise. Strømmen segmentering har vist sig at være robust gennem analyser, men alligevel, det er god laboratoriepraksis at opretholde regelmæssig standardisering. Derfor har man i kvantitative arbejde er det vigtigt at køre standarder som passende. Hvis der anvendes rent en detektorly som et middel til at forstå prøven kompleksitet gennem visuel skildring af prøven bestanddele, kan kvantificering ikke påkrævet, som det er tilfældet her for antioxidanten afsløring respons protokol.

Vi har vist her et eksempel på tredobbelt afsløring, UV, MS og antioxidant lydhør detektion. Multiplekserede afsløring systemer, der anvender AFT søjler kan bruges i næsten enhver situation, hvor en analytikerne kræver flerdimensional prøve oplysninger og dette indebærer flere afsløring protokoller. Ved hjælp af AFT kolonner vil i høj grad forenkle og fremskynde processen med prøven karakteriseringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column Thermo Fisher Scientific Not Defined Soon to be commercialized
Methanol Any brand HPLC Grade
PEEK tubing Any brand Various lengths and i.d.
Column stoppers Any brand For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter Any brand
Analytical Scale Balance Any brand
Stop watch Any brand
Eluent collection vessels Any brand 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136, (24), 5127-5130 (2011).
  2. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
  3. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35, (3), 410-415 (2012).
  4. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
  5. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
  6. Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
  7. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
  8. Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
  9. Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
  10. Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
  11. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics